Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

Подождите немного. Документ загружается.

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 11 из 40

Жидкие среды широко применяют для выяснения физиолого-

биохимических особенностей микроорганизмов, для накопления биомассы

или продуктов обмена, а также поддержания и хранения многих микроорга-

низмов, плохо развивающихся на плотных средах. В лабораторной практике

применяют жидкие среды: МПБ, пептонная вода, сахарный бульон и др.

Плотные среды используют для выделения чистых культур (получение

изолированных

колоний) в диагностических целях (установление морфоло-

гии колоний, особенностей роста на скошенном агаре и др.), для хранения

культур, количественного учета микроорганизмов, определения их антагони-

стических свойств и в ряде других случаев. Примером плотных питательных

сред являются МПА, МПЖ, свернутый яичный белок, картофель и др.

Сыпучие среды применяют в промышленной микробиологии.

К ним

относятся, например, разваренное пшено, отруби, кварцевый песок, пропи-

танные питательным раствором.

Уплотнение сред

Для уплотнения сред применяют агар-агар, желатину и кремнекислый

гель.

Агар-агар используют особенно часто. Это сложный полисахарид, по-

лучаемый из некоторых морских водорослей. Его выпускают в виде пластин,

«стебельков» или порошка. Агар-агар удобен

тем, что большинство микроор-

ганизмов не используют его в качестве питательного субстрата. В воде агар-

агар образует гели, плавящиеся при 100°, а затвердевающие при температуре

около 40° С. Поэтому на агаризованных средах можно культивировать мик-

роорганизмы практически при любой подходящей для их роста температуре.

При остывании агар выделяет «конденсационную» воду. Чем меньше кон

центрация агара, тем больше выделяется воды.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 12 из 40

Чаще всего агар-агар добавляют к средам в количестве 2 %. Если хотят

получить более влажную среду, вносят 0,5–1,5 %, а более плотную и сухую –

3 % агар-агара.

Следует отметить, что в слабокислых, нейтральных и слабощелочных

средах агар-агар сохраняет способность образовывать гель после нескольких,

циклов плавления и затвердевания, а также после повторной стерилизации.

Однако

в кислой среде при рН ниже 5,5 агар-агар при стерилизации частично

гидролизуется и поэтому после стерилизации часто не образует гель. В этом

случае агар-агар следует стерилизовать отдельно от среды в определенном

объеме воды и добавлять в среду после стерилизации. Для этого стерильный

водный агар-агар расплавляют на водяной бане и

приливают при постоянном

перемешивании к стерильной, предварительно подогретой среде.

Желатина – это белок, получаемый путем вываривания костей и хря-

щей животных. Образуемый желатиной гель плавится при температуре 23–

36° С, которая ниже обычной температуры инкубации многих микроорга-

низмов (30–37° С). Кроме того, желатина разжижается протеолитическими

ферментами, выделяющимися некоторыми микроорганизмами в среду. Эти

свойства

желатины сильно ограничивают ее применение в качестве уплот-

няющего средства. Желатину используют главным образом для выявления

протеолитической активности микроорганизмов, а также получения «гигант-

ских» и глубинных колоний дрожжей с целью их идентификации. В первом

случае употребляют мясопептонную, а во втором - сусловую желатину.

Желатину добавляют к жидким средам в количестве 10–15 %, оставля-

ют

ее набухать 10–15 мин и нагревают на водяной бане до полного растворе-

ния. Доводят рН среды до 6,8–7,0. Все среды с желатиной стерилизуют при

0,5 атм в течение 15 мин. Повторная стерилизация желатиновых сред, осо-

бенно при рН сред ниже 6,0 или выше 7,3 не рекомендуется, так как желати-

на при этом теряет способность образовывать гель

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 13 из 40

Кремнекислый гель (силикагель) используют как твердую основу для

синтетических сред строго определенного состава, поскольку он является

веществом неорганической природы.

Методы стерилизации

Стерилизация в переводе с латинского языка означает обеспложивание.

