Кремлев Е.П. Лабораторный практикум по курсу Экология

Подождите немного. Документ загружается.

с 9 мл физраствора (стерильного), весы, 6 пипеток по 1 мл (сте-

рильных и завернутых в бумагу), 4 пробы почвы, оборудованное

место бактериолога.

Содержание темы

Одним из методов санитарно-гигиениче ской оценки воздуха

закрытых помещений является метод определения его бактериаль-

ной загрязненности. Обс емененность воздуха выражают количе-

ством микробов в 1 м

Методы микробиологического исследования воздуха подраз-

деляют на седимент ационные и аспирационные. Самым простым

и доступным методом, не требующим специа льной аппаратуры,

является седиментационный метод Коха (метод оседания).

Метод Коха. Для определения бактериальной обсемененнос-

ти воздуха закрытых помещений стерильную чашку Петри с плот-

ной питательной средой открывают в местах отбора проб воздуха

и выдерживают в течение 5–30 мин, после чего закрывают, заво-

рачивают в стерильную бумагу и помещают в термост ат в пере-

вернутом виде на 24 ч.

По количеству выросших колоний определяют микробную

обсемененность, исходя из того, что на поверхность питательной

среды площадью 100 cм в течение 5 мин оседает столько микро-

бов, сколько их содержится в 10 л воздуха, учитывая, что каждая

микробная клетка дает начало одной колонии. Зная количество

колоний и время экспозиции, вычисляют количество микробов,

содержащихся в 1 м воздуха.

Этот мет од позво ляет определить и некоторые группы микро-

бов (грибов или др.), имеющих санитарно-гигиеническое значе-

ние (Е, соli / г), е сли в чашках Петри будут находиться специаль-

ные среды (Эндо, Чапека и др.). В таких случаях изучают колонии

и получают чистую ку льтуру.

Более совершенными являются мето д ы инструментального ис-

следования: воздушной ударной среды с помощью аппарата Кро-

това, аспирационные методы, основанные на фильтрации или ас-

пирации (прос асывании) возд уха через специальные фильтры,

стерильные жидкости, индифферентные порошки, адсорбирующие

микрофлору. В аппарате Кротова воздух засасывается через кону-

совидную щель вершиной к центру в крышке из органического

стекла и ударяется о поверхность вращающейся на диске плотной

питательной среды в чашке Петри, причем микроорганизмы рас-

пределяются равномерно по всей среде.

В качестве пит ательной среды

для определения общей микробной

обсемененности используют МПА, а

для определения с анитарно-показа-

тельных микроорганизмов — специ-

альные среды: для выявления золоти-

стого стафилок окк а — моло чно-солевой

или желточно-солевой агар; грибов и

дрожжей — сусло-агар и агар Сабуро;

кишечной па лочки — среду Эндо

(рис. 1). Посевы помещают в термостат

при 37 °С на 24 ч, подсчитывают ко-

личе ство колоний. Зная количе ство

литров пропущенного воз духа, опреде-

ляют общую микробную обсемененность воздуха помещения. Бо-

лее достоверные результаты получают, когда через сутки инкуби-

рования в термостате посевы выдерживают сутки при комнатной

температуре. Результаты заносят в т аблицу.

Бактериологическое исследование воздуха

Рис. 1. Рост колоний кишечной

палочки на мембранных филь-

трах в чашках со средой Эндо

Метод

исс ледования

Время посева

или объем воздуха

Количество

колоний

Результат

(микробно е число)

По Коху

По Кротову

По Коху: на столах открывают чашки Петри с МПА на 5 или

10 мин, затем делают надписи, заворачивают в бумагу, помещают

в термостат в перевернутом виде.

По Кротову: чашки Петри с МПА помещают в аппарат Кро-

това, включают, записывают показатель количества засасываемо-

го воздуха в 1 мин, время работы аппарата, после чего чашки вы-

нимают и делают записи на чашке или бумаге: время работы

аппарата, количество л/мин пропускаемого воздуха, фамилию ис-

полнителя. Чашки помещают в термостат вверх дном.

Окончательные результаты получают после инкубирования в

термостате, подсчета колоний и заполнения таблицы; оценивают

обсемененность воздуха (см. табл.).

