Кремлев Е.П. Лабораторный практикум по курсу Экология

Подождите немного. Документ загружается.

контроль: 1) 10 мл исследуемого молока + 1 мл дистиллированной

воды; 2) кипяченое исследуемое молоко + метиленовый го лубой

1мл— результат контроля отрицательный. Учет результатов про-

водят через 10 мин, 1 ч, 3 ч и более. Качество молока устанавлива-

ют по времени обесцвечивания. Хорошее молоко — продо лжитель -

ность обесцвечивания — свыше 3 ч, к о личество бактерий — менее

0,5 млн.; удовлетворительное — обесцвечивается от 1 ч до 3 ч, ко-

личество бактерий — от 0,5 до 4 млн в 1 мл; плохое обесцвечивает-

ся свыше 10 мин до 1 ч, микробная обсемененность составляет от 4

до 20 млн/мл; о чень пло хое — обесцвечивание наступает за 10 мин

и менее, количество микробов — более 20 млн/мл.

Проба с резазу рином. Преимущество пробы: результат по ис-

следованию микробной обсемененности молока получают за 1 ч.

Недостатки: срок годности препарат а ограничен, препарат из раз-

ряда дефицитных, рабочие растворы хранятся недолго (при 3–

5°С) — 2–3 недели.

Перед постановкой опыта готовят рабочий раствор резазури-

на в концентрации 0,005%, для чего вначале готовят маточный

раствор: в 100 мл кипяченой охлажденной дистиллиров анной воды

растворяют 0,05 г резазурина, а перед постановкой опыта разбав-

ляют дистиллированной водой еще в 10 раз.

Ход исследования

В пробирку с 10 мл молока вносят 1 мл рабочего раствора

резазурина и далее поступают, как при исследовании с метилено-

вым голубым. Учет результатов проводят через 20 мин и 1 ч. Через

20 мин обесцвеченные пробирки исследуемых проб молока удаля-

ют, остальные после перемешивания снова помещают в водяную

баню или термостат. Качество молока устанавливают по обесцве-

чиванию и окраске с учетом количества затраченного времени.

Хорошее молоко — 1-й класс (через 1 ч приобретает сине-сталь-

ной цвет, содержит менее 0,5 млн. микробных тел в 1 мл); далее,

соответственно: удовлетворительное (2-й класс — через 1 ч ок-

раска молока сиреневая или сине-фиолетовая, 0,5–4 млн. микроб-

ных тел в 1 мл); пл охое (3-й класс — через 1 ч окраска розовая или

белая, 4-20 млн. микробных тел в 1 мл); очень плохое (4-й класс —

до 20 мин, свыше 20 млн микробных тел в 1 мл, белого цвета).

Методы прямого подсчета микроорганизмов в молоке

Метод Фроста. На предметном стекле, чаще с обратной сто-

роны, обозначают площадь в 1 см, в центр ее вначале вносят 0,1мл

исследуемого молока, смешивают с каплей расплавленного и ох-

лажденного до 45–47 °С МПА и равномерно распределяют на этой

площади. Инкубируют при 37 °С 24 ч, подсчитывают количество

колоний на поверхности среды и в среде, умножают на 10, полу-

чают количество микробных тел в 1 мл исследуемой пробы моло-

ка. Этот метод называют методом агаровых пластин.

Метод серийных разведений с высевом в МПА. Внача ле

приготавливают разведения молока, они могут быть двукратны-

ми и т.д., но чаще готовят десятикратные. Берут 6 пробирок с 9 мл

стерильной воды или физраствора, в первую пробирку стериль-

ной пипеткой вносят 1 мл молока, тщательно перемешивают, дру-

гой пипеткой берут 1 мл в первой пробирке и переносят во вто-

рую, тщательно перемешивают и 1 мл переносят в третью и т.д.,

включая 6-ю. Таким образом получают разведения молока 1:10,

1:100, 1:1000 и т.д. до 1:1000000. В зависимости от предполагае-

мой обсемененности из двух пробирок (например, 4-й и 5-й) по

1мл вносят в стерильные чашки Петри, заливают расплавленным

и остуженным до 45 °С МПА по 12–15 мл, перемешивают, чашки

оставляют для застывания среды, затем заворачивают в бумагу и

помещают в термостат вверх дном. На бумаге указывают номер

пробы молока, степень разведения, дату посева. Разведения моло-

ка следует выбирать таким образом, чтобы было от 50 до 300 ко-

лоний. В случае, когда колоний вырастает более 150, дно чашки

расчерчивают восковым карандашом и подсчитывают только по-

ловину (умножая затем на 2). Количество колоний умножают на

разведение молока и получаю т число микроорганизмов в 1 мл после

суточной инкубации посевов в термостате.

