Мосин О.В. Фитобиотехнология и её прикладные аспекты

Подождите немного. Документ загружается.

содержится исключительно в ядре клеток корончатого галла.

Таким образом, на примере Ti-плазмиды виден перенос

генов от прокариот к эукариотическим растениям в природных

условиях (рисунок). Транскрипты интегрированной Т-ДНК в

виде мРНК поступают из ядра в цитоплазму клетки, где

включаются в реакции синтеза специфических белков на

полирибосомах: ядерная ДНК-Т-ДНК -транскрипты -мРНК

-полирибосома (трансляция) - белки — синтез опинов (гормон-

независимый рост).

Схема переноса Т-ДНК из агробактерии в растение с

последующим формированием корончатого галла (\ —

бактериальная хромосома, 2 — Т-ДНК, 3 — Ti-плазмида, 4 — ядро

растительной клетки, 5 — встроенная Т-ДНК, б —' корончатый

галл); Б. Т-ДНК в Ti-плазмиде октопинового типа (продукты генов

1 и 2 ингибируют транскрипты побеги, гена 3 — ингибируют

корни).

Каждый транскрипт определяется специфическим

промоторным участком на Ti-плазмиде, узнаваемым

полимеразой II растения — хозяина. Из рисунка видно, что

функция генов 1—3 проявляется в неорганизованном росте

клеток, поскольку тормозится формирование побегов и

корней.

Фитопатогенные агробактерии способны вызывать 3 вида

раковых опухолей у растений: корончатый галл, бородатый

корень и стеблевой галл. Возбудителем каждого заболевания

являются A.tumefaciens, A.rhizogenes и A.rubi соответственно,

Проникая в поврежденное растение, патогенный

микроорганизм с помощью Ti-плазмиды создает свою

экологическую нишу и реализует "генетическую колонизацию"

объекта — происходит гормон-независимый рост опухолевых

клеток.

Ti-плазмиды оказались хорошими векторными системами

для осуществления генноинженериых экспериментов с

растениями, поскольку Т-ДНК этих плазмид обладает

достаточно высокой эффективной емкостью (порядка 50 000

полинуклеотидов чужеродной ДНК могут быть перенесены и

встроены с ее помощью в хромосомную ДНК растений),

широким спектром хозяев, инфекционностью и ста-

бильностью.

Перенос гипотетического гена с помощью Ti-плазмиды

представлен на рисунке ниже.

Рис. Перенос гена (а) из хромосомы (6) Escherichia coli в

растение (5) с помощью Т-ДНК (в) Ti-плазмиды (г) A.tumefacienS

(2,3) в ядерную ДНК (д) растительной клетки (4).

Разработаны векторные системы на основе

растительных хлоропластов и митохондрий, ДНК которых

имеют гомологичные области с ядерной ДНК, что

облегчает обмен участками между ними при выполнении

генноинженерных экспериментов.

Заманчивы в качестве векторных систем и

транспозоны. Их множество сулит многообещающие

результаты в опытах с однодольными растениями,

устойчивыми к заражению агробактериями и,

следовательно, к восприятию Т-ДНК Ti-плазмиды.

В качестве векторов могут также использоваться

вирусы растений. Их нуклеиновые кислоты

реплицируются и проявляют свои функциональные

свойства (экспрессируют) в клетках растений-хозяев, где

потенциал вирусов и воспринимающих клеток

объединяется и реализуется в приумножении

организованных частиц патогена (например, для вируса

мозаики табака в среднем 10

частиц на клетку, для вируса

мозаики цветной капусты — порядка 10

частиц на

клетку).

Однако вирусы как векторы обладают четырьмя

существенными недостатками: они патогенны, их емкость

небольшая, вирусы не способны встраиваться в

хромосомы растительных клеток, они, в основном,

видоспецифичны, то есть поражают определенный круг

растений — хозяев.

В качестве векторов могут быть использованы также и

вироиды

(см.), представляющие собой однонитевые цепи

ковалентно связанных кольцевых РНК, включающих 270—

300 нуклеотидов, лишенных оболочки. Вироиды поражают

виноград, картофель, кокосовую пальму, томаты и другие

растения как по вертикали (через зародышевые клетки),

так и по горизонтали (распространяются по растительному

организму через клеточный сок или переносятся

механически).

Чтобы использовать вирусную (вироидную) РНК в

качестве вектора, необходимо выполнить следующие

последовательные операции.

