Хаитов P.M., Игнатьева Г.Л. Иммунология

Подождите немного. Документ загружается.

4.4. Гены иммуноглобулинов

Индивидуальный организм здорового человека в течение жиз-

ни создает несколько миллионов вариантов антител по спо-

собности связывать разные антигены (потенциально

ан-

тигенов). Никакой геном физически не несет столько отдель-

ных структурных генов. Наследуемое от родителей количество

генетического материала (ДНК), предназначенного для про-

граммирования биосинтеза антител, не так уж и велико —

всего 120 структурных генов. Это наследуемое множество ге-

нов называют зародышевыми генами иммуноглобулинов, или

зародышевой конфигурацией (germline configuration).

Разнообразие генетических кодов для миллионов вариан-

тов вариабельных участков молекул иммуноглобулинов фор-

мируется в течение всей жизни в процессе дифференцировки

R-лимфоцитов:

в каждом отдельном В-лимфоците осуществ-

ляется своя уникальная рекомбинация ДНК из зародышевых ге-

нов, и трансляция РНК, и последующий синтез белка уже

идут с персонального для каждого В-лимфоцита генетического

кода V-области.

Феномен рекомбинации ДНК β соматических клетках, по

крайней мере насколько известно современной науке, строго

уникален исключительно для лимфоцитов. Подобного никто

не наблюдал не только при дифференцировке каких-либо

других клеток млекопитающих, но даже и каких-либо клеток

иных эукариот. Соматическая рекомбинация ДНК «ниспосла-

на» только генам антигенраспознающих молекул лимфоци-

тов — иммуноглобулинов в В-лимфоцитах и рецептора Т-кле-

ток для антигена в Т-лимфоцитах.

Этот уникальный процесс генерации разнообразия анти-

генраспознающих молекул внутри организма понадобился для

того, чтобы многоклеточные сумели выжить под инфекцион-

ным давлением разнообразных земных микроорганизмов. Мле-

копитающие эволюционируют так медленно, что человеку

трудно это даже представить. Микроорганизмы, наоборот,

эволюционируют в считанные дни — недели. Так вот, лимфо-

циты — специальное уникальное творение природы внутри

организма многоклеточных с неслучайной, но запрограмми-

рованной изменчивостью только в генах антигенсвязывающих

молекул

(Ig,

TCR) в количественном отношении хоть в ка-

кой-то мере сопоставимы с разнообразием микробов. Разно-

образие это столь велико (например, относительно общего

числа клеток в организме млекопитающего), что механизм

генерации разнообразия соответствующих структурных генов

мог быть (и стал) в основе запрограммированно случайным.

Свойство случайности при рекомбинации соответствующей

ДНК объясняет тот широко известный факт, что иммунная

система «в лице» лимфоцитов распознает разные вещества, а

не только инфекционные микроорганизмы. В естественных

природных условиях инфекционные микроорганизмы в боль-

шей мере, чем другие внешние объекты, способны проры-

ваться сквозь барьерные ткани многоклеточных. Если покров-

ные ткани «подтекают», т.е. в силу каких-либо патологичес-

ких причин, например, барьеры ЖКТ или слизистые оболоч-

ки дыхательной системы пропускают лишнее из пищи или

вдыхаемого вещества, то лимфоциты распознают и реагиру-

ют на пищевые и ингаляционные антигены. Но вот к чему

природа не готовила иммунную систему, так это к быстрому

внедрению непосредственно во внутреннюю среду, минуя

барьерные ткани, чужеродных веществ. Это чисто антропоген-

ные деяния по парентеральным введениям, вливаниям чужой

крови, трансплантациям органов. Мы разберем в дальнейшем,

что, например, трансплантат чужого органа организм реци-

пиента отторгает, как это не покажется странным, но по

ошибке, которую совершают примерно

1—10

ТЧлимфоци-""

тов7

они

ириниматрт~антигены

тов7

они

ириниматртантигены

главн^оТШмпле!хаТйстосотг

/меетимости

на ЧУЖИХ

клетд«ж~тртасТшштата

за

свои.