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха

Общее

микробное

число —

количество

микробов

(аэробы,

мезофилы,

гетеротрофы)

в 1 м

воздуха

1) метод оседания (с едиментационный метод Коха): чашку

Петри с питательной средой (МПА, агар Сабуро, агар Эндо)

открывают в местах отбора проб воздуха и выдерживают в

течение 5–30 мин, после чего закрывают, заверт ывают в

стерильну ю бу магу и помещают в термостат в перевернутом

состоянии на сутки, затем по количеству выросших колоний

подс читывают общее микробное число воздуха, по льзуясь

правилом Омельянского, в соответствии с которым на

поверхность агара в чашке Петри (S =100 см

) в течение

5 мин оседает столько микробов, сколько их содержится в

10 л воздуха;

2) метод ударной струи воздуха при помощи аппарата

Кротова (аспирационный метод): воздух засасывается через

конусную щель в крышке из оргстекла, ударяется о

поверхность вращающейся на диске среды в чашке Петри,

на которой равномерно располагаются микробы, затем

пос евы помещают в термостат (Т = 37 °С) на 24–48 ч и

подс читывают ко личество колоний на агаре чашек Петри.

Зная количество пропущенного воздуха (л/мин) и время

(мин), определяют общее микробно е число.

Показатели

микробной

обсеменен-

нос ти

Методы санитарно-микробиологического

исс ледования воздуха

3) мембранный метод: определенный объем воздуха

пропускают через фильтрующие мембраны, зате м фильтры

накладывают на поверхность плотной питательной среды в

чашке Петри, культивируют в термостате и подс читывают

количество колоний микробов;

4) фильтрационный метод Дьякова: определенный объем

воздуха пропу с кают через стерильную питательную среду

(МПБ), затем 1 мл вносят в чашку Петри, заливают

расплавленным и охлажденным до 45 °С МПА,

перемешивают и помещают в термостат (Т = 37 °С) на 2

су ток и подсчитывают количество колоний микробов;

Определение санитарно-по казательных

микробов — зеленящих и гемолитических

стрептококко в и гноеродных стафилококков,

пос тоянных обитателей ВДП человека и

животных

Применяют те же 3 метода,

но посев осуществляют на

специальную питательную

среду — кровяной МПА

Рис. 2. Внешний вид прибора для бактериологического анализа воздуха (аппа-

рат Кротова): 1 — вентиль ротаметра; 2 — ротаметр; 3 — накидные замки; 4 —

диск вращающийся, 5 — крышка; 6 — диск; 7 — клиновидная щель; 8 — кор-

пус; 9 — основание

ГОСТ воздуха — оценка

его санитарного состояния по микробиологическим показателям

(по З.Н.Кочемасовой и др., 1987)

Лето Зима

№ п/п

Категория воздуха

Общее

микробное

число

(количество

всех микробов

в 1 м

воздуха)

В том числе

зеленящег о и

гемолит ического

стрептококко в и

гноеродного

стафилококка

Общее

микробное

число

(количество

всех микробов

в 1 м

воздуха )

В том числе

зеленящег о и

гемолитического

стрептококков и

гноеродного

стафилококка

Чистый

1500 16 4500 36

Загрязненный

2500 36 7000 124

Лабораторная работа № 22 (8 часов)

Бактериологическое исследование почвы

Роль микробов в формировании почвы велика, поэтому она

приобрела свойства живой системы. В почве встречаются водо-

росли, грибы плесневые и базидиомицеты, актиномицеты, бакте-

рии. Максимальное количество микробов находится неглубоко, в

пределах 10–30 cм, в верхнем слое (1–5 см) микробов очень мало,

после 20 cм и глубже их еще меньше, а на глубине 2–3 м встреча-

ются единичные, что необходимо учитывать при взятии проб по-

чвы для исследования.

В зависимости от количества микробов почвы подразделяют

на малоплодородные, среднеплодородные и высокоплодородные,

содержащие биомассы, соответственно, 3–5 т/га, 5–10 т/га, свыше

10 т/га. В связи с этим микроорганизмов в 1 г почвы может быть

от нескольких десятков тысяч до нескольких миллиардов и даже

десятков миллиардов (скотомогильники и др.).

Основным показателем, характеризующим загрязненность

почвы органиче скими веще ствами, является микробное число.

Чистыми считают почвы, когда микробное число их не превыша-

ет 1–15 млн. особей в 1 г, сильно загрязненными — 3–5 млн/га.