В микробиологической практике стерилизацией называют уничтожение мик-

роорганизмов и их спор или полное удаление микроорганизмов из обрабо-

танной среды. Стерилизуют питательные среды

, посуду, инструменты и дру-

гие предметы для того, чтобы не допустить развития посторонней микрофло-

ры в исследуемом материале.

Существуют различные способы стерилизации: термическая стерили-

зация - кипячением, прокаливанием в пламени, горячим воздухом, насыщен-

ным паром под давлением (автоклавирование), текучим паром; холодная сте-

рилизация - фильтрованием, воздействием различными физическими факто-

рами (ультрафиолетовыми лучами,

ультразвуком) или химическими вещест-

вами (антисептиками).

Стерилизация лучистой энергией. Действие ультрафиолетовых лучей

находит широкое использование для стерилизации воздуха в лабораторных

помещениях, в цехах промышленных предприятий. Для обеззараживания

воздуха используют бактерицидные лампы. Ввиду возможного неблагопри-

ятного действия ультрафиолетовых лучей на организм человека бактерицид-

ные лампы включают только при отсутствии людей в

помещении.

Химический метод стерилизации применяется при дезинфекции. Де-

зинфекция - это способ уничтожения микроорганизмов при помощи сильно-

действующих химических веществ или так называемых антисептиков. Ги-

бель микроорганизмов при дезинфекции происходит в основном в результате

гидролиза компонентов клетки, коагуляции белков, инактивации клеточных

ферментов.

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 14 из 40

К группе антисептиков относятся неорганические и органические ве-

щества. Из неорганических антисептиков широко используются неорганиче-

ские кислоты, щелочи и соли (0,1–0,2%-ые растворы сулемы), хлорная из-

весть 10–20%-ый, йод; из органических веществ - этиловый и бутиловый

спирты, альдегиды, органические кислоты и растворители (3-5%-ый раствор

фенола, 0,2–0,5%-ый раствор хлорамина и 1–4%-ый раствор формалина).

лабораторной практике методы дезинфекции применяют для обезза-

раживания рабочего стола, рук, камер для посевов.

Способ стерилизации выбирают в зависимости от свойств стерилизуе-

мого объекта и цели исследования.

Стерилизация питательных сред

Стерилизация насыщенным паром под давлением (автоклавирование)

является основным методом стерилизации питательных сред. Сущность ме-

тода заключается в обработке материала паром

под давлением выше атмо-

сферного. Известно, что температура пара возрастает при повышении его

давления.

Используется дополнительное давление, при котором температура пара

возрастает соответственно до 112, 120 и 134° С. Благодаря совместному дей-

ствию высокой температуры и пара уничтожаются в сравнительно короткие

сроки как вегетативные, так и споровые формы микроорганизмов. Стерили-

зацию в условиях повышенного

давления пара проводят в специальных гер-

метически закрывающихся двустенных аппаратах - автоклавах, способных

выдерживать высокое давление (рис.1.).

Внутренняя часть автоклава - стерилизационная камера, в которую по-

мещают стерилизуемый материал, окружена водопаровой камерой, имеющей

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 15 из 40

Рис. 1. Схема автоклава:

1 - стерилизационная камера; 2 - кран для выхода воздуха; 3 - манометр;

4 - предохранительный клапан; 5 - водопаровая камера; 6 - воронка для заполнения

автоклава водой; 7 - отверстия для поступления в камеру пара; 8 - крышка автоклава;

9 - подставка для стерилизуемых материалов

кран для выхода воздуха и пара. При стерилизации в водопаровую камеру

наливают воду (лучше дистиллированную) до необходимого уровня. Внутрь

стерилизационной камеры на специальную подставку помещают стерили-

зуемый материал. Предметы следует размещать не слишком плотно, так как

пар должен свободно проходить между ними. Крышка автоклава герметиче-

ски закрывается. Автоклав включается в электрическую

сеть. Когда весь воз-

дух будет вытеснен парами воды, пар выпускают еще 15–20 мин. За давлени-

ем следят по манометру (табл. 1).

