Мосин О.В. Фитобиотехнология и её прикладные аспекты

Подождите немного. Документ загружается.

ФИТОБИОТЕХНОЛОГИЯ и

ЕЁ ПРИКЛАДНЫЕ

АСПЕКТЫ

О.В. Мосин

Фитобиотехнология — составная часть биотехнологии,

объектами которой являются клетки и ткани растений —

фотоавтотрофных эукариот, а также биоактивные молекулы

растительного происхождения (ферменты, нуклеиновые

кислоты, стероиды и некоторые другие сложные

органические вещества).

Название фитобиотехнология слагается из четырех слов

греческого происхождения: phyton — растение, bios —

жизнь, teken — искусство, logos — наука, слово.

Следовательно, это наука об использовании растительных

объектов в технике и промышленном производстве.

На первый взгляд выращивание растений (злаковых,

лекарственных, декоративных и т. д.) в полевых условиях

подпадает под рубрику "фитобиотехнология", однако, как и

с животными, здесь отсутствуют специфические методы

промышленного культивирования цельных растений в

биореакторах. Таким образом, к фитобиотехнологическим

процессам относят те из них, которые базируются на

клеточном уровне, если даже клетки несут генетическую

информацию, воспринятую ими в результате генно-инже-

нерного эксперимента.

Клетки и ткани высших растений, выращиваемые на

питательных средах in vifro в строго контролируемых

условиях, все шире используют в фитобиотехнологии.

Общирное царство растений — потенциально

неограниченный источник клеток и тканей, которые могут

быть введены в культуру и, как следствие, существуют

неограниченные возможности для создания новых

фитобиотехнологических процессов, в которых нуждается

человечество.

В настоящее время царство растений на земном шаре

включает порядка 300 000 видов. От рационального и

бережного отношения к растениям зависит благополучное

выживание человечества на планете Земля.

Представители царства растений (Plantae)

Надцарство — Eucaryota

Царство — Plantae

Отделы: 1. Водоросли — Algae

Типы: а) Красные — Rhodophyta

б) Золотистые — Chrysophyta

в) Желтозеленые — Xanthophyta

г) Диатомовые — Bacillariophyta

д) Динофлагелляты и криптомонады — Dinophyta

е) Бурые — Phaoephyta

ж) Зеленые — Chlorophyta

з) Эвгленовые—Euglenophyta

Некоторые биологи выделяют дополнительный

(девятый) тип пиррофитовых водорослей —

Pyrrophyta.

Печеночники и мхи — Bryophyta

Папоротники, плауны и хвощи — Pteridophyta

Семенные растения — Spermatophyta

Типы: а) Голосеменные — Gymnospermае

б) Покрытосеменные (цветковые) — Angiospermae.

В таком смысле фитобиотехнология является

"палочкой-выручалочкой", способной освободить

отдельные регионы и страны от импорта и интродукции

растений, им не свойственных или совсем неспособных

культивироваться в неподходящих климатических

зонах. Это тем более резонно, когда речь идет о

растениях — продуцентах биологически-активных

соединений.

Хотя растительные клетки и ткани принадлежат к

более дифференцированным организмам в сравнении,

например, с бактериями, тем не менее они способны

культивироваться в форме неорганизованной клеточной

массы -каллуса. Каллусную ткань можно "заставить"

формировать зародышеподобные структуры, почки,

побеги, а на их основе — растения-регенераты. Все это

происходит благодаря тотипотентности растительных

клеток (от лат. totus — все, целый, potentia — сила,

потенция). Понятие "

тотипотентность

" является

клеточной характеристикой; в нем отражен потенциал

клетки воспроизводить все типы клеток, присущих

взрослому организму. Другими словами клетка обладает

способностью воспроизводить целый организм.

Если в качестве биообъекта применяют

изолированный зародыш, меристему верхушечных или

пазушных почек, то есть интегрированную систему, то

все получаемые растения-регенеранты будут полностью

соответствовать исходному растению, из которого была

взята какая-либо интегрированная система из числа

вышеназванных. Этим добиваются клонирования

интересующих настоящих растений (см. схему ниже).