Почву подвергают исследованию с целью установления при-

годности данного участка для строительства жилья, помещений

для животных, а также для контроля за обезвреживанием органи-

ческих удобрений и др. На обследуемой территории до 1000 м

определяют два участка по 25 м, стерильным инструментом сни-

мают верхний слой и с глубины 20 cм берут пробы почвы по 200–

300 г, тщательно перемешивают, помещают в стерильную посуду,

маркируют, в сопроводительной указывают, какие исследования

необходимо провести, после чего доставляют в лабораторию. Срок

хранения проб в бытовом холодильнике — до суток.

Полное санитарно-бактериологическое исследование вклю-

чает определение:

1) общего числа сапрофитных бактерий (микробного числа);

2) бактерий группы кишечной палочки;

3) количества анаэробов (Сl. perfringens);

4) термофильных микроорганизмов, определяющих характер

загрязнения (навоз, фекалии, сточные воды, жидкости).

Кроме того, при необходимости проводят специальные ис-

следования с целью выделения патогенных микроорганизмов —

зоонозов и зооантропонозов (антропозоонозов).

Определение микробного числа проводят так же, как при ис-

следовании воды, с той лишь разницей , что 1 г почвы помещают

первоначально в определенный (9 мл) объем стерильной воды или

физраствора и далее приготавливают десятикратные разведения.

Загрязненность почвы бактериями кишечной палочки уста-

навливают с помощью среды Кесслера. Среда Кесслера: 1 л дис-

тиллированной воды, 10 г пептона, 50 мл бычьей желчи, 2,5 г лак-

тозы, 4 мл 1 %-ного раствора генцианвио лета. Стерилизуют дробно

после разлива в пробирки по 8–12 мл с поплавками. Посевы про-

изводят из различных разведений в зависимости от степени мик-

робной обсемененности почвы, инкубируют 2 суток в термостате

при 43 °С, затем высевают на среду Эндо в чашках Петри с целью

обнаружения красных колоний через 1–2 суток. Наибольшее раз-

ведение, в котором обнаружена ферментация лактозы с наличием

газа в поплавке, соответствует коли-титру почвы.

Другие исследования проводят по специальным методикам

(см. табл.), например, выделение Сl, perfringens.

Санитарно-микробиологиче ское исследование почвы

Показатели

микробной

обсемененности

Методы санитарно-микробиологического исследования почвы и

навоза

1 2

Общее микробное

число —

количество

микробов (аэробы,

мезофилы,

гетеротрофы) в 1 г

почвы

Отбираю т пробы почвы на глубине 10 см массой по 200 г, затем

из 1 г подготовленной почвы готовят 10-кратные разведения на

стерильной водопроводной воде (1:10–1:1000000000), исследуют

при помощи метода Коха в чашках Петри с мясо-пептонным

агаром (Т = 37 °С)

Определение

санитарно-

показательных

микробов —

кишечной палочки

(определение

коли-титра)

Различные 10-кратные разведения суспензии почвы

засевают отдельными стерильными пипетками в пробирки с

дифференциальной средой Кесслера и инкубируют 48 ч при

43 °С, затем из пробирок с газообразованием делают посев

штрихом на агар Эндо в чашках и культивируют сутки в

термостате при Т = 37 °С, красные колонии, выросшие на агаре,

являются эшерихиями, из них готовят мазки, красят по Граму.

Определение

санитарно-

показательных

микробов —

анаэробных

клостридий

(Closlridium

perfringens),

т.е. определение

перфрингенс-титра

Отбирают пробы почвы на глубине 10 см массой по 200 г, затем

из 1 г подготовленной почвы готовят 10-кратные разведения на

стерильной водопроводной воде (1:10–1:1000000000), исследуют

при помощи метода Коха в чашках Петри со средой Китга-

Тароцци или агаром Вильсона-Блэра, инкубируют 24–48 ч в

термостате при Т = 43 °С. На агаре Вильсона-Блэра растут

клостридии в глубине среды, образуя черные колонии

(восстанавливается сернистое железо) и разрыв плотной среды

из-за газов.