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 16 из 40

Таблица 1

Температура насыщенного пара при различных давлениях

Давление, атм Температура, °С

нормальное добавочное

1,0 - 100

1,0 0,5 112

1,0 1,0 121

1,0 1,5 128

1,0 2,0 134

Режим автоклавирования (температура и длительность стерилизации)

определяется составом питательной среды. Среды, содержащие сахар, вита-

мины (сусло пивное), некоторые белковые среды (желатиновые, молоко), ав-

токлавируют при t=112° C в течение 20–30 мин, мясопептонные среды - при

t=120° C в течение 20–30 мин.

Стерилизация текучим паром применяется для питательных сред,

свойства которых изменяются при температуре выше 100 °С. Это среды

с до-

бавлением белка, углеводов, витаминов. Сущность метода заключается в на-

гревании среды при нормальном давлении несколько раз с перерывами; в пе-

риод между прогреванием среду помещают в термостат для проращивания

спор. Стерилизуют такие среды чаще всего в парах кипящей воды – текучим

паром три раза по 30–40 мин через 24 ч, используя

автоклав с не завинченной

крышкой или специальный аппарат Коха.

Текучим паром проводят также пастеризацию и тиндализацию.

Пастеризация - неполная стерилизация производится нагреванием до

50–60° С 15–30 мин с последующим охлаждением до 10–11° С. Применяется

для инактивации вегетативных клеток микроорганизмов, бактерий в жидко-

стях, не выдерживающих высокой температуры (молоко, пиво, соки и т. п.).

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 17 из 40

Так как при пастеризации споровые формы выживают, то для того, чтобы

споры не проросли, пастеризованные продукты хранятся на холоду.

Тиндализация - вид дробной стерилизации, который применяют к объектам,

содержащим вещества, разлагающиеся и денатурирующиеся при 100° С (ви-

тамины, некоторые глазные капли, питательные среды). При этом нагревают

стерилизуемый объект на водяных банях или в

кипятильниках Коха с термо-

регулятором при 60–65° С 5 раз или при 70–80° С 3 раза по 60 мин с выдер-

живанием между стерилизациями при температуре 18–37° С 24 ч.

Кипятильник Коха представляет собой металлический цилиндр, покры-

тый теплоизоляционным материалом (асбестом, эбонитом). Внутри кипя-

тильника имеется сетчатая подставка, на которую ставят объекты для стери-

лизации. На дно

цилиндра наливают воду, так чтобы ее уровень не доходил

до подставки. Кипятильник закрывают крышкой, в которой имеется отвер-

стие для выхода пара, и нагревают с помощью электричества или газовой го-

релки.

Стерилизацию фильтрованием применяют в тех случаях, когда жидкие

питательные среды не выдерживают нагревания, в частности, растворы бел-

ков, сыворотки, некоторые

витамины, летучие вещества. Для фильтрации ис-

пользуют специальные фильтры, задерживающие микробные клетки как ме-

ханически, так и путем адсорбции клеток на фильтрующем материале. Бакте-

риальные фильтры выпускаются из различных материалов - ацетилцеллюло-

зы, асбеста и т. д. Они представляют собой диски толщиной около 0,1 мм,

диаметром 35 мм. В зависимости от размеров они

обозначаются № 1–5 (табл.

2).

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 18 из 40

Таблица 2

Обозначение фильтров

№ фильтра Средний диаметр пор, мкм

1 0,35

2 0,5

3 0,7

4 0,9

5 1,2

Как правило, бактериальные фильтры пропускают вирусы и бактерио-

фаги. Наиболее широко используют два типа фильтров: мембранные и

фильтры Зейтца. Фильтры Зейтца представляют собой плотные диски, изго-

товленные из смеси асбеста с целлюлозой.

Перед употреблением фильтрующее устройство должно быть просте-

рилизовано. Мембранные фильтры стерилизуют, поместив их в дистиллиро-

ванную воду, автоклавированием

или длительным кипячением. Держатель

стерилизуют отдельно, автоклавируя. Прибор собирают в асептических усло-

виях непосредственно перед работой. Фильтры Зейтца автоклавируют в соб-

ранном виде, предварительно завернув в бумагу.

