Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

Подождите немного. Документ загружается.

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 21 из 40

Характеристики обсеменения

окружающей среды микроорганизмами

Микроорганизмы распространены в природе повсеместно: в почве, во-

доемах, на различных поверхностях, в теле человека и животных. Одним из

наиболее благоприятных субстратов для развития самых разнообразных мик-

роорганизмов является почва. Из почвы микроорганизмы попадают в воздух.

В воздух и воду попадают микроорганизмы из тела человека и

животных.

Почва, вода, воздух могут служить источником микробного загрязнения пи-

щевых продуктов, лекарственного сырья и препаратов, производственных

помещений, а также источником заражения людей патогенными микроорга-

низмами. Однако определение в объектах окружающей среды патогенных

микроорганизмов затруднено, так как они пребывают там временно и содер-

жатся в небольших количествах, а методы их

выявления длительны и трудо-

емки. Поэтому для характеристики обсеменения окружающей среды микро-

организмами определяют микробное число и содержание санитарно-

показательных микроорганизмов.

Микробное число – это общее содержание микроорганизмов в единице

веса или объема исследуемого объекта (1 г почвы, 1 мл Н

О, 1 м

воздуха).

Санитарно-показательные микроорганизмы - это микроорганизмы, ко-

торые постоянно содержатся в выделениях человека и некоторых теплокров-

ных животных; не находятся в других природных резервуарах или не имеют

других естественных мест обитания; после выделения в окружающую среду

сохраняются жизнеспособными в течение сроков, близких к срокам выжива-

ния некоторых патогенных бактерий, выделяющихся

из организма теми же

путями; не могут интенсивно размножаться в окружающей среде, т. е. их ко-

личество остается постоянным определенный период времени после попада-

ния в окружающую среду, легко обнаруживаются современными микробио-

логическими методами и поддаются количественному определению; являют-

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 22 из 40

ся достаточно типичными для дифференциации от других видов и достаточ-

но стабильными по своим признакам.

Основными санитарно-показательными микроорганизмами для разных

объектов окружающей среды являются следующие: E. coli, S.faecalis - для

воды, E. сoli, S. faecalis, C. Perfringens - для почвы, S. haemolyticus, S.

viridans,

S. аureus - для воздуха, E. coli, S. faecalis, S. аureus - для предметов обихода.

Для количественной характеристики микробной загрязненности почвы,

воды

и других объектов наиболее часто употребляют показатели: коли-титр,

коли-индекс и перфрингенс-титр.

Коли-титр - это наименьшее количество исследуемого материала, в

котором обнаруживается жизнеспособная E. coli, коли-титр выражается в

миллилитрах для воды и в граммах для твердого материала.

Коли-индекс - количество клеток кишечной палочки в 1 л воды или. 1 г

почвы.

Санитарная оценка показателя: присутствие в объекте повышенного

количества бактерий группы кишечной палочки свидетельствует о неудовле-

творительном санитарном состоянии объекта.

Существует два основных, принципиально различных метода количе-

ственного учета микроорганизмов в исследуемом объекте: прямой подсчет

клеток под микроскопом (в счетных камерах, на фиксированных окрашенных

мазках, на мембранных фильтрах) и путем культивирования

на питательных

средах. На плотных средах - чашечный метод Коха, на жидких средах - метод

предельных разведений или метод титра. Методы прямого счета клеток под

микроскопом дают возможность учесть численность, микроорганизмов в

субстрате наиболее полно. Однако при этом определяются чаще всего живые

и мертвые клетки. Кроме того, одно только наблюдение микроорганизмов

под

микроскопом не позволяет судить о том, какие процессы проводят они в

данном субстрате.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 23 из 40

Методами высева на плотные и в жидкие питательные среды учитыва-

ются только жизнеспособные клетки микроорганизмов. Если хотят выделить

и учесть как можно более широкий круг микроорганизмов, населяющих дан-

ный субстрат, используют метод Коха и при этом подбирают такую по соста-

ву среду, на которой способны развиваться микроорганизмы с различными

свойствами. Но

поскольку не существует универсальных питательных сред и

условий выращивания, пригодных для всех видов микроорганизмов, метод

высева дает возможность определить наличие на субстрате только тех мик-

роорганизмов, которые способны расти на данных средах и в данных услови-

ях.

