Евстрапов А.А. Нанотехнологии в экологии и медицине. Курс лекций. Для УМКД Нанотехнологии в экологии
Подождите немного. Документ загружается.
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
111
синтезируемую нить зависит от нуклеотидной последовательности матрицы.
Полимеразный синтез ДНК сопровождается выделением пирофосфата, который в
присутствии сульфурилазы и аденозинфосфосульфата преобразуется в АТФ и
запускает окисление люцеферина люциферазой, сопровождающееся
биолюминесценцией. Сигнал люминесценции регистрируется фотоприемником. В
первоначальном варианте использовался проточный капилляр, содержащий несколько
иммобилизованных ферментов и анализируемую ДНК.
Технология, разработанная компанией 454 Life Sciences, позволяла проводить
одновременное секвенирование сотен тысяч препаратов ДНК. Основные этапы
технологии:
B ультразвуковая фрагментация анализируемой ДНК;
B пришивка адаптеров и денатурация ДНК (рис. 6.8.1, I);
B получение эмульсии, содержащей в микрокаплях единичные фрагменты ДНК и
полистирольные шарики с пришитым праймером (рис. 6.8.1, II);
B проведение эмульсионной ПЦР;
B отмывка микрошариков от реагентов и удаление несвязанных с шариками нитей
ДНК;
B загрузка шариков в лунки проточной камеры (PicoTiterPlate) (рис. 6.8.1, III);
B загрузка микрошариков с иммобилизованными ферментами (рис. 6.8.1, IV);
B прокачка реагентов и регистрация сигналов люминесценции.
Весь геном, все его молекулы ДНК, случайным образом фрагментируются на кусочки
по 300–500 пар оснований. Затем комплементарные цепи фрагмента разделяются, а к
каждой цепи фрагментов пришивается одинаковый для всех олигонуклеотид-«адаптер»
(рис. 6.8.1 а), который позволяет отдельным цепям налипать на полимерные бусинки
размером около 28 мкм (рис. 6.8.1 б). (Последовательность этого олигонуклеотида
позволяет позднее в процессе секвенирования распознавать ДНК-матрицу.) При этом
смесь разъединённых на комплементарные цепи фрагментов разбавляют таким
образом, что каждая бусинка получает лишь по одной индивидуальной цепи. Каждая
бусинка оказывается заключённой в капельку, окруженную маслом и содержащую
смесь для осуществления полимеразной цепной реакции (ПЦР) (рис. 6.8.1 в), которая и
проходит отдельно в каждой капельке эмульсии (так называемая эмульсионная ПЦР -
эПЦР) (рис. 6.8.1 г). Это приводит к «клональной амплификации» цепей ДНК (на
поверхности бусинки удерживается уже не одна, а около 10 млн. копий уникальной
ДНК-матрицы). Эмульсионная ПЦР позволяет амплифицировать без всяких
предпочтений единичные молекулы ДНК, заключая их в капельку эмульсии и устраняя
конкуренцию со стороны других ДНК-матриц за ограниченное число ДНК-полимераз.
Далее эмульсия разрушается, вновь двуцепочечные фрагменты ДНК (образовавшиеся в
ходе ПЦР) разделяются (рис. 6.8.1 д), и бусинки, несущие одноцепочечные копии ДНК-
матрицы, помещаются в ячейки слайда особой конструкции (рис. 6.8.1 е). Каждая
ячейка такого слайда образует отдельный пиколитровый «реактор», в котором и будет
происходить реакция секвенирования.
