Евстрапов А.А. Нанотехнологии в экологии и медицине. Курс лекций. Для УМКД Нанотехнологии в экологии

Подождите немного. Документ загружается.

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

Таблица 6.4.2

Характеристики методов детектирования

Метод

Предел

детектирования

по концентрации

(моль)

Преимущества

Недостатки

Фотометрический

(УФ-Видимый-ИК

диапазоны)

-5

- 10

-8

Универсальность,

получение

спектральной

информации

Малая длина оптического

пути – низкая

чувствительность

Флуоресцентный 10

-7

- 10

-9

Высокая

чувствительность

Необходимо, чтобы

компонент обладал

флуоресценцией (или

используется метка)

Лазер-индуцируемой

флуоресценции

-14

- 10

-16

предельная

чувствительность

Необходимо, чтобы

компонент обладал

флуоресценцией (или

используется метка)

дороговизна

Амперометрический 10

-10

- 10

-11

чувствительность

используется для

электроактивных аналитов,

требуется специальная

электроника, необходима

модификация каналов

Кондуктометрический 10

-7

- 10

-8

универсальность

требуется специальная

электроника, необходима

модификация каналов

Масс-

спектрометрический

-8

- 10

-9

чувствительность,

информация о

структуре

Дороговизна,

значительные габариты,

азработка специальных

методик

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

место для рис.6.4.8.

Рисунок 6.4.8. Интегрированная микрочиповая платформа для исследований

биологических проб.

6.5.Твердофазная, жидкостная и микрофлюидная экстракция. Идеология Т-

сенсора и Н-фильтра.

Экстракция (от лат. extraho — извлекаю) — процесс извлечения вещества из раствора

с помощью подходящего растворителя, который не смешивается с раствором, но в

котором вещество растворяется лучше, чем в первом растворителе. Наиболее

распространенными являются жидкостная и твердофазная экстракция

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

Жидкостная экстракция - экстракция, заключающаяся в перераспределении

компонентов между несмешивающимися жидкими фазами, одна из которых содержит

экстрагент.

Твердофазная экстракция — метод, состоящий в концентрировании и отделении от

матрицы целевого вещества для анализа (аналита) с использованием твердых

сорбентов, с последующим вымыванием (экстракцией) подходящими растворителями.

Многие микрофлюидные технологии хорошо работают только при анализе гомогенных

проб. Наибольшие трудности представляет анализ сложных и гетерогенных реальных

проб, таких как цельная кровь или загрязненные пробы окружающей среды. Поэтому в

ряде случаев размеры каналов МФЧ ограничивают снизу, делают большими, чем

размеры пылинок и микрочастиц в пробах, способных блокировать каналы чипа.

Важное значение приобретает инсталляция в чип устройств, отделяющих раствор от

частиц. Обычно этой цели достигают методами фильтрации или центрифугирования,

которые не всегда применимыми в интегрируемых микросистемах. Фирмой Micronics

(США) был предложен компонент, позволяющий одновременно осуществлять функции

сепарации и детектирования. Это устройство, в последствии названное «Т-сенсор»,

представляет чип (рис. 6.5.1) с тремя отдельными входами: для пробы, для раствора с

индикатором и для сравнительного раствора. После объединения в тройнике потоки в

ламинарном режиме движутся параллельно, диффузионно обмениваясь компонентами

в интеракционной зоне. Малые частицы (молекулы) быстро диффундируют из потока

пробы в центральную область, в то время как большие частицы (макромолекулы)

диффундируют значительно медленнее (например, органический краситель с МВ = 350

дальтонов диффундирует на расстояние 10 мкм за 0.2 сек, а частице диаметром 0.5 мкм

для этого требуется 200 сек). Диффузионные потоки формируют соответствующие

интеракционные зоны, в которых продукты взаимодействия пробы с индикатором и

вещества сравнения с индикатором могут использоваться для определения

концентрации аналита оптическими методами по изменению абсорбции света или

интенсивности флуоресценции индикатора в диффузионной зоне между потоками. При

регистрации сигналов могут быть определены: (а) флуоресценция (абсорбция) раствора

пробы и сравнительного раствора, (б) фоновая флуоресценция (абсорбция) индикатора,

(в) распределение интенсивности диффузионных профилей контроля и пробы, (г)

координаты максимумов флуоресценции (абсорбции) контроля и пробы. Параметры (а)

- (в) используются для калибровки и расчета концентрации аналита. Параметр (г) дает

информацию о вязкости потока в канале.

Сравнение интенсивностей и позиций диффузионной интеракционной зоны в одном

или нескольких сечениях позволяет получить безкалибровочное значение

аналитической концентрации, независимое от вариаций экспериментальных условий.

