Евстрапов А.А. Нанотехнологии в экологии и медицине. Курс лекций. Для УМКД Нанотехнологии в экологии

Подождите немного. Документ загружается.

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

устройство для ввода пробы, обработки сигнала и выдачи информации о концентрации

определяемого компонента. Достоинствами таких приборов являются малые размеры и

масса, небольшая потребляемая мощность, способность работы в автоматическом

автономном и непрерывном режиме.

Обычно в состав сенсора входят (рис. 6.1.1):

• распознающий элемент (рецепторный слой) - вещество, способное селективно

взаимодействовать с аналитом;

• трансдьюсер (англ. transducer – преобразователь, датчик) – преобразователь

химического или биологического взаимодействия в электрический сигнал;

• система сбора и обработки данных.

Рисунок 6.1.1. Состав сенсора.

По принципу работы и в зависимости от вида аналитического сигнала выделяют

электрохимические (потенциометрические, вольтамперометрические,

кулонометрические, кондуктометрические), оптические (фотометрические,

люминесцентные и др.), электрические сенсоры, а также сенсоры, чувствительные к

изменению массы и других характеристик.

В основу работы

электрохимических сенсоров положены превращения определяемого

компонента в электрохимической ячейке, вырабатывающей аналитический сигнал.

В оптических сенсорах осуществляется измерение поглощения или отражения

светового потока, люминесценции или теплового эффекта при поглощении света.

К электрическим сенсорам относятся полупроводники с электронной проводимостью,

органические полупроводники и полевые транзисторы. Измеряемыми величинами

являются проводимость, разность потенциалов, заряд или емкость, изменяющиеся при

воздействии определяемого вещества.

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

Действие сенсоров, чувствительных к изменению массы, основано на изменении

частоты колебаний пьезореэлементов или скорости распространения акустических волн

при селективной сорбции определяемого вещества на электродах или на

чувствительной поверхности.

В настоящее время разрабатываются интеллектуальные сенсорные системы

(электронный нос и электронный язык), основанные на принципах, сходных с

организацией биологических систем — массивов неспецифичных рецепторов с

последующим распознаванием образов с помощью аналогов нейронной сети.

Электронный язык - аналитический прибор, состоящий из массива неселективных

(перекрестно-чувствительных) химических сенсоров, обладающих перекрестной

чувствительностью к различным компонентам в растворе, и методов обработки данных

- распознавания образов (искусственные нейронные сети, анализ по главным

компонентам, нечеткая логика и т.п.) и многомерных калибровок. Важными

характеристиками сенсора являются стабильность отклика и перекрестная

чувствительность, которая

может быть определена как воспроизводимый отклик

сенсора к максимально большому числу компонентов раствора. Откалиброванная

мультисенсорная система может быть использована для многокомпонентного

количественного анализа растворов, а также распознавания (классификации,

идентификации) сложных жидкостей различной природы. Уникальная особенность

системы при анализе пищевых продуктов - возможность установить корреляцию между

результатами анализа и человеческим восприятием вкуса.

Разновидностью

химических сенсоров являются биосенсоры - компактные

устройства/приборы, содержащие анализирующий элемент биологической природы

(биорецептор), работа которого основана на использовании ферментов, клеток,

антител, клеточных рецепторов и т.д., и который сопряжен с физическим

преобразователем, проводящим регистрацию сигналов биологического элемента.

Определение по IUPAC: биосенсор - устройство, состоящее из трансдьюсера

и иммобилизованного биологического элемента. 1 этап действия биосенсора:

“узнавание” биоэлементом специфического для него вещества из

многокомпонентной смеси. 2 этап - преобразование информации о протекании

биохимической реакции в форму электрического или другого (например,

оптического) сигнала.

Основная область применения биосенсоров - анализ жидких объектов в медицине,

биотехнологии, пищевой и химической промышленности.

Недостатками биосенсоров являются: невысокая стабильность, трудность получения

биоорганических материалов постоянного состава, чувствительность к действию

высоких и низких температур, бактерицидных загрязнений и др.

Кроме очевидных требований, предъявляемых к сенсорам, таких как простота

эксплуатации, дешевизна, высокая точность, долговечность, селективность и скорость

анализа, добавляются еще требования миниатюризации, возможность работать в

непрерывном режиме, а в некоторых случаях – возможность внедрения в человеческий

организм.