Слайд представляет собой матрицу ячеек-реакторов глубиной около 50 мкм, с
расстоянием ~50 мкм между центрами соседних. Объём таких «реакторов» — 75
пиколитров; плотность размещения на поверхности слайда — 480 ячеек на квадратный
миллиметр. Каждый слайд состоит примерно из 1,6 миллионов ячеек, в каждую из
которых попадает одна бусинка с ДНК-матрицей. Слайд помещается в проточную
камеру таким образом, что над отверстиями лунок создаётся канал высотой 300 мкм, по
которому в лунки поступают необходимые реактивы. Доставляемые в проточную
камеру реактивы текут в слое, перпендикулярном оси ячеек. Такая конфигурация
позволяет одновременно осуществлять реакции на бусинках, несущих ДНК-матрицы,
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
112
внутри отдельных ячеек. Добавление и удаление реагентов и продуктов реакции
происходит за счёт конвекционного и диффузионного переноса. Помимо бусинок с
ДНК-матрицей, в каждую ячейку «насыпают» ещё бусинок помельче — каждая с
«сидящими» на её поверхности (иммобилизованными) ферментами, необходимыми для
пирофосфатного секвенирования (рис. 6.8.1 IV). Нуклеотиды (одного вида за раз) и
другие реактивы, необходимые для реакции секвенирования, подаются
последовательно в проточную камеру, куда помещается слайд. Каждый раз, когда
определённый нуклеотид (T, C, A, G) встраивается в растущую цепь ДНК в какой-
нибудь из лунок, в ней высвобождается молекула пирофосфата, которая является
необходимым предшественником компонента другой ферментативной реакции. Её
катализирует особый фермент, люцифераза светлячка Photinus pyralis. Но для её
осуществления необходим аденозинтрифосфат (АТФ). Новообразованный пирофосфат
превращается в лунке в АТФ под действием ещё одного фермента — АТФ-
сульфурилазы. Тогда люцифераза окисляет люциферин до оксилюциферина, а эта
реакция сопровождается хемилюминесценцией (рис. 6.8.1 ж). Дно слайда находится в
оптическом контакте с оптико-волоконным световодом, сопряженным с
высокочувствительным фотоприемным устройством, которое регистрирует излучаемые
фотоны от каждой индивидуальной ячейки, где произошло встраивание известного
нуклеотида.
Регистрируя вспышки хемилюминесценции от каждой ячейки в зависимости от типа
нуклеотида, присутствующего в проточной камере в данный момент времени,
компьютер последовательно отслеживает рост цепочек ДНК во всех лунках
одновременно. После поступления в проточную камеру каждого нуклеотида, она
промывается раствором, содержащим фермент апиразу. Таким образом, перед тем, как
«запустить» в камеру следующий нуклеотид, из всех лунок удаляются любые
нуклеотиды, остававшиеся там от предыдущей реакции. Включение того или иного
нуклеотида в результате высвобождения неорганического пирофосфата
сопровождается излучением света, которое регистрируется фотоприемным
устройством.
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
113
Рисунок 6.8.1. Схема пиросеквенирования: а) — ДНК фрагментируется, к фрагментам
пришиваются олигонуклеотиды-«адаптеры», двуцепочечные молекулы ДНК
разделяются на комплементарные цепи; б) — одноцепочечные молекулы ДНК
прикрепляются к бусинкам; в) - бусинки заключаются в капли реакционной смеси,
окруженные маслом; г) в результате ПЦР на поверхности бусинок образуется
множество копий фрагмента; д) — разрушение эмульсии и отделение бусинок; е) –
размещение бусинок в ячейках слайда и добавление бусинок с ферментами для
пиросеквенирования; ж) – реакция пиросеквенирования: присоединение очередного
нуклеотида вызывает вспышку хемилюминесценции, при присоединении нескольких
нуклеотидов вспышка более яркая. I — прикрепление одноцепочечных ДНК к
бусинкам; II – изображение эмульсии с «пустыми» каплями и каплями с бусинками: 1
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
114
— капля (100-мкм), 2 — бусинка (28-мкм); III – перенос бусинок с копиями ДНК в
слайд;IV – добавление бусинок с ферментами и запуск ферментной реакции.
Определить ячейки, содержащие бусинки с ДНК-матрицей, можно, прочитав
«последовательность-ключ» адаптерного олигонуклеотида, пришитого к началу каждой
ДНК-матрицы. Интенсивность регистрируемого сигнала для каждой ячейки во время
поступления в проточную камеру определённого нуклеотида пропорциональна числу
встроенных нуклеотидов. При таком секвенировании синтезом небольшое число ДНК-
матриц на каждой бусинке теряет синхронизм, т. е. вырываются вперёд или начинают
отставать от других матриц. Причиной этого являются остающиеся в ячейке
нуклеотиды или неполное удлинение цепи. Потеря синхронизма создаёт кумулятивный
эффект снижающий качество прочтения при увеличении его длины. Поэтому был
разработан алгоритм, позволяющий оценивать и вносить поправки на «перелёт» и
неполную достройку цепи, происходящие в отдельных ячейках.