1 2

Определение коли-

чества термофиль-

ных микробов в 1 г

почвы (для выявле-

ния характера загря-

знений почвы (наво-

зом, стоками, ком-

постом, фекалиями)

Отбираю т пробы почвы на глубине 10 см массой по 200 г,

затем из 1 г подготовленной почвы готовят 10-кратные

разведения на стерильной водопроводной воде

(1:10–1:1000) и исследуют при помощи метода Коха

в чашках Петри с мясо-пептонным агаром (Т = 43–50°С)

Определение коли-

чества протейных

палочек в 1 г почвы

(для выявления

фекальных

загрязнений почвы)

10-кратные разведения суспензии почвы на стерильной

водопроводной воде (1:10–1:10000) исследуют

при помощи метода Шукевича: вносят по 1 мл разведения

в конденсационную воду свежескошенного МПА,

48 ч при Т = 37 °С

Определение пато-

генных микробов –

возбудителей сибир-

ской язвы, ботулиз-

ма, столбняка,

сальмонеллезов и

др. (проводится при

необходимости)

Различные 10-кратные разведения суспензии почвы

засевают отдельными стерильными пипетками в пробирки

или чашки Петри со специальными и дифференциально-

диагностическими средами с последующей идентификацией

выделенных чистых культур возбудителей болезней, включая

биопробу и серологический метод исследования

Каче ственный и количественный со став микрофлоры в

объектах внешней среды (воде, воздухе, почве и навозе) приве-

ден в т аблице.

Качественный и количественный состав

микрофлоры объектов внешней среды

Процентное содержание микробов в объектах внешней среды

Группы

микробов

в почве в навозе в воде в воздухе

1 2 3 4 5

Бактери и

10 %

(Echerichia coli,

термофилы и др.)

87 %

(Echerichia coli,

термофилы и др.)

63 %

(микрококки,

сарцины,

псевдомонады)

50–67 %

(микрокок-

ки, сарцины

и др.).

Бациллы

50 %

(Bacillus subtilis,

Clostridium)

5 % 10 %

5–15 %

(сенная

и карто-

фельная

бациллы)

Актиномицеты

10 % (весной)

15 % (осенью)

1 % — 3 %

Спирохеты 1–2 % 3 % 2–4 % —

Окончательную оценку микробной обсемененности дают в

соответствии с показателями ГОСТа (см т аблицу).

ГОСТ почвы — оценка ее

санитарного состояния по микробиологическим показателям

(по З.Н. Кочемасовой и др., 1987)

1 2 3 4 5

Плесени

7 %

(на севере Pen.,

Muc.)

2 % 3 %

20 %

(Мисor,

Asp.,Pen.).

Дрожжи и

кандиды

1,0 % 1 % 0,5 % 2 %

Вирусы 1–2 % (бактериофаги, энтеровирусы) 0,5 % 1 %

Простейшие

(амебы и др.)

5 % 1 % 10 % —

Растения

(водоросли)

10 % — 5 % —

Общее

содержание

всех микробов

в единице

объема

или массы

конкретного

объема

внешней среды

В 1 г почвы

содержится

от 1 млрд. до 25

млрд. в

зависимости от

химического

состава почвы, ее

влажности и

температуры,

расположения

почвы по

отношению к

поверхности, а

также климата и

времени года

В 1 г навоза

содержится

от 1 до 90 млрд.

микробов в

зависимости от

температуры,

аэрации, срока и

способа хранения:

аэробное

хранение —

90 млрд.,

анаэробное —

33 млрд; аэробно-

анаэробное —

17 млрд.

В 1 мл воды

находится от

10 до 1 млрд.

микробов в

зависимости от

сапробной зо-

ны воды:

1)олиго-

сапробная 10–

1000; 2) мезо-

сапробная:

1000–100000;

3) полисапроб-

ная:100000 —

1000000000.

В 1 м

воз-

духа нахо-

дится от 3 до

120000 мик-

робов в зави-

симости от

времени года

и места: 3–5

(тайга, лес,

поле), 4000–

10000 (го-

род), 200

(парк горо-

да), 1000

(молокоза-

вод), 120000

(птичник).

№

п/п

Категория

почвы

Общее

микробное

число,

млн/г

Коли-титр,

Перфрингенс-

титр / г

Количество

термофилов,

тыс/г

1 Чистая Менее 2 Более 1,0 Более 0,1 Менее 10

Слабо

загрязненная

2,0–2,4 1,0–0,01 0,1–0,001 10–90

Умеренно

загрязненная

2,5–3,0 0,01–0,001 0,001–0,0001 100–900

Сильно

загрязненная

Более 3 Менее 0,001

Менее 0,0001 1000 и более

Контрольные вопросы

1. Какие методы использу ют для определения микробной

обсемененности воздуха?

