Кремлев Е.П. Лабораторный практикум по курсу Экология

Подождите немного. Документ загружается.

Ход анализа

В мерную колбочку на 50 мл взять аликвоту вытяжки из по-

чвы с содержанием марганца от 10–20 мкг, прибавить 5 мл рабо-

чего раствора формальдоксима и 15 мл рабочего аммиачного бу-

ферного раствора, перемешивая содержимое колбочки по сле

прибавления каждого реактива. Оставить на 5–10 мин для полно-

го развития окраски. Затем прилить 2,5 мл маскирующего раство-

ра и перемешать, оставить на 10 мин для разрушения комплекса

формальдоксима железа и довести водой до метки. Раствор фото-

метрировать не позднее чем через 30 мин при длине волны 490 нм

(сине-зеленый светофильтр) относительно Н

О. Калибровочную

кривую строят в интервале 10–15 мкг марганца в пробе.

Лабораторная работа № 40 (6 часов)

Определение влияния различных доз токсичных тяжелых

металлов на физиологические параметры растений

Материалы и оборудование

Чашки Петри, растворы, содержащие ионы Pb, Cu, Zn, Mo, Co,

Mn в к о личествах. 0,1; 1; 10 ПДК; семена ячменя, г оро х а, редиса.

Ход анализа

1. Поместите в 4 чашки Петри по 13 семян исследуемого ра-

стения.

2. Прибавьте в три чашки по 10 мл растворов с различными

концентрациями тяжелых металлов (0,1; 1; 10 ПДК). В четвертую

чашку добавьте 10 мл дистиллированной воды, она будет служить

контролем.

3. Опыт заложите в трехкратной повторности.

4. Ост авьте чашки на 6 дней для прорастания семян.

5. Учтите длину корней в проросших семенах в мм. Учиты-

вать необходимо самые длинные корни в каждом из семян. По три

проростка в каждой чашке с максимальными отклонениями не

учитываются как случайные.

6. Определите средние значения длины корней. Сравните

полученные значения в опытных чашках с контрольными.

7. Выводы об устойчивости растения к действию токсиканта

оформите в виде таблицы. Для оценки устойчивости растения к

токсиканту вводим индекс устойчивости (I уст):

(Iуст) 0,1 ПДК = (L1/Lk) · 100 %,

(Iуст) 1 ПДК = (L1/Lk) · 100 %,

(Iуст) 10 ПДК = (L1/Lk) · 100 %,

где L1, Lk — длина корня проростка при воздействии токсиканта

и в контрольном опыте, соответ ственно.

8. Составить т аблицу, отражающую устойчивость данного

растения к соответствующим концентрациям предложенных ток-

сикантов.

Контрольные вопросы

1. Способы проникновения токсичных металлов в организм

человек а.

2. Транспорт тяжелых металлов по организму.

3. Всасывание и выведение элементов тяжелых металлов.

4. Пути детоксик ации тяж елых металлов в организ ме человека.

5. Действие Pb, Hg, Cd и других элементов на жизненно-важ-

ные функции организма.

Лабораторная работа № 41 (4 часа)

Определение влияния токсичных тяжелых металлов

на биохимические параметры растений

В качестве биохимического параметра выберем активность

фермента сукцинатдегидрогеназы в корнях проростков семян яч-

меня до и после обработки ионами тяжелых токсичных металлов.

Материалы и оборудование

Растворы, содержащие ионы меди, свинца и марганца в ко-

личествах 0,1; 1; 10 ПДК, фотоэлектрокалориметр (ФЭК-2), про-

ростки семян ячменя.

Ход работы

Метод определения сукцинатдегидрогеназной активности в

гомогенатах тканей.

Принцип: Сукцинатдегидрогеназа кат а лизирует ре акцию:

сукцинат — фумарат + 2Н.

Метод регистрации ферментативной активности основан на

определении скорости падения оптической плотности окисленной

формы 2,6-дихлорфенол-индофенолята натрия (2,6-ДХФИФNa)

при акцептировании им протонов от сукцинат а и переходе в вос-

становленную форму, не имеющую при длине волны 600 нм опти-

ческой плотности. Изменение оптической плотности на 1,0 соот-

ветствует окислению 60 наномолей сукцината.