Перед составлением полной последовательности прочитанной ДНК из всего массива
данных на основе специальных правил отбираются высококачественные прочтения и
отбрасываются некачественные. Высокая точность расшифровки последовательности
достигается тем, что система осуществляет многочисленное прочтение одного и того
же фрагмента. Отдельные прочтения одного и того же участка ДНК выравниваются
относительно друг друга исходя из интенсивности сигналов в момент протекания через
камеру того или иного нуклеотида, а не на основе последовательности этих прочтений.
Соответствующие сигналы усредняют, и только тогда записывают полученную
последовательность. Такой подход улучшает качество расшифровки
последовательности и предоставляет возможность оценки её качества.
Для пиросеквенирования была создана коммерческая высокопроизводительная система
— секвенатор Roche 454 Genome Sequencer FLX. Прибор Roche 454 GS20 использовался
для анализа 13 млн. пар оснований последовательности генома 28000-летнего мамонта
и применяется в проекте расшифровки генома неандертальца. Количество выделяемой
из образцов древней ДНК неандертальца составляет всего лишь 5% от количества ДНК,
получаемого из «свежего материала», поэтому секвенировать приходится в 20 раз
больше.
На клеточном уровне новые методы секвенирования синтезом позволяют учёным
идентифицировать мутации в любом организме для всего генома.
Однако метод пиросеквенирования и его техническая реализация имеют определенные
недостатки, на устранение которых направлены усилия ученых и инженеров,
занимающихся этой технологией. В частности, для пиросеквенирования нужны
однонитевые кусочки ДНК, а не двунитевые, как при секвенировании по Сэнгеру, что
усложняет состыковку фрагментов. Чтение приходится повторять по нескольку раз, с
различными наборами перекрывающихся небольших кусочков, а потом
реконструировать участок с помощью компьютерных программ.
Улучшение технологии связывают с: а) снижением стоимости системы и расходных
реагентов; б) уменьшением процента ошибок секвенирования; в) увеличением длины
читаемых фрагментов.
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
115
Другие системы для расшифровки ДНК, появление которых на рынке ожидается в
течение ближайших лет, относятся уже к «третьему поколению» и основываются на
анализе одиночных молекул. Они разрабатываются компаниями VisiGen и Helicos.
Следует упомянуть о конкурирующих методах, среди которых можно выделить метод
полони-секвенирования (polony sequencing). Название метода происходит от слов
«polymerase colony» — «полимеразная колония». Десятки миллионов индивидуальных
ДНК-фрагментов амплифицируются в тонком слое полиакриламидного геля.
Поскольку гель ограничивает диффузию, образуются сферические колонии ДНК —
полонии, которые напоминают бактериальные колонии. Затем двунитевую ДНК
денатурируют, а на оставшихся однонитевых матрицах начинают секвенирование в
реальном времени. К растущей цепи присоединяются флуоресцирующие аналоги
нуклеотидов. Колония, присоединившая очередной нуклеотид, начинает светиться.
Затем свечение нового нуклеотида гасят, отрывая и отмывая флуоресцентную группу.
Повторяя циклы, регистрируя получаемое флуоресцентное изображения, которое затем
обрабатывается соответствующими программами, можно считывать
последовательность сразу во всех этих миллионах точек. Метод использует очень
маленькие фрагменты ДНК, следовательно, лучше подходит для повторного чтения.
7. Наночастицы и наноструктуры в аналитических микрочипах.
Микрофлюидные чипы можно характеризовать размерами структур – каналов,
реакторов или сосудов. Эти размеры составляют от нескольких микрометров до
нескольких сотен микрометров, что значительно больше размеров многих
биологических структур и молекул. Наноструктуры имеют хотя бы один характерный
размер в интервале от 1 до 100 нм. А этому интервалу принадлежат размеры многих
биологических частиц (рис. 7.1). Таким образом, переход от микрофлюидики к
нанофлюидике позволяет эффективно воздействовать на единичные биологические
объекты. Но, с другой стороны нанофлюидика подразумевает и применение
микрофлюидики – хотя бы потому, что необходимо использовать некие
промежуточные системы, например, гидравлические и пневматические интерфейсы
при вводе пробы извне. Поэтому, скорее корректнее говорить об использовании
наноструктур в микрофлюидике.
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
116
Рисунок 7.1.1. Биологические структуры и наночастицы.