Определение коли-титра мо лока. Коли-титр молока — наи-

меньшее его количество, в котором обнаружена хотя бы одна ки-

шечная па лочка. Исследованию на коли-титр подвергают свежее

(сырое) и пастеризованное молоко, сливки и другие молочные

продукты.

Коли-тит р молока устанавливают бродильным методом на

среде Кесслера, в сост ав которой, кроме необходимых для раз-

множения микробов питательных веществ, входят генциановый

фиолетовый, бычья желчь — вещества, угнетающие ро ст и раз-

витие грамположительных микробов. Кроме того, режим инку-

бации (43 °С) посевов создается в пределах температурного мак-

симума, при котором кишечная палочка еще способна

развиваться, размножаться (хотя и с трудом), но зато рост дру-

гих микроорганизмов угнетается.

Приготовление среды К е сслера. К 1 л дистиллированной воды

прибавляют 10 г пептона, 50 мл свежей бычьей желчи, смесь кипя-

тят 30 мин и фильтруют. Добавляю т 10 г лактозы, доводят объем до

1 л. К среде добавляют 4 мл 10 %-ного водног о раствора генциано-

вог о фиолетового, разливают в пробирки по 5 мл с поплавками (бро-

дильными трубочк ами) и стерилизуют 15 мин при 1 атм.

Методика приготовления

Вначале готовят 10-кратные разведения молока в 6 пробир-

ках. Затем берут 6 пробирок со средой Кесслера. Используя сте-

рильные градуированные пипетки, вносят последовательно в пер-

вые три пробирки со средой Кесслера по 1 мл молока в разведении

1:10, 1:100, 1:1000; в 3 пробирки со средой Кесслера по 0,1 мл

молока в разведении 1:10 000, 1:100000, 1:1000000. Засеянные

пробирки помещают в термостат при 43 °С на 24–48 ч, после чего

производят учет результатов исследований.

Появление газа в поплавках свидетельствует о возможном

загрязнении продукта кишечной па лочкой. Для подтверждения

этого и уст ановления вида микробов содержимое забродивших

пробирок выс евают на среду Эндо в чашках Петри и инкубиру-

ют в термост ате 1–2 суток при 37 °С. При появлении на среде

Эндо красных с металлическим блеском или розовых слизистых

колоний их изучают выборочно, из них готовят мазки, окраши-

вают по Граму и микроскопируют. При необходимости для вы-

явления цитратотрицатель-ных бактерий производят по сев на

среду Симонса или Козера: штаммы кишечной па лочки, изменя-

ющие среду Симонс а из оливково-зеленого в светло-синий цвет,

не учитываются.

Оценка качества молока по коли-титру

1) коли-титр молока более 3 мл — отсутствие газообразова-

ния во всех 6 пробирках;

2) коли-титр равен 3 мл — газообразование наблюдается в

одной из 3 пробирок, засеянных по 1 мл разведении молока;

3) коли-титр равен 0,3 мл — брожение обнаруживают более

чем в одной пробирке с посевом 1 мл или хотя бы в одной из трех

пробирок с посевом 0,1 мл;

4) коли-титр менее 0,3 мл — газообразование обнаруживают

в 5 или 6 пробирках. Такое молоко к употреблению непригодно.

Окончательную оценку молока дают согласно т аблице.

Пастеризованное

Микробное число

(микр. тел / мл), не более

Коли-титр

В пакетах и бутылках 50 000 3 мл

Во флягах и цистернах 200 000 0,3 мл

Бактериологическая характеристика молока коровьего

(ГОСТ 9225-84)

ГОСТ питьевого молока и молочных продуктов

(ГОСТ 9225-84)

ГОСТ сырого молока (13264-70)

№

п/п

Категории

молока и молочных

продуктов

Общее микробное

число (количество

микробов в 1 мл воды)

Коли-титр

на среде Кесслера

(мл или г)

Пастеризованное молоко

в бу тылках и пакетах

50 000 3

Пастеризованные сливки

в бу тылках и пакетах

100 000 3

Пастеризованное молоко

во флягах и цистернах

200 000 0,3

4 Сыр росс ийский 500 0,1

№

п/п

Показатели молока

Высший

сорт

Первый

сорт

Второй

сорт

Несорто-

вое

1 Кислотность, Т 16–18 16–18 16–20 16–20

2 Степень чистоты I I II II

Менее 0,3 0,3–0,5 0,5–1,0 4–20

Более 3,5 ч,

цвет синий

3,5 ч,

цвет синий

2,5 ч, цвет

синий

40 мин,

цвет синий

Бактериальная

обс емененность —

количество микробов

(млн.) в 1 мл молока,

она определяется

пробой на редуктазу:

а) с метиленовым

голубым;

б) с резазурином

Сиреневый,

1,5 ч

Сиреневый,

1 ч

Розовый,

1 ч

Белый,

1 ч

Протеолитические бактерии учитывают при посеве из 3-го и

4-го разведений (при необходимости и из других) на молочный

агар в чашках. Для определения их количества чашки с посевами

помещают в термост ат при 30 °С. Колонии подсчитывают через

36–48 ч. Протеолитические бактерии вокруг колоний образуют

зоны просветления (протеолиза). Подсчитывают число колоний,

умножают на разведение и определяют обсемененность 1мл мо-

лока. В качестве среды можно использовать также МПЖ.

При определении титра маслянокислых бактерий пробирки

со стерильным цельным молоком (или гидролизированным моло-

ком с 1 % глюкозы) засевают из 2-го, 3-го и 4-го разведений. Пос-

ле посева пробирки нагревают в водяной бане до 85 °С в течение

10 мин и помещают в термостат, где выдерживают при 30 °С в

течение 3 дней. На личие маслянокислых бактерий определяют по

следующим признакам: а) образованию газа; б) запаху масляной

кислоты; в) на личию в мазке спорообразующих бактерий, имею-

щих форму барабанных палочек и дающих с йодом положитель-

ную реакцию на гранулезу. По результатам исследования опреде-

ляют тит р. Это наибольшее разведение молока, в котором

обнаруживается рост маслянокислых бактерий.

Для определения количества дрожжей и плесневых грибов

из пробы цельного молока и десятикратных разведений произ-

водят посев в чашки Пет ри с сусло-агаром, выдерживают в тер-

мостате при 30 °С 3 суток. Подсчитывают отдельно колонии дрож-

жей (они имеют вид сметанообразной массы) и колонии

плесневых грибов. Далее поступают, ка к при определении про-

теолитических бактерий.

При необходимости дальнейшее исследование молока прово-

дят на присутствие стафилококков, маститных стрептококков, бак-

териофага и антибиотиков. Стафилококк золотистый и стрепто-

кокк агалактийный (маститный) вызывают мастит и, попадая с

молоком в пищу, способствуют отравлению.

Колонии протеолити-

ческих бактерий на мо-

лочном агаре

Маслянокислые бакте-

рии Clostridium butyricum

Молочная пле сень

Ceotrichum candidum

Для распознавания маститного молока ста вят каталазную,

лейкоцитную, бромтимоловую пробы и пробу отстаивания.

Для пробы отстаивания (Мутовича) по 10–15 мл молока в

пробирках из каждой доли вымени оставляют при 4–8 °С, затем

просматривают через 2–3 и 24 ч. При этом определяют цвет моло-

ка, на личие ос адка и примесей, высоту слоя сливок и их внешний

вид. Маститное мо локо бывает синеватым, водянистым. Слой сли-

вок толщиной менее 0,5 мл указывает на заболевание. Признаком

заболевания является также розовый цвет сливок (наличие в них

эритроцитов). Хлопья свидетельств уют о большом количестве лей-

коцитов.

Бромтимоловую пробу (бромтимоловый тест) ставят на ин-

дикаторной карте. Из каждого со ска вымени перед до ением ка-

пают одну каплю молока на соответ ствующее желтое пятно.

Молоко из здоровой четверти вымени дает желтую или желто-

зеленую окраску, молоко из больной четверти вымени — зеле-

ную или синюю, в зависимости от стадии заболевания. Полу-

ченную окраску сопоставляют со средней полос кой сравнения

на карте.

Антибиотики (стрептомицин, тетрациклин и др.) попадают в

молоко при лечении мастита у коров. Они нарушают молочно-кис-

лое брожение. Для установления наличия антибиотиков в молоке

используют прямые и косвенные методы. Метод прямого микро-

скопирования основан на подавлении размножения бактерий под

действием антибиотиков. Пробирку с 10 мл молока помещают в

водяную баню при 80–85

С на 5 мин, затем быстро охлаждают до

40 °С. Контролем служит пробирка с 10 мл молока, которое заве-

домо не содержит антибиотиков. В обе пробирки добавляют по 2–

3 капли свежей культуры чувствительного к антибиотикам термо-

фильного ст рептококка, пробирки тщательно встряхивают,

выдерживают 90 мин в водяной бане при 40 °С. Затем микроско-

пируют окрашенные мазки-препараты. На присутствие антибио-

тиков указывают резкое уменьшение количества клеток в испыту-

емом молоке по сравнению с к онтролем, наличие уто лщенных форм

клеток и их скопление.