Для выявления санитарно-показательных микроорганизмов используют

элективные среды.

Количественный учет микроорганизмов путем счета

колоний

(чашечный метод Коха)

Этот метод является наиболее распространенным для определения об-

щей микробной обсемененности различных субстратов. Сущность чашечного

метода заключается в том, что производят посев определенного объема ис-

следуемого материала в чашки Петри с плотной питательной средой. При по-

следующем выращивании посева в термостате из каждой клетки в результате

размножения образуется колония; количество их подсчитывают.

В качестве питательной среды для учета бактерий применяют мясопеп-

тонный агар, для подсчета плесневых грибов и дрожжей - сусло-агар.

Работа этим методом включает три этапа: приготовление разведений,

посев на плотную питательную среду в чашки Петри и подсчет выросших

колоний.

Приготовление разведений. Количество микроорганизмов в объектах

внешней среды, как правило, велико, поэтому для получения отдельных ко-

лоний готовят ряд разведений исследуемого вещества.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 24 из 40

Разведения готовят в стерильной водопроводной воде или физиологи-

ческом растворе (0,5%-ый водный раствор NаСl), обычно пользуют десяти-

кратными последовательными разведениями (1:10, 1:100, 1:1000 т. д.).

При исследовании продукта твердой консистенции на технических ве-

сах отвесить, с помощью часового стекла и стерильного скальпеля пробу

продукта (1-10 г), перенести в стерильную ступку и растереть в однородную

массу

, добавляя стерильный кварцевый песок. Полученную навеску количе-

ственно и асептически перенести в колбу со 100 мл стерильного физиологи-

ческого раствора - получится 1-е разведение (1:100). Суспензию в колбе тща-

тельно взболтать в течение 3-5 мин, стерильной пипеткой взять 1 мл полу-

ченной суспензии и перенести в пробирку с 9 мл стерильного раствора NaCl.

Это второе разведение 1:10

. Суспензию этого разведения перемешивают с

помощью другой стерильной пипетки, вбирая и выпуская из нее полученную

взвесь. Эту процедуру повторяют 3-5 раз, что обеспечивает перемешивание

суспензий и уменьшает адсорбцию клеток на стенках пипетки. Затем этой же

пипеткой берут 1 мл этой взвеси и переносят ее во вторую пробирку - это

разведение 1:10

. Таким образом, готовят и последующие разведения.

Степень разведения исследуемого образца определяется предполагае-

мым количеством микроорганизмов в образце, и соответственно число разве-

дений тем больше, чем больше микроорганизмов в исходном субстрате (рис.

2).

Рис. 2. Схема приготовления разведений суспензии микроорганизмов и посева

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 25 из 40

Для приготовления каждого разведения обязательно используют от-

дельную пипетку. Пренебрежение этим правилом может привести к получе-

нию ошибочного результата, иногда в 1000 и более раз превышающего ис-

тинный. Ошибка связана с адсорбцией микроорганизмов на стенках пипетки,

в результате чего не все клетки удаляются из пипетки при приготовлении со-

ответствующего разведения. Часть клеток

, оставшаяся на стенках пипетки,

может затем попасть в одно из последующих разведений, что и явится при-

чиной получения завышенного результата.

Посев на агаризованные среды в чашки Петри для поверхностного

роста. В стерильные чашки Петри наливают расплавленную на кипящей во-

дяной бане агаризованную среду, по 20-30 мл в каждую. Чашки оставляет на

горизонтальной поверхности, пока не застынет агар. Затем их в большинстве

случаев выдерживают 2-3 суток при 30˚ С крышками вниз для подсыхания

поверхности среды и проверки ее стерильности. Для посева отбирают чашки,

среда в которых осталась стерильной. Когда используют элективные среды

или выделяют и учитывают микроорганизмы, требующие повышенной влаж-

ности, посев проводят сразу

же или вскоре после застывания агара.

Посев делают из определенных разведений в зависимости от предпола-

гаемого количества микроорганизмов в исследуемом субстрате. Стерильной

пипеткой наносят определенный объем (обычно 0,05, 0,1 или 0,2 мл) соответ-

ствующего разведения, предварительно тщательно перемешанного, на по-

верхность агаровой пластинки в чашке Петри. Этот объем распределяют по

поверхности среды стерильным

шпателем. Затем этим же шпателем проводят

по всей поверхности во второй чашке, куда посевной материал не вносили.