Реактивы

1. Фосфатный буфер 0,1М, рН 7,5: 7,8 г NaH

растворяют

приблизительно в 400 мл воды, затем под контролем рН-метра и

интенсивном перемешивании раствора на магнитной меша лке

добавляют гранулы NaOH до установления значения рН 7,5, пос-

ле чего доводят объем до 500 мл. Хранить буфер в холодильнике.

2. NaCN (7мг/2мл дистиллированной воды) нейтрализуют НСl

2N до рН 7,0–7,5. Этот реагент применяется для блокады цитох-

ромов, кот орые без блокирования переносили бы электроны и про-

тоны не на 2,6-ДХФИФNa, а на кислород и тем самым мешали бы

определению активности фермента.

3. Феназинметсульфат (ФМС) 0,02М раствор (8мг/2мл дист.

воды). Этот реагент является промежуточным акцептором элект-

ронов и протонов и облегчает перенос их на 2,6-ДХФИФNa. Его

готовят в день определения активности СДГ и хранят в темной

посуде.

4. 2,6-ДХФИФNa — 6мг/10 мл дист. воды. Готовят на неделю

работы, хранят в темной посуде. Окисленная его форма имеет си-

ний цвет, при восстановлении становится бесцветной.

5. Сукцинат 0,5М раствор — 590мг/10мл дист. воды, нейтра-

лизовать гранулами гидроксида натрия или калия до рН 7,0–7,5.

6. Гомогена т ткани 1: 10, приготовленный на 0,15 М КСl, све-

жеприготовленный, хранить в холодильнике при отрицательной

темпера туре.

Техника определения активности фермента

Состав инкубационной смеси:

фосфатный буфер 0,1М, рН 7,5 .............................................. 0,8 мл

NaCN ......................................................................................... 0,1 мл

ФМС .......................................................................................... 0,1 мл

2,6-ДХФИФNa ........................................................................ 0,05 мл

гомогенат 1: 10 ..................................................................... 0,005 мл

Реакцию после измерения исходной оптической плотности при

длине волны 600 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см

запускают сукцинатом 0,05мл

Регистрируют время, за которое уменьшится оптическая плот-

ность на 0,1 единицы. Реакцию проводят в термостатируемой

кювете при 30 градусах Цельсия (можно и при 26 °С и при 37 °С).

Техника расчета активности сукцинатдегидрогеназы

Допустим, что оптическая плотность инкубационной смеси

снизилась на 0,1 ед. за 10 секунд, за минуту она уменьшилась бы

на 0,1 х 6 = 0,6 ед. Известно, что падение оптической плотности

на 1,0 равно окислению 60 нм субстрата. Отсюда по пропорции

находим, сколько сукцинат а окислилось при изменении оптичес-

кой плотности на 0,6 ед.:

60 нмолей сукцината : 1 = х : 0,6

из пропорции х = 36 нмолей сукцинат а х мин –1.

Активность фермента необходимо выразить на белок гомоге-

нат а, который определяют биуретовым методом.

Принцип метода: при взаимодействии ионов с белками обра-

зуется комплекс с пептидными связями, который обладает опти-

ческой плотностью при 540 нм. Окраска пропорциональна коли-

честву белка в пределах 2-10 мг белка.

Реактивы

1. Стандартный раствор бычьего сывороточного альбумина,

содержащий 10 мг белка в 1мл. 2. Биуретовый реактив: (0,15 г

CuSO

x 5H

O и 0,6 г NaKC

натрий-калий виннокислый или

сегнетова соль) растворяют в 50 мл дистиллированной воды, при

энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10 %-ного р-

ра NaОH (свободного от Na

), добавляют 0,1 г KJ и доводят

водой до 100 мл. Хранят в холодильнике.