При использ овании метода во сстановления индикаторов

(см.«Косвенные методы контроля микробной обсемененности»)

применяют метиленовый голубой, резазурин и комбинированный

индикатор, состоящий из хлорфенилового красного и бромкрезо-

лового зеленого.

Бактериофаги (вирусы бактерий) способны разрушать раз-

личные виды молочнокислых бактерий. В молоко бактериофаг

попадает с кормом, с кожи и вымени животного. При на личии

специфических к молочнокислым бактериям бактериофагов при-

го т о в ление мо лочнокислых про дук т ов невоз можно из-за отсутствия

рост а микробной закваски.

Для выявления бактериофагов вначале приготав ливают филь-

трат молока. Пробу молока в стерильной колбе нагревают до 40 °С

в водяной бане, добавляют 10 %-ную молочную или уксусную

кислоту до осаждения белков. Свернувшееся молоко фильтруют

через стерильный бумажный фильтр, затем чере з стерильный

фильтр Зейтца. Фильтрат собирают в пробирку.

Для обнаружения фага на плотной питательной среде в чаш-

ку Петри наливают агар с гидролизированным молоком, по сле

застывания подсушивают в термост ате при 40–45 °С в течение

10–15 мин. На поверхность среды наносят одну каплю 16–18-ча-

совой культуры чувствительного стрептококка или другого мик-

роорганизма, втирают шпателем по всей поверхности среды. Сте-

рильной пипеткой у края чашки наносят каплю фильтрата, чашку

наклоняют так, чтобы капля стекала по диаметру, инкубируют 24 ч

при 30 °С. При наличии бактериофага в фильтрате наблюдаются

стерильные следы или пятна там, где стекала капля. Иногда по

следу наблюдается слабый вторичный рост устойчивых к фагу

микробов. Такое молоко выпускается стерильным (топленое, сте-

рилизованное).

Контрольные вопросы

1. Назовите прямые и косвенные методы определения мик-

робной обсемененности молока.

2. Как определяются протеолитические (гнилостные), масля-

нокислые бактерии, дрожжи в молоке?

3. Как определяется коли-титр молока и для каких целей?

4. Для чего определяют наличие гнилостных и других мик-

роорганизмов в молоке?

IV. Биотический анализ

Лабораторная работа № 24 (6 часов)

Методы с бора организмов для биотического ана лиза

Материалы и оборудование

Матерчатое полотно размером 1м

, с ачок, планктонная сеть,

клейкая ловушка, ловчий цилиндр, световая ловушка, живоловка

(мышеловка), эксгаустер (всасыватель), воронка Бермана.

Ход работы

Методы

сбора

Последовательность

действий и назначений

Собираемые

организмы

1 2 3

Стряхивание

насекомых

Матерчатую простыню прикрепляют к склад-

ному каркасу и держат под веткой, по кото-

рой бьют палкой или которую встряхивают.

Насекомые падают на простыню, их собирают

с помощью всасывателя

Нелетающие

насекомые,

личинки,

пауки

Световая

ловушка

Свет электролампы привлекает летающих на-

секомых, которые бьются об ограждения, па-

дают вниз и попадают в картонную коробку

или в бумажный пакет. Прежде чем осматри-

вать содержимое короб-ки, поместите в нее

шерстяную нить, пропитанную хлороформом,

чтобы усыпить или убить насекомых

Ночные

насекомые,

особенно

бабочки

и ручейники

Ловля

сачком в

воздухе

Сачком ма шут в воздухе, при этом насекомые

попадают в сетку. Ме тодику от лова разнооб-

разят, чтобы обеспечить единообразие соб-

ранных образцов. Выбирать из сетки насеко-

мых следует после восьми взмахов, причем

каждый взмах должен описывать восьмерку

Летающие

насекомые

Кошение

сачком

Сачком резко проводят по траве, кустарни-

кам, в водной толще пруда или реки

Насекомые,

ракообразные

Планктонная

сетка

Просеивающую сетку прикрепляют к метал-

лическому обручу, привязывают к веревке и

протягивают по воде. К задней стороне при-

крепляют небольшую банку для сбора образ-

цов

Планктон

1 2 3

Клейкая

ловушка

Темную патоку (варенье) и сахар кипятят

вместе, затем намазывают на лист полиэтиле-

на, кнопками прикрепляют его к отрезку фа-

неры, картона или доски. Этот лист можно

подвешивать в различном положении на раз-

личной высоте. К клейкой массе в качестве

привлекающих веществ можно добавить

джем и пиво

Летающие

насекомые

Ловчий

цилиндр

Стеклянную банку зарывают в землю так,

чтобы ее край находился на уровне земли.