Бели

бы"

всё~100

а не 90 % Т-лимфоцитов никогда не ошибались,

то чужая почка, печень, кожа, кровь и т.п. оставались бы

«невидимыми» для иммунной системы.

^"~ Примерно 20 лет назад еще методами классической био-

химии, а именно аналитическим электрофорезом фрагменти-

рованной ДНК, обнаружили, что генетический материал для

кодирования белков-иммуноглобулинов структурирован («ра-

зорван») на сегменты, расположенные друг относительно

друга на уловимом расстоянии. Во всех клетках тела, включая

стволовую кроветворную, кроме начавших дифференцировку

В-лимфоцитов, гены иммуноглобулинов навсегда остаются в

«разорванном» состоянии, которое называют зародышевой

конфигурацией. И только в В-лимфоцитах на самом раннем

этапе их специальной дифференцировки начинается сложный

генетический процесс объединения сегментов ДНК, предназна-

ченных для кодирования разных частей молекулы иммуногло-

булина — V- и С-фрагментов, причем по отдельности для

каждой из 3 типов полипептидных цепей — двух типов лег-

ких (к и λ) и тяжелой. Это и есть феномен рекомбинации ДНК

в соматической клетке. Этот феномен открыли S.Tonegava и

его коллеги (1975—1976) при электрофорезе ДНК, выявив-

шем разницу во фрагментах рестрикции

ДНК

из антитело-

продуцирующих В-лимфоцитов и из любых других не проду-

цирующих антитела клеток данного организма (зародышевая

конфигурация).

Структура генов иммуноглобулинов подробно изучена (рис.

4.3 и 4.4). Отдельные сегменты молекулярно клонированы, оп-

ределено их число. Кодирующая ДНК для вариабельной час-

ти каждой из цепей иммуноглобулина собирается из

сегмен-

мИНИди Щ

L J

Перестройка ДНК

VJ-сегментов;

Транскрипция:

Зародышевая

конфигурация

ДНК генов

L—цепи

Перестроенная

ДНК

Первичный

-ААА РНК-транскрипт

Сплайсинг первичного транскрипта РНК:

ААА

мРНК

Трансляция белка

L-цели-

L-Цепь иммуноглобулинов

Рис.

4.3. Структура генов легкой (L) цепи иммуноглобулинов (схема).

У человека

1 - 27

JΜ

1 - 6

H51

, C,

c.,

C, C

У мыши

^ГЗ

Cγ!

Рис.

4.4. Структура генов тяжелой (Н) цепи иммуноглобулинов (схема).

IgM

на lgG3

IgM

на IgA

Рис.

4.5. Рекомбинация ДНК при переключении синтеза классов имму-

ноглобулинов в В-лимфоците.

тов, извлекаемых из трех отдельных кластеров: собственно V

(вариабельный) (код для 95—101 аминокислоты), а также D

(diversity — разнообразие) у тяжелых цепей и J (joining ~

связующий) (код для нескольких аминокислот — до 13). Пе-

реключение синтеза изотипов иммуноглобулинов показано на

рис. 4.5. Гены для

к-цепи

локализованы в хромосоме 2,

гены

для

λ-цепи

— в хромосоме 22, гены для тяжелых цепей всех

изотипов — в хромосоме 14 (табл. 4.1).

Молекулярные генетики группируют сегменты

V-генов

несколько семейств. В одно семейство включают

гены,

в ко-

торых более 80 % последовательности нуклеотидов гомологич-

ны. Выделяют 7 семейств

V,,,

7 семейств

8 семейств

Таблица 4.1. Число сегментов генов вариабельных областей имму-

ноглобулинов человека*

Кластер

сегментов

Легкие цепи

Нет

«30

Нет

Тяжелая цепь

=50

=30

* Поскольку

метод

молекулярного клонирования трудоемок и его вы-

полняют всякий раз для конкретного индивидуального генома, разумно до-

пустить, что у отдельных индивидуумов конкретное число сегментов может

варьировать, но в узких пределах; также разным может быть число псевдо-

генов.

Считают, что члены одного семейства произошли от одного

древнего гена путем дупликаций.

Рекомбинацию ДНК иммуноглобулинов катализируют спе-

циальные ферменты —

рекомбжазы.