Техника определения белка в гомогенатах

Для постро ения калибровочного графика берут ряд стеклян-

ных пробирок и подписывают их: 1 — контроль на реактивы; 2 —

0,2 мл стандартного раствора белка (2 мл белка); 3 — 0,4 мл ст. р-

ра б. (4мг); 4 — 0,6 мл ст. р-ра б.(10 мг); 5 — 0,8 ст. р-ра б. (8 мг);

6 — 1 мл ст. р-ра б. (10 мг). В конт роль вносят один мл дист. воды,

в 2 пробирку + 0,8 мл воды; 3 — 0,6 мл. воды; 4 — 0,2 мл воды;

5— 0 мл воды. Затем во все пробирки вно сят по 4 мл биуретового

реактива и инкубируют при комнатной температуре 30 мин. Затем

фотометрируют при 540 нм в кювете с длиной оптического пути

1см. Из опытных проб вычитают значение контрольной пробы и

по изменению Е строят график, откладывая по оси ординат значе-

ния оптической плотности, а по оси абсцисс — значения белка в

мг. Из графика можно получить коэффициент К (Смг/Е). Для на-

шего графика он равен 17,8.

При определении белка в гомогенатах поступают следующим

образом: в контроль добавляют 1 мл дист. воды, в опытные — по

0,1 мл гомогената 1:10 + 0,9 мл дист. воды. Затем во все пробы —

по 4 мл биуретового реактива и далее, как при пост роении колиб-

ровочного графика. Из опытных проб вычитают значение холос-

той пробы (контроль) и по изменению оптической плотности, ко-

торое умножают на коэффициент графика, находят количество

белка в мг в пробе.

Допустим, изменение оптической плотности для белка пече-

ни при 540 нм равно 0,16. При умножении 0,16 на Кгр (17,8) на-

ходим количество белка в 0,1 мл гомогената 1:10 = 2,85 мг.

Определяя активность СДГ , мы вносили 0,005 мл гомогената

1:10, т.е. 0,1: 0,005 = 1/20 часть от 0,1 мл и белок в этой добавке

был также в 20 раз меньше (2,85:20 = 0,14 мг).

Расчет активности СДГ лучше вести на 1 мг белка. Для этого

составляем пропорцию: за 1 мин СДГ окислила 36 нмоль ЯК и

там было 0,14 мг белка, а 1 мг белка окислили бы Х нмоль ЯК.

белка. 1мг 1 минЯК нмоль 14,257

14,0

361

−−•=

•

Контрольные вопросы

1. Биохимические функции мет аллов в организме человека

как микроэлементов.

2. Цианиды. Токсикологическая характеристика. Механизм

действия.

3. Токсичность и механизм действия некоторых газообраз-

ных веществ (СО, NO

, SO

4. Фотохимический смог. Токсикологическая характерис-

тика.

Лабораторная работа № 42 (6 часов)

Определение влияния токсичных органических жидкостей

на физиологические параметры растений

Материалы и оборудование

Чашки Петри.

Растворы, содержащие растворы бутанола, этиленгликоля,

изоамилового спирта в количествах 0,1; 1; 10 ПДК.

Семена ячменя, гороха, редиса.

Ход анализа

1. Поместите в 4 чашки Петри по 13 семян исследуемого ра-

стения.

2. Прибавьте в три чашки по 10 мл растворов с различными

концентрациями тяжелых металлов (0,1; 1; 10 ПДК). В четвертую

чашку добавьте 10 мл дистиллированной воды, она будет служить

контролем.

3. Опыт заложите в т рехкратной повторности.

4. Оставьте чашки на 6 дней для прорастания семян.

5. Учтите длину корней в проросших семенах в мм. Учиты-

вать необходимо самые длинные корни в каждом из семян. По три

проростка в каждой чашке с максимальными отклонениями не

учитываются как случайные.

6. Определите средние значения длины корней. Сравните

полученные значения в опытных чашках с контрольными.

7. Выводы об устойчивости растения к действию токсикант а

оформите в виде таблицы. Для оценки устойчивости растения к

токсиканту вводим индекс устойчивости (Iуст):

(Iуст) 0,1 ПДК = (L1/Lk) · 100 %,

(Iуст) 1 ПДК = (L1/Lk) · 100 %,

(Iуст) 10 ПДК = (L1/Lk) · 100 %,

где L1, Lk — длина корня проростка при воздействии токсиканта

и в контрольном опыте соответственно.

Контрольные вопросы

1. Основные пути проникновения органических веществ в

организм.

2. Токсичные органические жидкости. Дихлорэтан, четырех-

хлористый углерод и другие.

3. Токсичные спирты. Механизм действия на организм чело-

века метанола.

4. Токсичность этиленгликоля, этанола.