Рис. Последовательнсть событий при использовании вирусной

(вироидной) РНК в качестве вектора: 1 — обратная

транскриптаза, 2 — ДНК-полимераза, 3 — встраивание в

плазмиду(клонирование), 4 — включение чужеродного гена, 5 —

инфицирование растений, 6 — транскрибирование с образованием

инфекционной РНК и последующее заражение растения-хозяина.

Клон кДНК с встроенным геном может обладать

инфекционностью и, как следствие, им заражают хозяйское

растение. Если же кДНК с встроенным геном не обладает

инфекционностью, то вирусный вектор может быть

транскрибирован с образованием РНК, которая затем

используется для заражения растения.

До сих пор ученые признают, что векторная система на

основе цитоплазматического вируса мозаики цветной

капусты (содержит двух-цепочечную ДНК) оказывается

наиболее приемлемой в генно-инженерных экспериментах с

растениями, хотя многое здесь остается неизученным

(например, молекулярные механизмы проявления

симптомов заболевания растения-хозяина от поражения

вирусом, неопределенность диапазона растений-хозяев и

возможность его расширения, неспособность векторной

системы встраиваться в геном хозяина, и др.).

Если удается объединить возможности ДНК из вируса

мозаики цветной капусты с Т-ДНК Ti-плазмиды, то такую

векторную систему можно будет использовать на более

широком круге растений-хозяев.

Объединение геномов клеток разных особей можно

осуществлять при половой и соматической гибридизации.

Первая из них способна реализоваться в природных и

искусственных условиях, тогда как вторая — только в

искусственных. Половая гибридизация давно известна

человеку, и он с тех пор использовал ее для выявления

новых сортов растений и для повышения их

продуктивности.

Соматическая гибридизация базируется в основном на

применении растительных протопластов, впервые

полученных Дж. Клеркером в 1892 г. из листьев Stratiotes

aloides (водное растение, именуемое телорезом).

Соматические клетки растений, как и интактные клетки

бактерий или грибов (по лат. intactus -- нетронутый), в

обычных условиях не сливаются друг с другом. Все они

предварительно должны быть лишены клеточной стенки я

трансформированы в протопласты.

Протопласты (от греч. protos — первый, plastos —

вылепленный, образованный) — это клетки, лишенные

клеточных стенок, способные сохраняться и

метаболизировать, равно как и реконструировать

клеточную стенку в подходящих условиях. Протопласты

можно получать с помощью механических и биохимических

(энзиматических) методов. В первых случаях добиваются

плазмолиза растительных тканей, например, с помощью

0,1% раствора сахарозы с последующим разрезанием

эпидермиса и освобождением протопластов в окружающую

питательную среду. Энзиматические методы по-разному

эффективны в получении протопластов. Здесь необходимо

подбирать ферменты для каждого вида растений, однако

наиболее часто используют целлюлазы, пектиназы,

гемицеллюлазы как индивидуально, так и в комбинациях.

Например, для получения протопластов из листьев Nicotiana

tabacum листовую ткань без эпидермиса погружают в смесь

ферментов, включающую 0,5% пектиназы и 2% целлюлазы в

0,7 М растворе маннита или сорбита; для получения

протопластов из листьев клевера и люцерны используют 2—

5% смесь гликаназ с пептидазами, и т. д.

В сравнительном плане более подходящим является

энзиматический метод получения протопластов как более

щадящий. Однако при любом способе важен подбор

осмотического стабилизатора, без которого может наступить

быстрый плазмоптиз протопластов (по лат. plasma — плазма,

option — альтернатива). В качестве таких стабилизаторов могут

быть применены растворы неорганических солей (СаС1

, КС1,

NaHPO

), органических гликолей (маннита, сорбита), моно- и

дисахаридов (глюкозы, ксилозы, сахарозы) в ориентировочных

концентрациях 0,3—0,8 М/л. Однако применительно к виду

растения, из которого получают протопласты, необходимо

подбирать индивидуальные условия для

"протопластирования" (осмотический стабилизатор, рН среды,

ГС). Эти требования сохраняются и в случаях получения

протопластов из каллусных культур и клеточных суспензий.

В жизнеспособности выделенных протопластов большую

роль играет физиологическая полноценность исходного

растительного материала. Суспензионные культуры наиболее

приемлемы для этих целей, будучи в конце логарифмической

фазы роста (размножения) .

Полученные тем или иным путем протопласты либо

используют для регенерации растения, либо их можно

подвергнуть слиянию с образованием гетерокариотических

гибридов.

Из растений, относительно легко регенерирующих из

протопластов, можно назвать картофель, люцерну, маниок,

рапс, табак. Для получения растений — регенерантов,

высаженных в грунт, требуется, как минимум, 16—18 недель.