Эти же ферменты ката-

лизируют рекомбинацию ДНК генов TCR в Т-лимфоцитах,

т.е. рекомбиназы — уникальные ферменты лимфоцитов. Но в

В-лимфоцитах эти ферменты не «трогают» гены TCR, а в Т-

лимфоцитах не «трогают» гены иммуноглобулинов. Следова-

тельно, до начала процесса перестройки ДНК в клетке уже

существуют генрегуляторные протеины — свои у Т-лимфоци-

гпов и свои у

В-лимфоцитов.

Гены, кодирующие эти белки,

называют мастер-генами. Они в большей степени воображае-

мые, чем изученные, но являются реальным объектом иссле-

дования фундаментальной науки. Субстратом для рекомбиназ

служат определенные последовательности нуклеотидов в ДНК

генов-мишеней (кстати, одинаковые у Т- и В-лимфоцитов).

Эти последовательности фланкируют (т.е. расположены с ка-

кого-либо края) каждый отдельный сегмент генов-мишеней

и их называют сигнальными для рекомбинации (rss — recom-

bination signal sequence). Rss расположены с З'-конца V-сегмен-

тов, с 5'-конца J-сегментов и с обеих сторон D-сегментов.

Последовательность нуклеотидов в rss расшифрована: консер-

вативный гептамер CACAGTG, затем вариабельный спейсер

из 12 или 23 нуклеотидов и консервативный нонамер

ACAAAAACC/GGTTTTTGT.

Самый первый акт расщепления цепи ДНК осуществляют

два других специальных фермента лимфоцитов — гетеродимер-

ные эндонуклеазы, кодируемые генами, называемыми RAG-1 и

RAG-2

(recombination-activating genes). Последовательность нук-

леотидов в гене RAG-1 подобна таковой в гене дрожжей

HRP-1 и в генах топоизомераз бактерий, катализирующих

разрывы и сшивки ДНК, что свидетельствует о «глубинном»

единстве всего живого. Но среди клеток млекопитающих RAG-1

и RAG-2

экспрессируются

только в лимфоцитах. Репарацию

разрывов ДНК катализируют по крайней мере 3 ядерных

фермента: один называют аутоантигеном

Ки,

второй — ДНК-

зависимой протеинкиназой, третий еще недостаточно охарак-

теризован.

У мышей с генетическим нокаутом по любому из генов

ферментов, участвующих в перестройке ДНК антигенрецеп-

торных молекул

(Ig,

TCR), лимфоциты не развиваются со-

всем и имеется клинический синдром тяжелой комбинирован-

ной иммунной недостаточности — scid (severe combined

immunodeficiency).

В результате данной реакции рекомбинации в непрерывную

последовательность ДНК соединяются по одному сегменту из

V-, D- и J-областей — этот процесс называют

VDJ-рекомби-

нацией. Вся остальная ДНК

V-,

D- и J-областей вырезается и

выбрасывается из генома в виде кольцевых ДНК. Поэтому

приобретение В-лимфоцитом в начале своей дифференциров-

ки специфичности по потенциальному антигену происходит

раз и навсегда и строго необратимо на уровне ДНК.

В каждом единичном В-лимфоците случается своя уникаль-

ная комбинация VDJ для тяжелой цепи и VJ — для каждой

из легких цепей. Таким образом и подсчитали возможное чис-

ло вариантов антител по антигенной специфичности, исходя

из правил случайной комбинаторики. Для

/с-цепи

из 40 V-

сегментов и 5 J-сегментов может получиться 40x5 = 200 ва-

риантов V-области

к-цепи;

для

λ-цепи

— 30x4 = 120 вари-

антов; всего для легких цепей 320 вариантов; для тяжелой

цепи 50V х 30D х 6J

9000 вариантов антигенсвязывающих

областей тяжелых полипептидных цепей. В цельной молекуле

иммуноглобулинов разные легкие и тяжелые цепи объединя-

ются в тетрамер также случайным образом (по крайней мере

теоретически). Число случайных сочетаний из 320 и 9000 —

около ЗХ10

Но это не все, что обеспечивает разнообразие антигенсвя-

зывающих областей антител. Есть еще два молекулярных про-

цесса: запланированная неточность связи сегментов V-D-J и

запланированный гипермутагенез именно в

V-генах

иммуногло-

булинов. Последнее свойство — гипермутагенез — отличает

гены

иммуноглобулинов даже от генов TCR: у TCR есть и

комбинаторика сегментов, и неточность связи V-D-J, но не

выявлен гипермутагенез.