Стерилизация стеклянной посуды и инструментов

Стеклянную посуду, вымытую, высушенную и завернутую в бумагу,

стерилизуют, в основном, горячим воздухом в сушильных шкафах при тем-

пературе

165–170° С в течение 2 ч. Посуду можно стерилизовать и в автокла-

ве. Посуду развертывают непосредственно перед употреблением.

Каждую пипетку заворачивают отдельно в длинные полоски бумаги

шириной 4–5 см. В концы пипеток, которые берут в рот, предварительно

вставляют ватные тампоны. Обмотку начинают с противоположного конца

постепенным движением бумаги по спирали и оканчивают у

конца с тампо-

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 19 из 40

ном. Бумага должна плотно охватывать пипетку. Завернутые пипетки завора-

чивают по несколько штук вместе или помещают в специальные металличе-

ские или картонные пеналы. Шпатели обертывают по отдельности аналогич-

но пипеткам, используя для обмотки полоски бумаги большей ширины.

Чашки Петри завертывают вместе по 2–4 штуки. Колбы, пробирки и

др. сосуды со средой закрывают

ватными тампонами, а сверху бумажными

салфетками.

Мелкие металлические лабораторные предметы (пинцеты, бактериоло-

гические иглы, петли и др.) во время работы можно стерилизовать прокали-

ванием в пламени горелки (фламбированием) непосредственно перед исполь-

зованием.

На пламени также кратковременно обжигают горлышки колб, проби-

рок, бутылок, ватные пробки при пересевах культур и розливе сред.

В пламе-

ни спиртовки (t=270С) погибают клетки и споры микроорганизмов. Отрабо-

танные пипетки с культурой опускают в дезинфицирующие растворы (на-

пример, в 5%-ный раствор фенола).

Самостоятельная работа

1. Познакомиться с устройствами, используемыми для стерилизации посу-

ды, сред, воздуха и т. д. (автоклав, сушильный шкаф, фильтры, бактерицид-

ные лампы).

2. Подготовить для

стерилизации чашки Петри, пипетки, шпатели.

3. Подготовить для стерилизации эрленмейеровские колбочки (емкостью

100 мл) с жидкой питательной средой; закрыть ватной пробкой, бумажной

салфеткой и завязать.

4. Подготовить для стерилизации пробирки с водопроводной водой (9 мл).

Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет микроорганизмов

ГОУ ВПО УГТУ-УПИ – 2005

Стр. 20 из 40

Занятие 6

СТАНДАРТНЫЕ КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ

МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЕСТЕСТВЕННЫХ СУБСТРАТОВ:

ПОЧВЫ, ВОДЫ, ВОЗДУХА И ДРУГИХ ОБЪЕКТОВ

Цель занятия - освоение количественного метода учета микроорганиз-

мов путем счета колоний.

Вопросы для обсуждения:

1. Существующие методы учета микроорганизмов.

2. Понятие «микробного числа».

3. Понятие «санитарно-показательные микроорганизмы».

4. Отбор пробы при исследовании обсемененности микроорганизмами по-

верхности объекта.

5. Отбор пробы при исследовании обсемененности рук.

6. Определение количества микроорганизмов в воздухе.

7. Сущность метода счета колоний; среды, применяемые в этом методе для

выращивания бактерий, дрожжей и плесеней.

8. Достоинства и недостатки метода счета колоний при оценке микробной

обсемененности объекта.

План занятия:

1. Ознакомиться с методами количественного

учета микроорганизмов, спо-

собами «взятия средней» пробы.

2. Ознакомиться с методами определения общего количества микроорга-

низмов (микробного числа) в различных объектах.

3. Самостоятельная работа: постановка задач по количественному учету

микроорганизмов в пробах почвы, воздуха, смыва с рук и поверхности рабо-

чих столов.