В случаях применения изолированных клеток и

протопластов

удается получать измененные варианты исходной формы,

которые передают полученные новые признаки потомству.

Этим добиваются возможностей искусственного создания

новых форм растений, пригодных для выборки, или

селекции (см. рис).

В течение последних лет биотехнологам удалось

массовое размножение культивируемых растений с

уникальными характеристиками, а выращивание

растительных клеток стало основой для получения многих

природных веществ, образуемых различными растениями в

качестве продуктов вторичного обмена (гликозиды,

алкалоиды и другие вещества).

Таким образом, клеточная и молекулярная биология

растений составляет основу фитобиотохнологии, а главными

направлениями стали создание новых форм полезных

растений для сельского и лесного хозяйства, а также

разработка промышленного производства химических

веществ из растений.

В сравнении с микробной биотехнологией

фитобиотехнология является совсем молодой научной

дисциплиной, становление которой на промышленные

рельсы происходит в настоящее время.

Рассмотрим ниже некоторые методы фитобиотехнологии,

первый из которых наиболее важный -вегетативное размножение

растений методом культур тканей. Метод культур тканей, или

микроразмножение in vitro исключительно удобен для

быстрого размножения и сохранения здоровых растений. Для

этого производят отбор соответствующих эксплантов,

подвергают стерилизации с последующим переносом на

подходящую питательную среду. Качество эксплантов зависит

от вида и фазы развития растения; органа, из которого взят

эксплант; сезона года.

Установлено, что меристемные ткани, сердцевина луковиц,

клубнелуковиц и корневищ, надежно защищенные листьями и

чешуйками, являются стерильными. Перед удалением

покрывающих структур их каждый раз протирают 70%

этанолом. Открытые органы — источники эксплантов

подвергают стерилизации ртуть- или хлор содержащими

агентами.

Самая длительная стерилизация по времени не превышает

40 минут, в других случаях время заметно меньше. В

усредненном варианте и применительно к различным

культурам растительных тканей, наряду с этанолом (70-95%),

рекомендуют еще серебра нитрат (1%), бензалконий хлорид (0,01

—0,1%) с длительностью экспозиции 0,1—5; 5—30 и 5—20

минут соответственно.

Экспланты (за исключением материала из надземных

частей растений) целесообразно промывать в растворах

неионогенных ПАВ перед обработкой дезинфектантом.

После этого ткань тщательно промывают водопроводной

водой в течение 10—30 минут, а затем погружают в раствор

дезинфектанта и нерезко взбалтывают в течение отведенного

времени. После стерилизации растительный биообъект

трижды промывают свежими порциями стерильной

дистиллированной воды.

Стерилизующий эффект можно повысить следующими

процедурами: проведением стерилизации под вакуумом для

удаления пузырьков воздуха; помещением материала в 70%

этанол до того, как обработать раствором другого

дезинфектанта; использованием таких увлажняющих агентов

как ТЕИН 80 или твин 20 в виде добавок к растворам

дезинфектантов для снижения поверхностного натяжения и

обеспечения более полного контакта дезинфектанта с

материалом.

В последние годы все чаще применяют специальные

емкости для изоляции в асептических условиях органов из

молодых растений. Фирма Sigma (США) к 1990 г. ввела новые

мембранные наборы для культур растительных тканей. Их

изготавливают из микропористой полипропиленовой

мембраны, обработанной специальным ПАВ для улучшения

прохождения питательных веществ. Мембранные наборы

могут быть использованы при культивировании протопластов,

в соматическом эмбриогенезе, при получении культур цветов

и в других направлениях.