Лучше закрыть банку, чтобы вокруг края об-

разовался небольшой скат, это предотвратит

попадание в нее воды. Кусок шиферной плит-

ки, установленный на трех камнях, служит

крышей, защищающей от дождя. В ловушку

необходимо положить приманку, например,

варенье, джем или гниющее мясо

Ползающие

насекомые,

многоножки,

ракообразные

Живоловка Ловушку для млекопитающих (живоловку)

оставляют на тропе, ведущей к водопою,

предварительно заполнив ее сухой травой.

Приманку (крупу или сухие фрукты) можно

разместить и снаружи, и внутри ловушки. По-

ка жив отные не привыкли к ловушке, ее мож-

но не заряжать. Животных ловят жив ыми, по-

этому ловушку регулярно осматривают. Одни

животные очень осторожны и никогда не за-

ходят в нее регулярно. Различное поведение

организмов создает определенные трудности

при использовании данного метода для оцен-

ки численности популяции

Землеройки,

полевки,

мыши

Ловля

водным

сачком

Этот метод применяют для отбора образцов в

пресных проточных водоемах. Открытый са-

чок или планктонную сетку ставят ниже по

течению того места, которое намечается об-

следовать, на обследованном участке перево-

рачивают камни и соскабливают с них орга-

низмы, которые заносятся течением в сачок.

Водные

насекомые и

ракообразные

Всасыватель Метод применяется для сбора мелких насеко-

мых с полотна или с растений для проведения

более тщательного исследования (или под-

счета)

Тли, мелкие

насекомые

и пауки

Ручной

разбор

Образцы почвы или растений, лесную под-

стилку или сачок с водными обитателями

кладут на поднос и методично перебирают

пальцами. Найденные образцы помещают в

стеклянную банку, после чего их анализиру-

ют с определением видовой принадлежности

Клещи,

энхитреиды,

мелкие

насекомые

и их личинки

Лабораторная работа № 25 (4 часа)

Определение и оценка численности организмов по видам

Материалы и оборудование

Определитель видов беспозвоночных животных, определи-

тель растений.

1 2 3

Экстра-

гирование

5 см

4 %-ного формальдегида добавляют к 50

см

воды и этим раствором поливают квад-

ратный метр пахотной земли, газона или луга.

После того, как земляные черви выползут, их

собирают и сразу же обмывают водой, чтобы

смыть формальдегид

Дождевые

черви

Флотация

Взвешенный комок почвы помещают в стакан

с насыщенным раствором поваренной соли,

энергично взбалтывают и дают почве осесть.

Организмы всплывают на поверхность. По-

верхностный слой жидкости сливают в чашку

Петри и исследуют под микроскопом при ма-

лом увеличении

Клещи,

насекомые,

яйца,

личинки и

куколки

Сухая

экстракция

Многие организмы, населяющие почву и под-

стилку, избегают источников тепла и пере-

мещаю тся на влажные участки. Образец поч-

вы или подстилки помещают в сито примерно

на расстоянии 25 см под металлическим реф-

лектором с лампой на 100 Вт. Каждые два ча-

са лампу подвигают к образцу на 5 см, пока

расстояние между лампой и образцом не ста-

нет 5 см. В таком положении рефлектор ос-

тавляют на 24 часа. Все мелкие членистоно-

гие перемещаются вниз и сквозь металличе-

скую сетку попадают в сосуд со спиртом

Мелкие

членистоногие

(двупарноногие,

губоногие,

клещи,

ногохвостки

и колемболы)

Мокрая

экстракция

Образец почвы насыпают в марлевый мешо-

чек, опускают в воронку с водой и подвеши-

вают на расстоянии 25 см под металлическим

рефлектором с электролампой в 100 Вт. Ос-

тавляют на 24 часа. Вода и слабый нагрев

способствуют тому, что организмы переме-

щаются из почвенного образца в воду и осе-

дают на дне воронки. Через определенные

промежутки времени зажим на дне воронки

открывают, и организмы падают в сосуд со

спиртом

Мелкие

членистоногие,

энхитреиды

и нематоды