Итак, если мы имеем дело со структурами нанометрового размера, следует выделить
ряд особенностей:
• Во-первых, в наномасштабе жидкости имеют свойства, которые не могут быть
рассмотрены в рамках модели сплошной среды,
• Во-вторых, наблюдается доминирование эффектов, связанных с поверхностью
(взаимодействие между поверхностью и молекулами более существенно, чем между
молекулами и растворителем),
• Существенно проявляются эффекты поверхностного натяжения,
• Значительны явления, связанные с двойным электрическим слоем (особенно в
наноканалах, нанопорах, мембранах и т.п.),
• Проявляются размерно-зависимые явления, связанные с соотношением размеров
молекул и наноструктур,
• Наблюдаются явления, связанные с энтропией,
и т.д.
Например, законы диффузии наночастиц существенно отличаются от соответствующих
законов и для молекул, и для броуновских частиц. Это, должно означать, что сила,
действующая со стороны жидкости, не будет описываться классическими
соотношениями. Изучение силы сопротивления, действующей на наночастицу в
молекулярной среде, является достаточно сложной задачей. В большинстве из
известных работ сила сопротивления F не измеряется, а восстанавливается по
коэффициенту диффузии D с помощью соотношения Эйнштейна:
D
Tvk
F
B
= , где v
— скорость частицы, T — температура среды, а k
B
— постоянная Больцмана.
Наноструктуры
в микрофлюидике могут быть использованы для:
• управления движением молекул и частиц (электроосмотические нанонасосы,
клапаны и т.д.),
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
117
• концентрирования, разделения и извлечения частиц (нанопористые мембраны,
колонки, сетки и т.д.),
• создания большой активной поверхности (смешивание пробы и реагентов,
проведения реакций, теплообмене и т.п.).
Некоторые вопросы применения наноструктур для разделения компонентов
рассматривались ранее, в разделе 6.3. Отметим, что развитие технологий получения
нанопористого кремния и стекла с заданными характеристиками привело к
возможности их использования в качестве своеобразных фильтров и сред разделения
при анализе биологических проб. Внедрение нанопористых структур в
микрофлюидный канал позволяет получить своеобразную высокоэффективную
колонку для разделения пробы.
Для извлечения и концентрирования искомых компонентов используются различные
методы и способы, которые непрерывно совершенствуются. Следует упомянуть способ
извлечения с помощью пересекающихся микрофлюидных каналов, разделенных
мембраной с нанопорами, позволяющими осуществлять извлечение компонентов и
последующее их концентрирование. Если между каналами существует электрический
потенциал, то включаются дополнительные эффективные механизмы переноса частиц.
Важными функциональными устройствами микрофлюидики являются смесители и
реакторы. Существуют современные технологии с применением фотоотверждаемых
композиций и специальных шаблонов, позволяющие создавать трехмерные структуры с
достаточно узкими «протоками» (50-350 нм). Подобные структуры используются как
реакторы и высокоэффективные смесители в микрофлюидных чипах.
Наноматериалы имеют достаточно широкое применение в биологии и медицине, они
могут использоваться:
- как флуоресцентные метки,
- как транспортные частицы при доставке лекарств и других объектов,
- при обнаружении белков, болезнетворных микроорганизмов и т.д.,
- при исследовании структуры ДНК,
- при создании биосовместимых материалов (тканей),
- при разрушении опухоли посредством нагревание (
hyperthermia),
- при разделении и очистке биологических молекул и клеток,
- для повышения контраста при медицинских исследованиях (контрастирующие
вещества),
и т.д.
Например, в лабораторных исследованиях и клинической практике для диагностики и
лечения раковых опухолей применяются методы фотодинамической терапии (ФДТ) и
магниторезонансной томографии (МРТ), которые основаны на введение в организм
некоторых специальных
веществ. В случае ФДТ это красители (сенсибилизаторы),
вызывающие выработку активных форм кислорода в ответ на облучение светом; для
МРТ - контрастирующие агенты, такие, как суперпарамагнитные частицы оксида
железа. Так как иногда красители для ФДТ бывают токсичны для клеток, то их
заключают в частицы из биосовместимого материала (например, диоксида кремния). В
настоящее время наблюдается тенденция синтеза наночастиц,с различными свойствами
и хорошей биосовместимостью.