При этом компенсируются такие эффекты, как вариация геометрии проточной ячейки,

температурная зависимость реакционной кинетики, нестабильности источника

излучения, оптической системы и электроники, мутность флюида, нестабильность

концентрации реагентов детектирования, перекрестная чувствительность к другим

реагентам пробы, нестабильность вязкости и скорости потока. Поскольку все потоки в

Т-сенсоре ламинарные, а реагенты и проба постоянно обновляются, повышение

чувствительности может быть достигнуто путем интегрирования во времени

флуоресцентных изображений без опасения фотообесцвечивания, деградации

реагентов, засорения сепарационных мембран и влияния других отрицательных

эффектов, типичных для традиционных сенсоров.

Возможности применения T-сенсора продемонстрированы для различных клинических

анализов: определения рН, содержания кислорода, электролитов, белков, энзимов и

лекарственных препаратов в крови — с использованием для детектирования

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

флуоресценции и абсорбции света. Интерес вызывает новый формат иммуноанализа,

основанный на диффузионно-сепарационных особенностях T- сенсора для изоляции и

детектирования связанных и несвязанных комплексов антиген–антитело. Измерение

интенсивности флуоресценции (абсорбции света) вдоль канала может использоваться

для наблюдения кинетики реакции (не как функции времени, а как функции расстояния

от стартовой точки диффузионного взаимодействия). Таким образом, дополнительно к

разделению и детектированию аналита в сложных растворах проб T-сенсор дает

возможность иммуноанализа и кинетического анализа в формате, требующем

минимального количества пробы.

Развитием идеологии Т-сенсора стал так называемый Н-фильтр – микрофлюидное

устройство для экстракции аналита из жидкости, содержащей частицы (например,

клетки крови, бактерии, микроорганизмы, пыль, и вирусы) (рис. 6.5.2). В устройстве

отсутствует мембранный фильтр или подобный элемент, требующий регулярной

очистки или замены. Устройство было разработано для фильтрации сверхмалых

объемов жидкости (нанолитровых объемов), хотя может быть использовано и при

больших расходах жидкости.

Рисунок 6.5.1. T-сенсор фирмы Micronics с тремя отдельными входами: а — для пробы;

б — для детектируемого раствора с индикатором; в — для сравнительного раствора; г –

слив. 1 — границы потоков; 2 — сравнительный поток; 3 — поток, содержащий

частицы; 4 — диффузия детектируемой субстанции в сравнительный поток; 5 —

диффузия аналита сравнения в детектируемый поток; 6 — детектируемый поток; 7 —

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

диффузия пробы в детектируемый поток; 8 — диффузия детектируемой субстанции в

пробу; 9 — поперечное сечение детектора

Принцип работы устройства заключается в разделении смеси частиц из-за разницы в

диффузионных свойствах. В канал 1 вводится жидкая проба - смесь частиц, а в канал 2

поступает выбранный реагент. Жидкости (их подбирают определенным образом) при

контакте в центральном канале, создают граничную область и, не смешиваясь, в

ламинарном режиме двигаются по каналу. В процессе движения происходит диффузия

мелких частиц из потока 1 в поток 2. При подходящей длине канала и подборе состава

жидкостей могут быть созданы благоприятные условия для извлечения аналита из

пробы. Затем поток 2 может быть перенаправлен в специальный микрорезервуар для

дальнейшего анализа.

В центральном канале H-фильтра можно создать градиент поля (электрического,

гравитационного, магнитного и т.д.) так, что частицы будут подвергаться действию

этого поля, и таким образом управлять их движением и распределением между

потоками.

Рисунок 6.5.2. Н-фильтр: 1 – канал ввода пробы; 2 – канал ввода реагента; 3 – канал

слива; 4 – канал вывода реагента и аналита.

6.6. Седиментационный метод анализа. Разделение на CD-чипе.

Седиментационный анализ — совокупность методов определения размеров частиц в

дисперсных системах и молекулярной массы макромолекул в растворах полимеров по

скорости седиментации в условиях седиментационно-диффузного равновесия.

Седиментация — направленное движение частиц в поле действия гравитации или

центробежных сил. Скорость седиментации зависит от массы, размера и формы

частицы, вязкости и плотности среды, а также от действующих на частицы

центробежных сил.

Первоначально седиментационный анализ был основан на использовании движения

частиц в гравитационном поле. В 1923 г. Т. Сведберг предложил применить для

анализа специально сконструированную ультрацентрифугу. В процессе

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

экспериментальных исследований оказалось, что для аналитических целей достаточно

ультрацентрифуги с ускорением 40-50 тыс. g. Применение центрифуги позволяет

значительно ускорить анализ и дает возможность разделить смеси, содержащие

частицы, вплоть до коллоидных размеров и осаждать молекулы высокомолекулярных

соединений. Скорость осаждения зависит от интенсивности центробежного поля, а

степень осаждения - от времени центрифугирования.