Растения, полученные из протопластов, могут отличаться

достаточно выраженной изменчивостью по ряду

интересующих нас признаков: урожайности, величине

(размеру), морфологии отдельных частей, фотопериодичности

и др. Как правило, это связывают с изменением числа и

перестройками хромосом. Поэтому протопласты растений

представляют собой интересные объекты и для изучения

процессов мутагенеза.

Гибридизация протопластов удается не только в тех

случаях, когда исходные растения (источники клеток для

протопластирования) способны гибридизоваться половым

путем, но и тогда, когда заведомо известно, что клетки,

подлежащие слиянию, относятдя к организмам с половой

несовместимостью. Тем не менее, во всех случаях

соматической гибридизации один из партнеров должен нести

какой-либо маркерный признак (биохимический или другой),

по которому возможно подтвердить достоверность получения

гибрида. В этом смысле удобны ауксотрофные мутанты.

Гетерокариотические соматические гибриды выделяют

либо вручную с помощью микроманипулятора, капиллярной

пипетки и шприца, либо автоматически на основе применения

флуоресцентных систем.

Для биотехнологии также важна цибридизация, когда

возникают гетерозиготы по внеядерным (цитоплазматическим)

генам, определяющим, например, устойчивость к гербицидам

или признак цитоплазматической мужской стерильности

(рисунок).

К настоящему времени из ряда растительных

протопластов получены их безъядерные фрагменты —

микропласты, окруженные тонопластной мембраной и

включающие часть внеядерного генетического материала.

Используя приемы соматической гибридизации, микропласты

можно сливать с реципиентными протопластами. Таким

образом, микропласты являются резервным материалом для

расширения возможностей клеточной инженерии в

фитобиотехнологии. Более того, теперь удается гибридизация

растительных протопластов с протопластами микроорганизмов

и животными клетками.

Применительно к хромосомной инженерии удалось

доказать проникновение изолированных метафазных хромосом

в обработанные полиэтиленгликолем реципиентные протоп-

ласты таких однодольных растений, как пшеница и

кукуруза.

Также открываются пути привнесения дополнительной

генетической информации по желанию экспериментатора в

целях создания трансгенных растений. Прямой перенос

чужеродной ДНК в протопласты возможен также с помощью

микроинъекции, трансформации, упаковки в липосомы с

последующим их эндоцитозом растительными

протопластами, и электропорации (высоковольтных

электрических импульсов).

Другая отрасль фитобиотехнологии - это создание

растений, способных фиксировать атмосферный азот.

Азотистые удобрения, вносимые в почву (наряду с другими

питательными веществами) стимулируют рост и развитие

растений. Обогащению почвы азотом помогают особые

микроорганизмы, фиксирующие молекулярный азот из

воздуха. Такие микробы подразделяют на две группы —

свободноживущие в почве (например, Azotobacter

chroococcum) и микробы - симбионты с корневой системой

растений (например, Rhizobium meliloti). Те и другие

осуществляют биологическую азотофиксацию. Число

азотофиксаторов невелико, но от них в буквальном смысле

слова зависит жизнь на нашей планете. С помощью

микробов - азотофиксаторов ежегодно фиксируется около

17,5 x 10

тонн азота из воздуха. Основные компоненты

системы азотофиксации являются сильными

восстановителями: ферментный комплекс — нитрогеназа,

ферредоксин или флаводоксин и АТФ. Микробы —

азотофиксаторы трансформируют молекулярный азот в

аммиак по следующей схеме:

Ассоциация клубеньковых бактерий из рода Rhizobium с

бобовыми растениями является наиболее эффективной по

фиксации N

из воздуха. Ответственными за это являются

nif-гены. Соответствующие биопрепараты бактериальных

удобрений выпускают в различных странах мира.

К настоящему времени практически решена проблема

увеличения nif-генов в микробах — азотофиксаторах,

являющихся симбионтами донника (Rh. meliloti). За счет

этого заметно усиливается азотофиксация и, как следствие,

повышается урожайность растения — хозяина (схема).

Схема получения клеток Rhizobium meliloti, несущих

дополнительные гены азотфиксации: 1 — плазмидная ДНК, 2 —

рестриктаза, 3 — клетка Rh.meliloti, 4 — хромосома клетки, 5 —

nif-гены, 6 —лигаза, 7 — рестриктирован-ная плазмидная ДНК, 8 —

плазмидная ДНК с nif-геном, 9 — трансформация, 10 — клетка

Rh.meliloti с nif-генами.