5. Превращения и детоксикация токсичных органических ве-

ществ в организме человека.

Лабораторная работа № 43 (6 часов)

Определение влияния токсичных органических веществ

на биохимические параметры растений

В качестве биохимического параметра выберем активность

фермента сукцинатдегидрогеназы в корнях проростков семян яч-

меня до и после обработки токсичными органическими соедине-

ниями.

Материалы и оборудование

Растворы, содержащие бутанол, дихлорэтан, этиленгликоль,

изоамиловый спирт в количествах 0,1; 1; 10 ПДК.

Фотоэлектрокалориметр (ФЭК-2).

Проростки семян ячменя.

Ход работы

Метод определения сукцинатдегидрогеназной активности в

гомогенатах тканей.

Принцип: Сукцинатдегидрогеназа ката лизирует ре акцию:

сукцинат — фумарат + 2Н.

Метод регистрации ферментативной активности основан на

определении скорости падения оптической плотности окисленной

формы 2,6-дихлорфенол-индофенолята натрия (2,6-ДХФИФNa)

при акцептировании им протонов от сукцинат а и переходе в вос-

становленную форму, не имеющую при длине волны 600 нм опти-

ческой плотности. Изменение оптической плотности на 1,°Cоот-

ветствует окислению 60 наномолей сукцината.

Реактивы

1. Фосфатный буфер 0,1 М, рН 7,5: 7,8 г NaH

растворя-

ют приблизительно в 400 мл воды, затем под контролем рН-метра

и интенсивном перемешивании раствора на магнитной мешалке

добавляют гранулы NaOH до установления значения рН 7,5, пос-

ле чего доводят объем до 500 мл. Хранить буфер в холодильнике.

2. NaCN (7мг/2мл дистиллированной воды) нейт рализуют

НСl 2N до рН 7,0–7,5. Этот реагент применяется для блокады ци-

тохромов, которые без блокирования переносили бы электроны и

протоны не на 2,6–ДХФИФNa, а на кислород и тем самым меша-

ли бы определению активности фермента.

3. Феназинметсу льфат (ФМС) 0,02М раствор (8мг/2мл дист.

во ды). Этот реагент является промежуточным акцепторо м электро-

нов и прот онов и облегчает перенос их на 2,6-ДХФИФNa. Ег о гото-

вят в день опре деления активности СДГ и хранят в темной посуде.

4. 2,6-ДХФИФNa — 6мг/10 мл дист. воды. Готовят на неде-

лю работы, хранят в темной посуде. Окисленная его форма имеет

синий цвет, при восст ановлении становится бесцветной.

5. Сукцинат 0,5 М раств ор — 590мг/10мл дист. воды, нейтра-

лизо вать гранулами гидроксида натрия или калия до рН 7,0–7,5.

6. Гомогенат ткани 1: 10, приготовленный на 0,15 М КСl, све-

жеприготовленный, хранить в холодильнике при отрицательной

темпера туре.

Техника определения активности фермента

Состав инкубационной смеси:

фосфатный буфер 0,1М, рН 7,5 .............................................. 0,8 мл

NaCN ......................................................................................... 0,1 мл

ФМС.......................................................................................... 0,1 мл

2,6-ДХФИФNa ........................................................................ 0,05 мл

гомогенат 1 : 10 .................................................................... 0,005 мл

Реакцию после измерения исходной оптической плотности

при длине волны 600 нм в кювете с длиной оптического пути 1 см

запускают сукцинатом...0,05 мл.

Регистрируют время, за которое уменьшится оптическая плот-

ность на 0,1 единицы. Реакцию проводят в термостатируемой

кювете при 30 градусах Цельсия (можно и при 26 ° и при 37 °).

Техника расчета активности сукцинатдегидрогеназы

Допустим, что оптическая плотность инкубационной смеси

снизилась на 0,1 ед. за 10 секунд, за минуту она уменьшилась бы

на 0,1 х 6 = 0,6 ед. Известно, что падение оптической плотности

на 1,0 равно окислению 60 нм субстрата. Отсюда по пропорции

находим, сколько сукцинат а окислилось при изменении оптичес-

кой плотности на 0,6 ед.:

60 нмолей сукцината : 1 = х : 0,6

из пропорции х = 36 нмолей сукцинат а х мин –1.