При выявлении микроорганизмов, количество которых в субстрате относи-

тельно невелико, посевной материал распределяют по поверхности среды

только в одной чашке Петри.

Из каждого разведения делают, таким образом, 4-6 параллельных высе-

вов. Для параллельных рассевов из

одного разведения можно пользоваться

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 26 из 40

одной стерильной пипеткой и одним шпателем. Для посевов из разных раз-

ведений, используют новую стерильную пипетку и новый шпатель. Чашки с

засеянными средами помещают в термостат, отрегулированный на опреде-

ленную температуру, благоприятную для развития выявляемых микроорга-

низмов, перевернув их вверх дном.

Для глубинного посева (в толще среды) используют обычно мерные ко

личества плотной среды, заготовленные в пробирках по 10-15 мл. Культуру

вносят в пробирки с расплавленным и охлажденным до 40-45° С агаром, а за-

тем заливают смесь в чашку Петри. Возможен и другой способ глубинного

посева: взвесь микроорганизмов вносят непосредственно в стерильную чаш-

ку Петри на дно, слегка приоткрыв крышку, а затем заливают

ее расплавлен-

ным и охлажденным агаром. Среду с культурой тщательно перемешивают

круговыми движениями чашки, не поднимая ее с поверхности стола. После

этого чашку оставляют на столе до застывания агара.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 27 из 40

Самостоятельная работа

Работа выполняется на двух занятиях.

Задание на первое занятие:

1. Подготовка питательных сред для количественного учета микроорганиз-

мов чашечным методом.

2. Засев питательных сред пробами почвы, воздуха, воды, смывом с рук для

определения микробного числа.

3. Оформление протокола исследования.

Методические указания

Задачи выполняются по выбору группами по 2 человека.

ЗАДАЧА 1.

Определение микробного числа почвы

Стерильную расплавленную среду МПА (для выявления бактерий) и

сусло-агар (для выявления дрожжей и плесневых грибов) разливают каждую

в 3 стерильные чашки Петри (всего 6 чашек). Навеску почвы, взятую в асеп-

тических условиях, суспендируют 2 мин в 100 мл стерильной водопроводной

воды. Дают отстояться частичкам почвы в течение 5-10 мин.

Из надосадоч-

ной жидкости отбирают 1 мл и переносят в другую пробирку, заполненную 9

мл стерильной водопроводной воды (разведение 1:10

). Встряхивают суспен-

зию, отбирают 1 мл надосадочной жидкости и переносят в третью пробирку с

9 мл воды (разведение 1:10

). Посев производят из второй или третьей про-

бирки на выбор: 0,05 мл суспензии соответствующего разведения наносят на

поверхность питательного агара в чашке Петри и размазывают стерильным

шпателем Дригальского по поверхности плотной питательной среды (МПА и

СА). Чашки переворачивают вверх дном, и чашки с МПА инкубируют при

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 28 из 40

37° С 48 ч, а с СА выдерживают при 24° С 6-7 суток. Подсчет выросших ко-

лоний проводится на следующем занятии.

ЗАДАЧА 2.

Определение микробного числа воздуха

Методы микробиологического исследования воздуха подразделяют на

седиментационные и аспирационные. Наиболее простым является седимен-

тационный метод Коха: стерильные чашки Петри с плотной питательной

средой открывают в местах отбора проб

воздуха и выдерживают в течение

определенного времени (5-30 мин), после чего закрывают и термостатируют.

По количеству выросших колоний подсчитывают микробное число воздуха,

пользуясь правилом Омелянского, в соответствии с которым считают, что на

поверхность питательной среды площадью 100 см

в течение 5 мин оседает

столько микроорганизмов, сколько их содержится в 10 л воздуха. Каждая

микробная клетка дает начало одной колонии. Зная количество выросших

колоний и время экспозиции, вычисляют количество микробов, содержащих-

ся в 1 м

(1000 л) воздуха.