С применением мембран существенно ускоряется рост в

сравнении с агаризованной средой, лучше удается

освобождать культуры от ингибирующего влияния

фенольных веществ, выделяющихся в среду, а также

предохранять клеточную линию от существенных

повреждений при изучении метаболитов, продуцируемых

культурами, и др. Таким путем удается уменьшить расход

материалов и, как следствие, снизить цены, поскольку

культуры могут поддерживаться в течение длительного

времени без замены кулътуральных контейнеров. Ингредиенты

(продукты) для культивирования растительных тканей

должны производиться в соответствии с требованиями

GMP. Этим гарантируется их высокое качество.

Пригодность ингредиентов сред, обеспечивающих рост

тканевых культур, оценивают, как минимум, на трех

клеточных линиях в 1—3-х пассажах. Избранные основные

среды дополняют углеводами, витаминами, регуляторами

роста (в зависимости от используемой клеточной линии).

Питательные среды стерилизуют обычно в автоклавах. В

принципе желательна стерилизация автоклавированием

небольших объемов питательных сред, поскольку многие

ингредиенты разрушаются при более продолжительном

нагревании и давлении. Установлено, что температура выше

С может быть причиной нарушения качества сред, и, как

следствие, плохого роста культур.

Некоторые ингредиенты в растворенном виде

стерилизуют фильтрованием (через фильтры с порами 0,22

мкм в диаметре) и в виде стерильных растворов вносят в

приготовленные среды перед их использованием. Питательные

среды по своему составу достаточно разнообразны, однако в

какой-то мере они и однообразны. В частности, их

компоненты можно подразделить на 3 группы: источники

органического углерода (чаще — сахароза), неорганические

соли (включая источники азота) и стимуляторы роста. К числу

последних относятся некоторые витамины комплекса В и

растительные гормоны — цитокинины и ауксины. Почти

универсальной средой для клеток различных видов является

среда MS Т. Мурасиге и Ф. Скуга. Тем не менее, при работе с

разными растительными объектами необходим специальный

подбор ингредиентов сред для достижения поставленных

целей. Питательные среды могут быть плотными за счет

внесения 0,7—1% агар-агара и жидкими. Показано, например,

что для микрокультуры ананасов предпочтительнее жидкие

среды.

Микроразмножение in vitro можно осуществлять из

существующих в растении тканей меристемного типа

(зародыш, верхушка основного побега) или позже

образующиеся пазушные побеги, равно как и из

дополнительных меристематических тканей (точки роста,

эмбриоиды) изолированных органов растений, где они

формируются непосредственно в родительской ткани; из

промежуточного каллуса или клеток суспензионных культур.

Если в качестве источника углерода используют в

питательных средах сахарозу, то фотосинтез не нужен

культуре, однако для морфогенеза и биосинтеза хлорофилла

применяют люминесцентные лампы с интенсивностью

освещения 1000—5000 люкс.

Важную роль играют регуляторы роста растений — ауксины

и цитокины (растительные гормоны, или фитогормоны).

Первые усиливают или поддерживают рост каллусов и

корнеобразование in vitro; вторые стимулируют образование

почек. Их используют в малых концентрациях, добавляя в

стерильном виде к готовым питательным средам.

Ауксинами являются: 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота,

р-хлорфеноксиуксусная кислота, индол-3-уксусная кислота,

индрл-3-ацетил-Ь-аланин, индол-3-ацетил-аспарагиновая

кислота, индол-3-ацетил-L-фенилаланин, индол-3-ацетилглицин,

индол-3-масляная кислота и ее калиевая соль, а-

нафталинуксусная кислота. Среди цитокининов известны:

аденин, 6-бензиламинопурин, 1-бензил-9-(2-

тетрагидропиранил)-аденин, 6-у-у-диметилаллиламинопурин,

1,3-дифенилмочевина, кинетин, зеатин и некоторые другие.

Смешанными функциями обладают абсцизовая, коричная и

гибберелловая кислоты, флороглюцинол; 2,2-диметилгидразид

янтарной кислоты.