Активность фермента необходимо выразить на белок гомоге-

нат а, который определяют биуретовым методом.

Принцип метода: при взаимодействии ионов с белками обра-

зуется комплекс с пептидными связями, который обладает опти-

ческой плотностью при 540 нм. Окраска пропорциональна коли-

честву белка в пределах 2–10 мг белка.

Реактивы

1. Стандартный раствор бычьего сывороточного альбумина,

содержащий 10 мг белка в 1 мл. 2. Биуретовый реактив: (0,15 г

CuSO

x 5H

O и 0,6 г NaKC

натрий-калий виннокислый или

сегнетова соль) растворяют в 50 мл дистиллированной во ды, при

энергичном перемешивании приливают туда 30 мл 10 %-ного

NaОH (свободного от Na

), добавляют 0,1 г KJ и доводят во-

дой до 100 мл. Хранят в холодильнике.

Техника определения белка в гомогенатах

1.Для построения калибровочного графика берут ряд стек-

лянных пробирок и подписывают их: 1 — контроль на ре активы;

2 — 0,2 мл стандартного раствора белка (2 мл белка); 3 — 0,4 мл

ст. р-ра белка (4 мг); 4 — 0,6 мл ст. р-ра белка (10 мг); 5 — 0,8 мл

ст. р-ра белка (8 мг); 6 — 1 мл ст. р-ра белка (10 мг). В контроль

вносят один мл дист. воды, в 2 пробирку + 0,8 мл воды; 3 — 0,6 мл

воды; 4 — 0,2 мл воды; 5 — 0 мл во ды. Затем во все пробирки

вносят по 4 мл биуретового реактива и инкубируют при комнат-

ной температуре 30 мин. Затем фотометрируют при 540 нм в кю-

вете с длиной оптического пути 1 см из опытных проб. Вычитают

значение контрольной пробы и по изменению Е строят график,

откладывая по оси ординат значения оптической плотности, а по

оси абсцисс — значения белка в мг. Из графика можно получить

коэффициент К (Смг/Е). Для нашего графика он равен 17,8.

При определении белка в гомогенатах поступают следующим

образом: в контроль добавляют 1 мл дист. воды, в опытные — по

0,1 мл го могената 1:10 + 0,9 мл дист. воды, затем — во все про-

бы — по 4 мл биуретового реактива и далее, как при постро ении

калибровочного графика. Из опытных проб вычитают значение

холостой пробы (контроль) и по изменению оптической плотнос-

ти, которое умножают на коэффициент графика, находят количе-

ство белка в мг в пробе.

Допустим, изменение оптической плотности для белка пече-

ни при 540 нм равно 0,16. При умножении 0,16 на Кгр (17,8) на-

ходим количество белка в 0,1 мл гомогената 1:10 = 2,85 мг.

Определяя активность СДГ , мы вносили 0,005 мл гомогената

1:10, т.е., 0,1: 0,005 = 1/20 часть от 0,1 мл и белок в этой добавке

был также в 20 раз меньше (2,85:20 = 0,14 мг).

Расчет активности СДГ лучше вести на 1 мг белка. Для этого

составляем пропорцию: за 1 мин СДГ окислила 36 нмоль ЯК и

там было 0,14 мг белка, а 1 мг белка окислили бы Х нмоль ЯК.

белка. 1мг 1 мин ЯК нмоль 14,257

14,0

361

−−•=

•

Контрольные вопросы

1. Действие органических веществ на биохимические реак-

ции в организме.

2. Чувствительность и пластичность поведения при воздей-

ствии токсичных органических веществ.

3. Хлорорганические соединения. Их токсичность. М еханизм

действия.

4. Фосфорорганические соединения. Их токсичность. Меха-

низм действия.

5. Ртутьорганические со единения. Токсичность. Механизм

действия.

Лабораторная работа № 44 (4 часа)

Определение токсичности микроскопических грибов

по Н.А.Спесивцевой на простейших

(Paramecium caudatum)

Метод применяется для исследования экстрактов из чистых

ку льтур микромицетов и культуральной жидкости.

Приготовление экстрактов

Культуру грибов выращивают на плотных питательных сре-

дах (МПА, агар Чапека и др.). Пленку гриба отделяют от среды,