2. Каковы критерии санитарной оценки воздуха в зависимо-

сти от режима?

3. Что такое коли-титр почвы?

4. Какая почва считается загрязненной?

Лабораторная работа № 23 (8 часов)

Санитарно-бактериологическое исследование молока

и молочных продуктов

Цель занятия

Освоить санитарно-бактериологические методы оценки ка-

чества молока и молочных продуктов.

Материалы и оборудование

Пробы молока свежего, сомнительного качества, пастеризо-

ванного, творога, сметаны, кефира, ацидофилина хорошего и со-

мнительного качества, 4 комплекта по 6 пробирок с 9 мл стериль-

ной воды или физраствора, чашки Петри, пробирки с МПА по

12–15 мл, 4 комплекта по 6 пробирок со средой Кесслера, 4 комп-

лекта градуированных пипеток по 1,2 мл без «мертвого» простран-

ства, растворы метиленового синего (голубого) для редуктазной

пробы резазурина, молочный и сусло-агар.

Содержание темы

Для бактериологического исследования по сле тщательно-

го перемешивания в стерильную колбу отбирают 200–500 мл

молока.

Методы определения общего количества микробов в моло-

ке подразделяются на косвенные и прямые. Ко свенные методы

микробной обс емененно сти о снованы не на уст ановлении ко-

личе ства микробов в 1 мл, а на выявлении некоторых продук-

тов обмена микробных клеток, так как имеет ся прямая зависи-

мость: чем больше микробов, тем больше продуктов обмена

(редукт азы). Прямые методы включают спо собы определения

микробов в определенном объеме молока, основанные на по с еве

в плотную питательную среду с целью получения от каждой

микробной клетки колоний и их подсчет а.

Каждый из этих методов, кроме положительных факторов,

имеет и недостатки. Так, косвенные улавливают всю имеющуюся

редуктазу, тогда как микробная обсемененность составляет ее оп-

ределенную часть; метод прямого подсчета т рудоемкий, т ребует

определенного оборудования (счетные камеры, камера Вольфлю-

геля для счета колоний, счетчики и др.), методы пос ева улавлива-

ют только количество живых микроорганизмов.

Микробная редуктаза (анаэробная дегидрогеназа) — экзофер-

мент, выделяемый микроорганизмами в процессе жизнедеятель-

ности, способный обесцвечивать краски в молоке и восстанавли-

вать его первоначальный цвет.

Косвенные методы определения

микробной обсемененности молока

Пробы с метиленовым голубым. Вначале приготавливают

рабочий раствор метиленового голубого для редуктазной пробы,

для чего берут 195 мл дистиллированной воды и 5 мл насыщенно-

го спиртового раствора краски, т.е. 0,025 %-ный раствор. Для ус-

коренной редуктазной пробы раствор разбавляют еще в 10 раз.

Техника постановки

В пробирки Ру наливают 1 мл рабочего раствора краски и

20 мл молока или в бактериологические пробирки (150–15 мм),

соответственно, 0,6 и 10 мл, закрывают резиновой пробкой, тща-

тельно перемешивают неоднократным осторожным переворачи-

ванием пробирок и вращением их между ладонями, затем ставят

их в водяную баню или термост ат при 38–40 °С. Учет результатов

проводят через 20 мин, 3 ч и 5 ч 30 мин. В зависимости от време-

ни обесцвечивания красителя молоко подразделяю т на классы. Хо-

рошее — 1-й класс — про должительность об есцвечивания — свыше

5 ч 30 мин, количество микробов в 1 мл молока менее 500 000.

Далее, соответственно: 2-й класс — удовлетворительное — свыше 2 ч

до 5 ч 30 мин, количество микробов — от 500 000 до 4 млн.; 3-й

класс — плохое — свыше 20 мин до 2 ч, от 4 млн. до 20 млн.; 4-й

класс — очень плохое — до 20 мин —20 млн. и выше.

Для постановки уск оренной редуктазной пробы к 10 мл моло-

ка добавляю т 1 мл раствора метиленового го лубог о в 10-кра тно м

разведении. Т е хника постановки такая же. Одновременно ставят