В целях предотвращения возможного бактериального и

грибного загрязнения к ним добавляют такие антибиотики, как

полиены (амфотерицин В, нистатин), карбенициллин,

цефалоспорин и его производные, левомицетин,

аминогликозиды (гентамицин сульфат, канамицин

моносульфат), рифампицин и др. Большинство антибиотиков

неустойчиво при нагревании, поэтому их растворы стери-

лизуют фильтрацией через мембраны.

Для растений характерно так называемое апикальное

доминирование, при котором за счет регулирующего действия

фитогор-монов верхушечная почка развивается быстрее, чем

пазушные почки. Если культивировать кончик побега без

фитогормонов, то развивается одиночный проросток со строго

апикальным доминированием. Если же в среду внести

цитокинин и засеять пазушные побеги, то они вырастают

недоразвитыми, но с появлением пучка ростков, состоящего из

второго, третьего и более порядков, которые можно разделить

на составляющие и вновь выращивать на свежей среде до

получения пучков таких побегов. Этот процесс можно вести до

бесконечности, получая быстро или относительно быстро

размножающиеся побеги желаемых растений.

Б большинстве случаев верхушечные (длиной 1—5 мм) и

пазушные побеги заражены растительными вирусами, поэтому

прибегают к использованию так называемой культуры

верхушечных меристематических тканей, когда отрезают лишь

0,3—0,5 мм верхушки, содержащей меристему и 1—2

листовых примордия с последующей выдержкой при 30—

40°С в течение 1,5—3 месяцев. Этот метод удачно

использован и используется для оздоровления хозяйственно

ценных растений.

С помощью метода культур тканей удалось значительно

повысить коэффициент размножения многих садовых

древесных (яблони) и травянистых декоративных растений

(ирис, нарцисс, петуния, фиалка и др.), пользуясь

придаточными побегами, а также каллусами, индуцированными

фитогормонами и дающими побеги или эмбриоиды.

Доступными для производства стали клетки барбариса —

продуцента спазмолитика ятроризина, табака — продуцента

убихинона-10.

Некоторые каллусы стабильно продуцируют растения —

регенеранты в течение 10 лет (табак, хризантемы и др.),

оставаясь при этом смесью нерегулярно

дифференцированных клеток, среди которых постоянно

содержатся диплоидные меристематические клетки, дающие

стеблевые апексы или зародыши.

Перед высадкой проростков в грунт прибегают к

стимуляции корнеобразования с помощью индолилмаслян.ой

кислоты (-0,5—10 мг/л)

Фитобиотехнологи, занимающиеся микроклональным

размножением растений, должны быть хорошо

подготовленными в области биологии растений, с которыми

приходится иметь дело, а также в области микробиологической

техники работы. Лишь благодаря заинтересованности и

профессиональному подходу к выполнению задания

обеспечивается высокое качество конечного продукта

(материала). Тем не менее необходимо помнить о трудностях,

возникающих при микрокультивировании. К ним относятся:

инфицирование растительных тканей вирусами и

фитопатогеннымй бактериями (например, Erwinia carotowora),

бактериальные и грибковые контаминации, ингибирование

тканей фенольными и другими, например, летучими,

соединениями, возрастание числа мутаций, и пр.

И все же микрокультивирование исключительно

заманчиво не только на пути создания большого количества

безвирусного'материала, но и массовости получения образцов

в относительно короткие сроки (несколько тысяч в течение

месяцев).

Микрокультивирование in vitro обеспечивает быстрое

вегетативное размножение не только травянистых, но и

древесных растений, также прибегая при этом к культуре

побегов (например, для декоративных, лесных, плодовых и

других деревьев) или каллусным культурам (гвинейская

масличная пальма, цитрусовые и др.). Здесь важное значение

имеет состояние ювенильности (от англ, juvenile — юношеский,

юный), которое обычно растягивается на несколько лет и

характеризуется сравнительной легкостью вегетативного

размножения.