Под неточностью связи V-D-J понимают тот факт, что при

формировании этих связей происходит добавление лишних

некодируемых наследуемым генетическим кодом нуклеотидов.

Их два «сорта»: Р-нуклеотиды и N-нуклеотиды. Нуклеотиды

Ρ (от palindromic sequences) возникают на концах сегментов

при вырезании одноцепочечных петлей ДНК и «достройки

хвостов» ферментами репарации ДНК. Нуклеотиды N (от non-

template-encoded) пристраиваются к одноцепочечной ДНК

после вырезания петли специальным ферментом лимфоци-

тов — терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой

(TdT).

Этот фермент достраивает от 1 до 20 дополнительных нукле-

отидов, а ферменты репарации подстраивают комплементар-

ные пары и лигируют (ковалентно продольно состыковыва-

ют) двухцепочечную «пристройку» ДНК с двухцепочечными

Р-нуклеотидами. TdT экспрессируется недолго и на ранних

стадиях дифференцировки В-лимфоцитов. Поэтому N-нуклео-

тиды характерны для тяжелых цепей, поскольку гены тяже-

лых цепей перестраиваются в первую очередь. Гены легких

цепей перестраиваются во вторую очередь и в них N-нуклео-

тидов уже не находят.

«Платой» за эти попытки увеличить разнообразие антиген-

связывающих областей антител, таким образом, является то,

что в

случаев добавление некодируемых нуклеотидов сдви-

гает рамку считывания в матричной (м) РНК так, что транс-

ляция белка становится невозможной. Это называют непродук-

тивной рекомбинацией генов иммуноглобулинов. Зато с учетом

присоединения N- и Р-нуклеотидов число пар V-генов от

тяжелой и легкой цепей достигает около 3500 и число вари-

антов антигенсвязывающих областей цельных молекул имму-

ноглобулинов, получающихся только в результате комбинато-

рики сегментов при перестройке ДНК, оказывается порядка

. Если учесть врожденные варианты V-, D- и J-сегментов,

то мыслимое разнообразие и составляет около 10

, но реаль-

но меньше, так как в организме нет такого количества лим-

фоцитов.

Гипермутагенез, процесс возникновения точечных мутаций,

происходит не под случайным воздействием космических ча-

стиц. Он запланирован и имеет место не во время лимфопо-

эза В-лимфоцитов в костном мозге, а во время иммуногене-

за (т.е. после реально состоявшегося распознавания антигена

и начавшегося иммунного ответа) и локализован в лимфоид-

ных фолликулах периферических лимфоидных органов и тка-

ней (лимфатических узлах, селезенке, NLT). (Мы вернемся к

его рассмотрению в соответствующем разделе.) Отметим толь-

ко, что именно гипермутагенез генов V-области иммуногло-

булинов и отбор В-лимфоцитов по силе связи

Ig-рецептора

с антигеном являются механизмом возрастания аффинности

антител по мере прогрессивного развития так называемого

вторичного иммунного ответа. Интенсивность гипермутаций в

V-Ig

в В-лимфоцитах оценивают как замену одного нуклео-

тида из 1000 на один митоз: каждый второй В-лимфоцит

клона в зародышевом центре приобретает точечную мутацию

в V-Ig. Для всей остальной ДНК явление точечной мутации

реализуется с частотой на 9 порядков ниже, т.е. одна замена

нуклеотида на 10

пар нуклеотидов на митоз.

Процессы перестройки генов иммуноглобулинов в В-лим-

фоците отрегулированы так, что из двух родительских хромо-

сом в конечном счете в одном В-лимфоците будет использо-

ван только единственный вариант как легкой, так и тяжелой

цепи. Это явление называют

амелъным

исключением. А в орга-

низме в целом разнообразие удвоено — половина от «мамы»,

половина от «папы».