В настоящее время имеются также предпосылки к

созданию методами генной инженерии злаковых растений —

азотофиксаторов. Это сулит большие выгоды агрохозяйствам,

занимающимся выращиванием, например, зерновых культур.

Прибегают и к простым искусственным ассоциациям

азотофиксирующих бактерий с растениями, дающими

ощутимые результаты по урожайности (например,

цианобактерии Anaboena variabilis и табака).

В начале 90-х годов текущего столетия удалось создать

подсолнечник, несущий гены бобов фасоли, кодирующих белок

фазеолин. Такое химерное растение получило название

"Санбин" (от англ, sun — солнце, bean — боб), оно способно

синтезировать во многом полноценные белки. Каллусная

культура санбина также обладает этой способностью.

Кроме генов фазеолина локализованы и выделены гены

таких запасаемых белков, как зеин — белок кукурузы и легумин

— белок гороха. Эти гены удается переносить в отдельные

негомологичные растения.

Создан трансгенный рапс, содержащий гены отдельных

нейропетидов человека, например, лейэпкефалина, связанного с

геном альбумина семян рапса. С одного гектара земли,

засеянного таким рапсом, можно получать до 3 кг

неиропептида.

Важное значение имеют работы по созданию

гербицидоустойчивых растений, не боящихся сорняков.

Удалось перенести из представителей актиномицетов ген

устойчивости к фосфаноцину в клетки сахарной свеклы;

получены также устойчивые к гербицидам определенные

сорта табака.

Токсические белковые кристаллы, образующиеся в клетках

Вас. thuringiensis на основе матричного синтеза, убивают

личинок лис то грызущих насекомых. Поэтому

генноинженерная разработка по переносу гена бактериального

токсина в геном табака увенчалась успехом в 1987 г.

Экспрессия такого гена сопровождалась биосинтезом

токсина, и личинки насекомых, поедающие листья, погибали в

сравнительно короткий промежуток времени. По такому же

принципу был создан инсектицидный трансгенный

хлопчатник, содержащий ген ингибитора трипсина гороха

коровьего; этот ген обусловливает синтез белка,

блокирующего протеолитическую активность в

пищеварительной системе у насекомых.

Создан новый сорт помидоров, длительно сохраняющийся

без размягчения вследствие подавления активности фермента

полигалактуронидазы. Методом генной инженерии получен

ген, определяющий биосинтез анти-мРНК, которая

ингибирует природную мРНК.

Благодаря удачному переносу генов фермента

халькосинтетазы в петунию удалось получить растение с

белыми цветами.

Сконструированы такие генноинженерные сорта сои,

которые проявляют устойчивость к насекомым, гербицидам,

вирусам и образуют больше запасных белков, обогащенных

метионином.

В настоящее время на основе методов геномной

инженерии получены межвидовые гибриды капусты,

картофеля и табака с турнепсом, картофеля с помидором

("Помат"), помидора дикого вида, устойчивого к некоторым

вирусам, и культурного сорта.

Весьма успешными оказались работы по созданию

морозоустойчивых растений на основе их обработки

культурой клеток Pseudomonas syringae, из которой

элиминирован ген, ответственный за синтез специального

белка, ускоряющего кристаллизацию воды с образованием

льда. Обработка клубней картофеля таким "ледминус"

микробом приводит к возрастанию их морозоустойчивости.

ЛИТЕРАТУРА

Бациллы. Генетика и биотехнология. Под ред. К.

Харвуда. М., Мир, 1992.

Бейли Дж., Оллис Д. Основы биохимической инженерии, в

2-х частях. М., Мир, 1989.

Бекер М. Е., Лиепиньш Г. К., Райпулис Е. П.

Биотехнология, М., ВО Агропромиздат, 1990.

Биотехнология в 8-ми томах. Под ред. Н. С. Егорова, В.

Д. Самуилова. Уч. пособие для вузов. М., Высшая школа, 1987

—1988.

Биотехнология: принципы и применение. Под ред. И.

Хиггинса, Д. Беста, Дж. Джонса. М., Мир, 1988,

Биотехнология растений. Под ред. С. X. Мантелла и X.

Смита. М., ВО Агропромиздат, 1987.

Воробьева Л. И. Промышленная микробиология. М.., МГУ,

1989.

Елинов Н. П. Химическая микробиология. М., Высшая

школа, 1989.

Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Под

ред. Дж. Вудворда. М., Мир, 1988.

Каратыгин И. В. Коэволюция грибов и растений. Санкт-

Петербургский Гидрометеоиздат. С.-Пбг. 1993.