Для древесных растений известно также явление

реювенильности, когда некоторые ткани взрослого растения

проявляют свойства проростков, например, формируют

придаточные корни. Реювенилизированные ткани все

больше используются на практике для размножения

отдельных покрытосеменных (например, эвкалиптов) и

голосеменных деревьев (разные виды сосны). Ускорение

реювенилизации может происходить под влиянием

отдельных фенольных соединений (флороглюцин, квер-

цетин, рутин), памятуя о том, что изменение уровня

эндогенных фенольных соединений является составной

частью регуляторных процессов, индуцируемых

цитокининами.

Каллусные культуры древесных растений также

перспективны как и каллусные культуры травянистых

растений. Показателен пример с гвинейской масличной

пальмой (Elaeis guineensis) — источником получения масла

для населения Юго-Восточной Азии, Америки, Африки. К

тому же эта пальма не размножается вегетативно. Генетико-

селекционная работа по выведению более урожайных

сортов на основании полового размножения занимает 15—

20 лет. Вот почему получение каллусов, а затем —

эмбриоидов и регенерантов масличной пальмы оказалось

экономически выгод

ным делом. Обычно за 3 месяца

удается выращивать из эмбриоидов побеги длиной 12 см

(см. рисунок).

Процесс клонирования гвинейской масличной пальмы: 1 — верху-

шечные молодые листья (посевной материал), 2—5 — сменяемые

питательные среды, в которых развиваются каллусы,

эволюционирующие в эмбриоиды (4) и затем — в молодые растеньица

(5), 6 — образование корней при очередном переносе растения на

свежую питательную среду, из которой их пересаживают в грунт.

Учитывая тот факт, что в 1 см

каллусной культуры

содержится до 1 млн, клеток, каждая из которых

способна трансформироваться в новое растение,

становятся понятными все преимущества метода

стерильного вегетативного размножения растений в

лабораторных условиях на средах с фитогормонами при

последующей пересадке их в почву. Отбирая нужные

клетки, можно вывести новые сорта растений,

удовлетворяющие запросы по одному или ряду показа-

телей (устойчивость к микробным заболеваниям,

урожайность, особая окраска цветов, повышенная

продуктивность вторичных метаболитов и т. д.).

Для развития и формирования каллусных культур

значительна роль не только фитогормонов, но и так

называемыхэлиситоров (от англ, elect — выбирать) —

БАБ, дерепрессирующих гены, и, как следствие,

активирующих клеточные деления, сравнительно

быструю дедиффереицировку специализированных

клеток, сопровождающуюся активацией белкового

синтеза. Полагают, что элиситорами являются

углеводные молекулы, происходящие из гид-

ролизованных гликанов клеточных стенок. Не

исключена возможность экзогенного происхождения

элиситоров, например, от микроорганизмов.

В случае выращивания клеток растений в

глубинных (погруженных) условиях необходимо иметь

такие их линии, которые о т в е ч а л и б ы

с л е д у ю щ и м т р е б о в а н и я м : с к л о н н о с т ь к

р а з м н о ж е н и ю в д е з а г р е г и р о в а н н о м

с о с т о я н и и , м о р ф о л о г и ч е с к а я

в ы р а в н е н н о с т ь и с о х р а н н о с т ь п у т е й

м е т а б о л и з м а

. Такие клеточные линии уподобляются

одноклеточным микроорганизмам и могут называться

"суспензионными культурами" в случае их выращивания в

жидких питательных средах. Состав и реологические

характеристики сред являются основными факторами,

определяющими нахождение одиночных или

аггломерирующихся (агрегирующихся) клеток во

взвешенном состоянии. Если число клеток в аггломератах

превышает 50, то они могут выпасть (или выпадают) в

осадок. Желательно, чтобы в процессе размножения клетки

дольше оставались в разобщенном состоянии, тогда

поддержание суспензионной культуры в течение

необходимого времени оказывается вполне достижимым.

Что касается морфологической "выравненности" клеток,

то при этом имеют в виду их округлую (или сферическую)

форму, уплотненную цитоплазму, сравнительно небольшие

размеры (в среднем, от 10 до 50 мкм) и отсутствие

трахеидоподобных элементов. Одиночные растительные

клетки в таких случаях напоминают одноклеточные

эукариотические микроорганизмы; их ростовые

характеристики (фазы размножения) в некотором

приближении также оказываются совпадающими (lag-фаза,

log-фаза, const-фаза, let-фаза), хотя временные интервалы

между фазами более растянуты для клеток растений.