Описанные генетические механизмы генерации разнообра-

зия антигенсвязывающих областей антител имеются у чело-

века и мышей. У животных других видов есть иные молеку-

лярные механизмы. Например, у птиц, а также у некоторых

млекопитающих (кроликов, овец) нет разнообразия зароды-

шевых сегментов в V-области. Поэтому первично перестроен-

ные гены иммуноглобулинов одинаковы у всех незрелых В-

лимфоцитов. Такие В-лимфоциты у птиц мигрируют из кост-

ного мозга в специализированный орган — сумку Фабрициу-

са, где они интенсивно пролиферируют. В процессе митозов

в уже перестроенных генах V-области создается разнообразие

по механизму, называемому конверсией генов: фрагменты ДНК

из перестроенной V-области одной из гомологичных хромо-

сом обмениваются на фрагменты из неперестроенной и ра-

нее не использованной V-области второй из гомологичных

хромосом. У овец, например, наибольший вклад в разнооб-

разие антигенсвязывающих областей антител вносят сомати-

ческие мутации, и процесс их накопления локализован в

пейеровых бляшках подвздошной кишки.

Структурные гены константных частей полипептидных це-

пей иммуноглобулинов расположены в тех же хромосомах,

что и V-, D- и J-гены, «ниже по течению», т.е. к З'-концу

от J-сегментов. Для легких

к-

λ-цепей

существует по одно-

му С-гену -

Ск

и CΑ. «Стыковка» нуклеотидного кода для V-

и С-частей легких цепей происходит на уровне не ДНК, а

РНК — по механизму сплайсинга первичного транскрипта

РНК.

Для каждого изотипа иммуноглобулинов есть свой отдель-

ный

С-ген.

У человека такие гены расположены в следующем

порядке, считая от J-сегмента к З'-концу:

Cμ,

Сз,

з,

еСе

(псевдоген е-цепи),

C«i,

С«2;

у мыши: Cμ,

Сб,

СуЗ,

Cyl,

Су2Ь,

Су2а,

Се,

Cα.

Завершившие лимфопоэз, В-лимфоциты любого клона по

антигенной специфичности (специфичности V-области имму-

ноглобулина) экспрессируют иммуноглобулины только клас-

сов Μ и D. При этом мРНК транскрибируется в виде непре-

рывного транскрипта с перестроенных генов

VDJ

Cμ—С

При этом ДНК остальных С-генов других изотипов цела и не-

вредима. В результате альтернативного сплайсинга первичного

транскрипта РНК образуются мРНК отдельно для тяжелых

цепей

IgM

IgD,

которые и транслируются в белок. Этим

процессом заканчивается полноценный лимфопоэз В-лимфо-

цитов.

Переключение же на синтез иммуноглобулинов других изо-

типов (G, Е, А) происходит уже в процессе развития им-

мунного ответа, т.е. после распознавания антигена и под воз-

действием определенных (в значительной мере известных на

сегодня) цитокинов Т-лимфоцитов и молекул клеточной

мембраны Т-лимфоцитов (CD40L). Существенно, что такое

переключение вдет опять по механизму рекомбинации ДНК: в

ДНК к ранее и единожды перестроенной комбинации VDJ

присоединяется какой-либо один из С-генов тяжелой цепи

(либо

Cyl,

либо Су2, либо СуЗ, либо Су4, либо Се, либо

Cα

1, либо

С«2).

ДНК неиспользованных С-генов слева от использованного

С-гена на этом этапе развития В-лимфоцита элиминируется

в виде кольцевых структур. С этого момента судьба В-лимфо-

цита определена как по единственной антигенной специфич-

ности, так и изотипу тяжелой цепи. Если из окружений про-

должают поступать регулирующие переключение изотипов

сигналы, то возможен еще акт переключения на изотип, С-ген

которого «правее» в ДНК от уже экспрессированных С-генов.

Если с инструкциями «покончено»,

В-лимфоцит

вступает в

терминальный этап своего развития: он становится плазмати-

ческой клеткой — продуцентом больших количеств монокло-

нального секретируемого иммуноглобулина.