Для определения микробной загрязненности воздуха расплавляют на

водяной бане стерильные среды МПА и СА и разливают каждую в 3 сте-

рильные чашки Петри (всего 6 чашек). Чашки ставят в месте отбора проб и

открывают на 5, 10 и 15 мин. Время выдержки отмечают на крышке чашки.

Затем чашки с МПА термостатируют при 37° С 48

ч, а с СА - при 24° С 6-7

суток, перевернув их вверх дном. Подсчет колоний ведут на следующем за-

нятии.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 29 из 40

ЗАДАЧА 3.

Определение микробного числа воды

Микробное число воды - это общее количество микроорганизмов, со-

держащееся в 1 мл воды. Для санитарно-микробиологического исследования

водопроводной воды пробы берут из уличных водоразборов и кранов внут-

ренних водопроводов. Краны обжигают, затем полностью открывают и спус-

кают воду 10 мин., а затем отбирают пробы воды с соблюдением

требований

асептики, не смачивая пробки, в количестве не менее 0,5 л. Если вода под-

вергалась хлорированию, то ее собирают в колбы, содержащие 2 мл 1,5%-ого

стерильного раствора тиосульфата натрия. При посеве в агаризованную сре-

ду 1 мл воды вносят в пустую стерильную чашку Петри, куда затем наливают

10-12 мл расплавленного МПА (45° С) и тщательно

перемешивают. После за-

стывания агара посевы инкубируют при 37° С 24 ч. Из одной пробы воды за-

севают 3 параллельных чашки и не только на МПА, но и на сусло-агар для

выявления роста дрожжей и грибов, в этом случае посевы инкубируют 2-З

суток при температуре 24° С.

ЗАДАЧА 4.

Определение микробной загрязненности

предметов обихода и

рук

Для анализа микробной загрязненности столов, оборудования, полоте-

нец, халатов, рук персонала используют тампонный метод. Для этого готовят

ватные тампоны, стерилизуют их, погружают в пробирки с 2 мл стерильной

воды или изотонического раствора хлорида натрия, при этом тампон не дол-

жен касаться поверхности жидкости, смачивают тампон непосредственно пе-

ред взятием проб.

Для отбора проб с плоских крупных поверхностей (столы)

используют трафареты из проволоки или жести, которые предварительно

стерилизуют фламбированием; затем накладывают их на поверхность стола,

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 30 из 40

производят смыв влажным тампоном (салфеткой) с поверхности 100 см

, ог-

раниченной трафаретом; тампон помещают в пробирку, добавляют еще 8 мл

жидкости и тщательно прополаскивают тампон (салфетку) с последующим

отжимом его.

Общую микробную загрязненность определяют, засевая 1 мл смыва, в

глубину расплавленного МПА в чашке Петри, как это описано для определе-

ния микробного числа воды. Посевы выращивают сутки при 37° С, подсчи-

тывают

количество выросших колоний и определяют общую микробную за-

грязненность данного объекта. Для выявления дрожжей и грибов делают по-

сев на сусло-агар.

Смывы с рук получают, тщательно протирая ладони, межпальцевые и

подногтевые пространства влажным стерильным тампоном на деревянной

пилочке. Тампон погружают в ту же пробирку, в которой он смачивался, до-

бавляют

еще 8 мл стерильной воды.

Смывы с поверхности предметов содержатся в 10 мл стерильной воды

(2 мл для увлажнения салфетки, 8 мл доливают к смывам), поэтому исходный

смыв уже разведен 1:10. Для приготовления разведения 1:100 1 мл исходного

смыва (1:10) помещают в пробирку и доливают к нему 9 мл стерильной во-

допроводной воды. Берут две стерильные чашки Петри, нумеруют

их со сто-

роны дна (№ 1 и 2). В первую чашку вносят 1 мл исходного разведения смы-

ва (1:10), во вторую - 1 мл разведения 1:100. Заливают в каждую чашку 15-30

мл расплавленного и охлажденного до 35° С МПА. После застывания агара

посев термостатируют при 37° С сутки. Параллельно ведут посев на 2 чашки

со стерильным СА. Этот посев выдерживают

при 24° С 4- 5 суток.

В отчете по данной работе указать классификацию и способы стерили-

зации питательных сред, этапы подготовки микробиологических материалов

для количественного учета чашечным методом, схему подготовки разведе-

нии и посева, описать конкретную задачу.