В микрофлюидике наночастицы могут быть использованы как:
• специфические метки биологических молекул (квантовые «точки»,
флуоресцентные, электрохимические и т.д.),
• транспортные частицы для переноса иммобилизованных объектов (магнитные
наночастицы и подобные системы),
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
118
• среды для разделения и фильтрации пробы,
• элементы для воздействия на пробу (локальный нагрев пробы).
7.6. Обнаружение отдельных молекул и частиц. Наночастицы – носители
иммобилизованных объектов.
Для обнаружения отдельных молекул и частиц часто используются устройства с
нанопорами.
На рис. 7.1.2 приведен пример устройства для флуоресцентного детектирования
меченых энзимов в стеклянном микрочипе с нанопорами. На микрочип с
металлической тонкопленочной маской, в которой изготовлены нанопоры, с помощью
объектива фокусируется возбуждающее излучение. Излучение проникает через
нанопоры только на небольшую глубину, где возбуждает флуоресценцию. Световой
поток флуоресценции тем же объективом через дихроичное зеркало передается на
фотоприемное устройство. Таким образом, реализуется возможность регистрации
молекул в
тонком слое.
Нанопоры успешно применяются и при электрохимическом детектировании. При
невысоких концентрациях, транспорт молекул через нанофлюидные каналы (нанопоры)
может быть обнаружен методом электрохимического детектирования с разрешением на
уровне отдельных частиц, что позволяет создать новые типы биосенсоров. На рис. 7.1.3
приведен вариант планарного микрочипа для одномолекулярного детектирования. В
этом устройстве ионный ток
через нанопору подавлен закрывающей нанотрубкой,
соединенной с кантеливером атомно-силового микроскопа. Меняя частоту колебаний
кантеливера, можно открывать и закрывать транспортный канал через пору. Кроме
этого, такое устройство позволяет изучать взаимодействия молекула-нанотрубка-
нанопора
.
Рисунок 7.1.2. Устройство для флуоресцентного детектирования меченных молекул
в стеклянном микрочипе с нанопорами.
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
119
Рисунок 7.1.3. Устройство для электрохимического детектирования.
Другой пример микрофлюидного устройства для анализа молекул ДНК с
использованием нанопор приведен на рис. 7.1.4. В полидиметилсилоксановый
микрофлюидный чип встроена мембрана из нитрида кремния с диаметром отверстия ~4
нм. По обе стороны отверстия расположены резервуары и электроды, к которым
приложено внешнее напряжение. Перемещение молекулы ДНК через это отверстие
(нанопору) под действием электрического поля вызывает изменение тока в цепи.
Длительность регистрируемого сигнала зависит от длины молекулы. Таким образом,
измеряя параметры электрического сигнала, можно получить информацию о размерах
молекулы ДНК.
Однако существенным недостатком при использовании нанопор является достаточно
быстрое «забивание» пор, что приводит к необходимости предварительной очистки
пробы и контроле за текущим состоянием поры.
Рисунок 7.1.4. Микрофлюидное устройство с нанопорой для анализа молекул ДНК: а) –
прохождение ДНК через нанопору, б) схема эксперимента по регистрации молекул
ДНК, в) СЭМ – изображение нанопоры.
А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»
120
Устройства, в которых применяются нитевидные нанокристаллы, лишены этого
недостатка и позволяют создавать новые ультрачувствительные электрические датчики
для прямого обнаружения биологических и химических молекул (Charles M. Lieber,
2004). Механизм нанокристаллических датчиков основан на полевом эффекте,
используемом в транзисторах. Полупроводник p-типа, на котором мобилизованы
антитела (или иные рецепторы), связан с металлической поверхностью и электродами,
через которые подается потенциал. В такой цепи измеряется изменение проводимости
полупроводника, которая резко меняется при специфическом взаимодействии
рецепторов с определяемым компонентом (антигеном, белком) (рис. 7.1.5). То есть
химические или биологические взаимодействия преобразуются непосредственно в
электрические сигналы. Применение линейки таких электродов с различными
рецепторами интегрированной в канал микрофлюидного чипа позволяет осуществлять
комплексный анализ пробы. Такой метод предложен для обнаружения белков, вирусов
и ДНК.
Рисунок 7.1.5. Принцип действия электрического датчика для прямого обнаружения
биологических и химических молекул.