Скорость размножения растительных клеток невелика —

время удвоения их числа равно 1-—3 суткам и поэтому по

данному показателю они существенно уступают, например,

бактериальным и дрожжевым клеткам, время удвоения

которых в глубинных условиях укладывается для

большинства видов в 20—30 минут. Однако, переводя

культуру растительных клеток на хемостатное"

(непрерывное) выращивание, можно добиться их высокой

продуктивности по биомассе или по вторичным

метаболитам (пример с Nicotiana tabacum).

Исходные клеточные суспензии обычно получают из

рыхлых, оводненных каллусных тканей (2—3 г на 60—100

мл питательной среды), подвергнутых обработке пектиназой

и полигалактуроназой, и помещаемых в жидкую

питательную среду, лишенную ионов кальция, но

содержащую ауксин — 2,4-дихлорфеноксиуксусную

кислоту. Условия выращивания поддерживают либо в

периодическом, либо в непрерывном режиме, специально

подобранном для конкретного биообъекта. В других случаях

источниками суспензионных культур могут быть

протопласты с реконструированными клеточными стенками.

.Стимулировать деления отдельных клеток изолированных

протопластов можно с помощью обогащенных

питательных сред или использованием гомологичной ткани

— "няньки" ("кормящий слой"), находящейся в состоянии

активного роста (рисунок). Колонии из отдельных клеток

(клоны) могут быть субкулътивированы один или более раз

(при необходимости), а затем переведены в суспензионные

культуры.

Рис. Использование ткани-"няньки" (суспензионная культура) при

выращивании колоний из одиночных клеток кукурузы или протопластов

(схема): 1 —качалочная колба, 2 — колония, возникшая из отдельной

клетки, 3 — фильтровальная бумага, 4 — металлическая сетка, 5 —

суспензия клеток "кормящего слоя", б — подложка (пенополиуретан), 7 —

питательная среда.

Важно также сохранить присущие клеткам

метаболические пути при их выращивании в

суспензионных культурах. Более того, регулируя обмен,

можно добиваться заметного повышения выхода целевых

продуктов. При этом всегда необходимо учитывать тип

дифференцировки, или состояния специализации исходных

клеток, так как от него зависит видоспецифичность

первичного и вторичного метаболизма.

Суспензионные культуры обычно выращивают в

подходящих емкостях роллерного типа после фильтрации

первичной суспензии через стерильные металлические,

нейлоновые или марлевые сита для освобождения от

крупных аггломератов клеток.

К сожалению, выращивание растительных клеток в

"погруженных" условиях пока удается в редких случаях, что

обусловлено недостаточной глубиной познания всех

особенностей обмена веществ у различных видов и их

клеточных культур; определенные помехи здесь связаны и с

медленным ростом клеток в строго асептических условиях,

их чувствительностью к механическим повреждениям и

другими причинами.

В начале 80-х годов в компании Mitsui-Petrocheniical

Industries осуществлен первый крупномасштабный процесс

по выращиванию растения воробейника (Lithospermum

erythrorhizon) в погруженных условиях в целях получения

вторичного метаболита — шиконина, являющегося ценным

фармацевтическим препаратом и красителем (рисунок). За

один периодический процесс удается получать порядка 5 кг

коночного продукта, накапливающегося в клетках. На первой

стадии клетки воробейника выращивают на среде (с подачей

стерильного воздуха) в 200-литровом биореакторе в течение

9 суток; затем культуру переносят в биореактор меньшего

размера со средой М-9, стимулирующей продукцию

шиконина, и, наконец, в третьем реакторе на 750 л

ферментацию ведут в течение 2 недель. Клетки на первой

стадии белые, на последней — красные (накоплен шиконин).