Для характеристики центрифуг применяется величина, называемая фактором

разделения, которая показывает, во сколько раз ускорение центробежного поля больше

ускорения свободного падения g:

= , где

– угловая скорость вращения ротора; R – внутренний радиус ротора

центрифуги; g – ускорение свободного падения.

Для точных расчетов необходимо учитывать, что ускорение, действующее на частицу в

центробежном поле, увеличивается по мере оседания частиц, т.е. удаления их от оси

вращения ротора. Поэтому уравнение Стокса должно быть выражено в

дифференциальном виде:

ρπωηπ

Δ= , где x – расстояние от частицы до оси вращения.

После интегрирования в пределах от x

(начальное расстояние от частицы до оси

вращения) до R (конечное расстояние - внутренний радиус ротора центрифуги) и

соответственно по времени, от 0 до t, получаем

, где t – время центрифугирования;

– вязкость среды;

Δρ

–

разность плотностей дисперсной фазы и дисперсионной среды; R – внутренний радиус

ротора центрифуги;

– начальное расстояние от частицы до оси вращения.

Флотация — способ разделения смесей твёрдых мелких частиц, принадлежащих

различным веществам, а также выделения капель дисперсной фазы из эмульсий,

основанный на их различной смачиваемости и способности накапливаться на

поверхности раздела фаз. Флотация возможна только при неполном смачивании

поверхности выделяемых частиц жидкостью. Обычно это достигается путём

добавления небольших количеств специальных веществ — флотореагентов.

Необходимость высокоскоростного анализа большого количества проб привела

к созданию многоканальных линейных микрофлюидных чипов, а в 1999 г. появились

радиальные микрочипы (

CD –чипы). Идеология CD – чипов заключается в следующем:

круглая пластина (на подобие

CD-диска) используется как основа для создания

микроструктур, в которых происходит аналитическая реакция. По сути дела это может

быть диск с системой каналов, реакторов, смесителей, микрососудов (рис. 6.6.1а) или

диск с чувствительными зонами биомолекул (антигенами, антителами,

олигонуклеотидными зондами и т.п.) (рис. 6.6.2).

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

При вращении диска на жидкость, находящуюся в каналах, действуют центробежные и

кориолисовы силы, которые вызывают движения потоков жидкости. В сочетание с

гидрофобными барьерами и другими элементами, расположенными в каналах и

играющими роль своеобразных клапанов (при увеличении скорости вращения диска

эти барьеры становятся проходимыми для потоков), можно организовать движение

жидкости по сложным траекториям, создать условия для эффективного перемешивания

реагентов, транспорта и разделения пробы. Можно даже создать условия для

капельного движения пробы в транспортном жидком потоке.

На рис. 6.6.1 приведена конструкция микрофлюидного CD-чипа (а) для

электрофоретического анализа пробы с конфокальным детектором лазер-

индуцированной флуоресценции (б). В формате CD можно реализовать возможность

анализа большого количества проб (например, электрофоретические методы

реализованы на 96, 384 – канальных микрочипах радиального формата).

Конструкции в формате CD могут быть самыми разнообразными и зависят от

выбранного метода анализа. Например, при выборе методов анализа, основанных на

специфических взаимодействиях аналита пробы с реагентом, конструкция CD-чипа

может быть такой, как показано на рис. 6.6.3. Проба вводится в ячейку, находящуюся

вблизи центра вращения диска. В резервуары, обозначенные как «реагенты», «буфер»,

«в-1» и «тест», загружены реагенты, буферные, вспомогательные и тестовые растворы.

При вращение диска проба движется по каналу, вступая во взаимодействие с

растворами из резервуаров. Через зону детектирования последовательно проходят

калибровочные (тестовые) растворы и продукты взаимодействия аналита, содержащего

в пробе, с реагентом. Сравнивая величину аналитического сигнал от пробы и тестового

раствора можно с высокой точностью осуществлять количественное определение

аналита в пробе.

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

Рисунок 6.6.1. Микрофлюидный

CD-чип для электрофоретического анализа пробы (а) и

система детектирования (б).

Рисунок 6.6.2. Гибридизационный CD – чип.

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

Рисунок 6.6.3. Конструкция CD-чипа для анализа биопроб.

6.7. Анализ нуклеиновых кислот.

6.7.1. Электрофоретическое разделение ДНК на микрофлюидном чипе.

Важными направлениями в биологических и медицинских исследованиях являются

изучение генетических мутаций и полиморфизмов, которые могут видоизменять

функции гена и, по-видимому, являться причиной унаследованных болезней и других

заболеваний. Для экспресс-анализа ДНК в настоящее время применяются методы:

капиллярного электрофореза и электрофореза на микрофлюидном чипе, масс-

спектрометрии; гибридизационного анализа на микрочипе ("биочип"). Использование

МФЧ позволяет проводить анализ малых объемов пробы с высокой

производительностью и быстродействием на компактных устройствах, которые могут

быть встроены в другие системы.