При переключении изотипа тяжелой цепи ДНК разрыва-

ется по так называемым областям переключения (switch

region —

SR),

расположенных в

интронах

перед каждым С-ге-

ном (за исключением С<5). SR перед Cμ состоит из 150 по-

второв последовательности

f(GAGCT)

(GGGGGT)]. SR пе-

ред другими С-генами отличаются в деталях, но во всех из

них содержатся повторы GAGCT и GGGGGT. При переклю-

чении изотипов с ДНК работают физически другие фермен-

ты, чем при рекомбинации VDJ (см. рис. 4.5).

Молекулы иммуноглобулина одной и той же специфичнос-

ти по антигену присутствуют в организме в двух физических

состояниях — в растворе и на мембране клеток и в

фор_мщс~

в растворимой форме в крови и других биологических

жидкостях

(секретируемый

клеткой иммуноглобулин);

на мембране В-лимфоцита в составе рецептора В-лим-

фоцитов для антигена — BCR

(B-cell

receptor)

(транс-

мембранная форма иммуноглобулина). Трансмембранные

формы всех классов иммуноглобулинов, включая

IgM

IgA,

мономеры;

в связи с клетками, но не в трансмембранном вариан-

те, а связанным за Fc-конец Fc-рецептором клетки.

В свободном виде только иммуноглобулины класса Ε

способны быть связанными с

FceRI

на тучных клетках,

базофилах, дендритных клетках и некоторых других ти-

/ пах клеток. Для остальных изотипов иммуноглобулинов

1 характерна фиксация на FcR на клетках только после

/ связывания антитела с антигеном, т.е. фиксируется не

/ свободное антитело, а комплекс антиген — антитело

/ через Fc-конец молекулы иммуноглобулина (на макро-

фагах, нейтрофилах, эозинофилах).

Возвращаясь к трансмембранной и секретируемой формам

иммуноглобулинов, отметим, что они различаются по своему

С-концу тяжелых цепей: в трансмембранной форме у тяже-

лых цепей молекулы есть лишние 25 остатков гидрофобных

аминокислот, которые «заякоревают» молекулу в фосфолипид-

ном бислое мембраны. Трансмембранная и секретируемые

«версии» тяжелых цепей кодируются разными экзонами соот-

ветствующих С-генов. В данном случае экзонами называют

структурные гены каждого из отдельных доменов полипептид-

ной цепи. Последний экзон каждого С-гена содержит после-

довательности нуклеотидов для кодирования трансмембранно-

го участка молекулы. Первичный транскрипт РНК дифферен-

цирующего В-лимфоцита содержит все экзоны С-гена. Транс-

ляция белка с полноразмерной мРНК обеспечивает биосин-

тез тяжелых цепей для трансмембранной формы. Но после-

дний экзон может быть легко удален из первичного

транс-

крипта РНК, и тогда будет транслироваться секретируемая

форма иммуноглобулина. В зрелых плазмоцитах трансмембран-

ная форма уже совсем не синтезируется, а только продуци-

руется секретируемая форма.

4.5. Изотипы, аллотипы и идиотипы иммуноглобулинов

В классической серологии для характеристики иммуноглобули-

нов используют не только понятие изотипа, но и такие поня-

тия, как аллотипы и идиотипы конкретных молекул иммуно-

глобулинов. Эти понятия обусловлены различиями между мо-

лекулами иммуноглобулинов, которые можно выявить по ре-

акции данных белков с антителами к ним. Для этого лабора-

торных животных иммунизируют так или иначе выделенными

препаратами иммуноглобулинов и получают антисыворотки.

Во-первых, существует легко выявляемая с помощью ан-

тисывороток общность иммуноглобулинов одного изотипа у

всех особей данного вида животных (видовая антиклассовая/

субклассовая или антиизотипическая специфичность), т.е. изо-

типами иммуноглобулинов называют варианты классов и под-

классов (вместе взятые) иммуноглобулинов по тяжелым цепям.

У человека есть 9 изотипов: М,

Gl,

G2, G3, G4,

ΑΙ,

Α2,

Е, D. Но отдельные особи одного вида продуцируют несколько