Стоимость красителя в 1983г. составляла 4000 долларов за

килограмм.

Схема культивирования воробейника в целях получения шиконина (1

— биореактор, 2 — подача стерильного воздуха, 3 —мешалка, 4 —

питательная среда, 5 — выпуск отработанного воздуха, 6 — перенос сре-

ды в малый реактор, 7 — фильтрат, 8 — красные клетки, содержащие

шиконин).

Не стоит забывать также, что растения — как

многоклеточные организмы с огромной емкостью геномов, с

половым путем размножения и многоступенчатыми

программами развития — являются более сложными

объектами для генноинженерных экспериментов, чем,

например, вирусы, бактерии и дрожжи. Тем не менее, уже

теперь достигнуты определенные успехи с растительными

объектами и по прогнозам ученых США к 2010 году

ожидается прирост урожайности сельскохозяйственных

культур примерно на 60-70% по сравнению с началом 80-х

годов текущего столетия в основном на основе

использования методов генетической инженерии, когда стал

возможным перенос отдельных генов от одного растения

другому (в противоположность естественному половому

процессу, при котором происходит замена целых блоков

сцепленных генов).

Теперь расскажем как сделать генно-инженерные

растения. В генноинженерном эксперименте необходимо

изолировать конкретный ген, включить его в

наследственный аппарат растительной клетки и

регенерировать фертильное растение (способное к

размножению) с измененным наследственным признаком. В

народнохозяйственном аспекте важными признаками

являются: высокая урожайность (или продуктивность),

скороспелость, устойчивость к различного рода заболе-

ваниям, засухе, к гербицидам и пестицидам, неполегаемость

и др. К сожалению каждый из названных признаков

контролируется, как правило, группой генов, что заметно

усложняет проблему клонирования соответствующих генов.

Однако, природа с давних пор "доказывает" нам, что

генетическая инженерия также подвластна и ей. Примером

тому служит инфекционная злокачественная болезнь

(корончатые галлы) многих двудольных растений,

вызываемая почвенной агробактсрией — Agrobacterium

tumefaciens.Ta-кие однодольные растения, как пшеница,

кукуруза, овес, рис, рожь, сахарный тростник, естественно

устойчивы к заражению агробактериями.

В 1971 г. Р. Гамильтон и М. Фолл (США) пришли к

выводу о том, что опухоль у растений индуцируется

нуклеиновой кислотой. В 1974 г. Н. Ван Ларобеке, П. Энглер

и др. (Бельгия) установили, что способность A.turnefacions

вызывать образование корончатого галла с большими по

размерам плазмидами (в длину 50—80 мкм в разомкнутом

состоянии и с ММ 112—156 МДа — мегадальтон),

названными Ti- п л а з м и д а м и (от англ, tumor inducing —

вызывающий опухоль). Обычно они в клетке содержатся в 1

—2 копиях и составляют примерно 4% ДНК от

бактериального генома.

Однажды наведенный Ti-плазмидой опухолевый рост у

растения не нуждается в ее дальнейшем присутствии для

поддержания злокачественной пролиферации.

Следовательно, выращивание и поддержание опухолевых

клеток возможно в стерильной культуре (без агробактерий и

без Ti-плазмиды), и, как установлено, без ауксинов и

цитокининов, то есть без фитогормонов. При этом они

образуют опины, отсутствующие у растений в нормальных

условиях, и по которым можно определять опухолевую

клетку. В зависимости от клеток корончатого галла могут

образовываться агропин, нопалин или октопин. Поэтому и

говорят соответственно: клетки агропинового, нопалинового

или октопинового типа.

Фактическая ненужность Ti-плазмиды после индукции

опухоли у растения связана с тем, что стерильные

опухолевые клетки в своих хромосомах содержат

ковалентно связанную часть этой плазмиды (около 10%),

получившей название Т-ДНК (от англ, transferred —

перенесенный), а применительно к клеткам

A.tumefaciens с Ti-плазмидой — Т-участок бактерии. Т-ДНК