В основе метода электрофоретического разделения ДНК лежит тот факт, что в

водном растворе ДНК является анионом. Если к раствору приложить потенциал, то

фрагменты ДНК направятся к плюсу. При использовании полимерных сред и гелей на

водной основе скорость движения фрагментов ДНК обратно пропорциональна их

длине: маленькие фрагменты быстрее пройдут через полимерную (гелевую) сетку, а

длинные - медленней. Фрагменты ДНК, которые изначально находились в одном

объеме, через некоторое время выстроятся по размеру. Метод электрофореза

применяется почти всегда, когда требуется рассортировать куски ДНК по длине,

от большого к маленькому.

Первые работы по использованию электрофореза на микрочипах появились в

1990-х годах, а уже в 1994 г. Woolley и Mathies продемонстрировали быстрое (~120 с)

разделение фрагментов ДНК на многоканальном микрочипе с длиной канала 35 мм. По

сравнению с традиционным КЭ в МФЧ короткие сепарационные длины в сочетании с

высокой напряженностью электрического поля дают возможность осуществить очень

быстрое разделение компонентов пробы (до нескольких секунд). При этом реализуется

полный контроль всех стадий процесса и параметров анализа. Кроме того, существует

возможность интеграции в микрочип отдельных функциональных элементов, датчиков

и устройств, обеспечивающих необходимые режимы фракционирования

и их контроль.

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

100

В настоящее время микрофлюидные чипы для электрофоретического разделения

(МФЧЭ) применяются: для анализа неорганических и органических веществ;

иммунного анализа; для анализа биомолекул, в том числе ДНК, РНК, белков; анализа

продуктов полимеразной цепной реакции; результатов секвенирования ДНК;

обнаружения мутаций и т. п.

Наиболее успешно электрофоретические методы используются при разделении

фрагментов ДНК. При электрофоретическом разделении чрезвычайно важной задачей

становится правильный выбор сепарационной среды разделения — полимерной

матрицы, т. к. необходимо разделить фрагменты ДНК, обладающие почти идентичной

электрофоретической подвижностью в свободном состоянии. При

электрофоретическом разделении ДНК для получения качественного

высокоскоростного разделения помимо влияния электрического поля критическими

являются следующие факторы:

среда разделения, концентрация, состав и pH буфера.

Для эффективного разделения образцов ДНК состав полимерной матрицы должен быть

оптимизирован с учетом химической природы полимера, физических характеристик

полимера (молекулярно-массовое распределение) и концентрации полимера в

буферном растворе. Чтобы добиться эффективного разделения фрагментов ДНК, в

методических работах уделяется особое внимание получению полимера с заданной

молекулярной массой. Подвижности молекул ДНК различных

размеров в свободных

растворах почти не различаются из-за одинаковых соотношений заряд/поверхность

(размер). В таких условиях трудно достигнуть разделения по молекулярным весам.

Поэтому для анализа таких биополимеров, как РНК и ДНК методом КЭ применяют

среды с ситовыми свойствами, как в традиционном гель-электрофорезе. Разбавленные

растворы полимеров имеют физические свойства, близкие к свойствам растворов

малых молекул, а когда концентрация полимера в растворе возрастает и достигает

порогового значения, молекулы полимера начинают переплетаться. Спутанные

полимерные цепи образуют нестойкую сетку, размер пор которой не зависит от

молекулярной массы полимера. Образовавшаяся сетка обладает ситовыми свойствами.

Такие растворы спутанных полимеров используют в КЭ для достижения разделения по

молекулярным размерам. Способы и механизмы миграции молекул ДНК при

электрофоретическом разделении в растворах спутанных полимеров достаточно

сложны, но практически все они описаны в научной литературе. Сила взаимодействия с

полимерной матрицей больше для больших молекул ДНК. На этом и

основано

разделение по молекулярным размерам. В зависимости от конформации и размеров

молекул анализируемого вещества, а также от характеристик пористой структуры

полимерного раствора можно придти к различным механизмам разделения. Как

правило, для подвижности анализируемых веществ в разделяющем полимере находят

зависимость от их размеров.

6.7.2. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

В современной клинико

- диагностической лабораторной практике успешно

применяются методы ДНК/РНК – диагностики, среди которых, безусловно, первое

место занимает полимеразная цепная реакция (ПЦР). В начале 1970-х годов

норвежский ученый Къелл Клеппе (Kjell Kleppe) высказал идею о том, что можно

амплифицировать ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК —

синтетических праймеров. Но только в 1983 г, Кэри Б. Мюллису (Kary B. Mullis)

(Нобелевскому лауреату по химии 1993 г) удалось создать метод амплификации ДНК в

ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью

фермента ДНК-полимеразы.