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

Используемые в биосенсорах трансдьюсеры разнообразны. Наиболее часто

применяются электрохимические преобразователи, в которых трансдьюсером является

электрод, помещенный в исследуемый раствор. Оптические биосенсоры используют

явления полного внутреннего отражения, поверхностного плазмонного резонанса,

люминесценции. Гравиметрические сенсоры используют изменение массы при

связывании аналита и обычно основаны на акустических волнах или пьезокварцевых

микровесах.

Биосенсоры удобно классифицировать как по типу трансдьюсеров, так и по типу

элемента, осуществляющего “биоузнавание”. Типы трансдьюсеров определяются

физико-химическими основами их действия и позволяют разделить биологические

сенсоры на основные категории: электрохимические, оптические и гравиметрические.

6.1.2. Основные аналитические характеристики сенсоров. Каталитические и

аффинные биосенсоры. Иммобилизация биологического материала.

Каждый сенсор имеет

рабочий диапазон температур, давлений и pH. Так как сенсор

измеряет концентрацию аналита, то важными характеристиками являются точность,

воспроизводимость, рабочий диапазон измерений

. Чувствительность сенсора

показывает отношение аналитического сигнала к концентрации аналита, вызвавшего

этот сигнал. Более строго чувствительность определяется как максимальное значение

производной величины отклика по концентрации. Важнейшей характеристикой сенсора

является селективность, она отражает способность детектировать данный аналит в

присутствии посторонних веществ.

Для количественного определения селективности используются два основных метода:

• построение калибровочных кривых для аналита и для посторонних примесей при

одинаковых условиях эксперимента. При этом селективность выражается как

отношение величины сигнала, вызываемого аналитом к величине сигнала,

вызываемой примесью той же концентрации;

• в ячейку, содержащую аналит, вводят примеси в концентрациях, которые

ожидаются в реальных образцах, а селективность определяется как изменение

сигнала в процентах.

К временным характеристикам сенсоров относятся следующие: время отклика, время

жизни и время регенерации. Время отклика – время необходимое для возникновения

равновесия между анализируемым образцом и рецепторным слоем.

Время жизни – это

длительность воспроизводимой работы сенсора, которая ограничена деградацией

рецепторного слоя. Время регенерации - это время, требуемое для восстановления

работоспособности распознающего элемента.

Наиболее часто распознающими элементами биосенсоров являются ферменты –

высокоспецифичные катализаторы биохимических реакций. В состав фермента входит

одна или несколько белковых молекул, иногда присутствует небелковая часть.

Каталитическая активность ферментов значительно выше, чем у любых искусственных

катализаторов, ферменты увеличивают скорость реакции в 10

-10

раз.

В некоторых случаях ферменты используются непосредственно в составе тканей

организмов животных или растений (иммобилизованные на электроде ткани грибов). К

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

биосенсорам на основе тканей идеологически близки устройства с использованием

клеток в качестве распознающих элементов.

Биосенсоры, использующие ферменты в рецепторном слое, иногда называют

каталитическими. Существуют аффинные биосенсоры (affinity biosensors),

использующие антитела, нуклеиновые кислоты и рецепторы. В ферментативных

сенсорах происходит реакция по общей схеме (рис. 6.1.2):

+→↔+

Субстрат S связывается с ферментом E, образуя комплекс ES, затем субстрат

превращается в продукт P и высвобождается.

В случае аффинных биосенсоров в рецепторном слое происходит реакция вида:

↔+

В таких реакциях не образуется новых продуктов, а происходит связывание

реагирующих молекул в комплекс АВ. Реакции этого типа также называют реакциями

непродуктивного связывания. Акт непродуктивного связывания сложнее

зарегистрировать. К аффинным биосенсорам относятся сенсоры на ДНК, на антигены и

антитела и сенсоры с использованием рецепторов.

В ДНК-сенсорах рецепторный слой состоит из иммобилизованных одноцепочечных

ДНК, которые улавливают из раствора комплементарные цепи. Детектирование

молекул ДНК основано на взаимодействии между комплементарными цепями. Природа

этого взаимодействия – водородные связи между парами нуклеотидов.

Рисунок 6.1.2. Реакции в ферментативных (а) и аффинных биосенсорах (б).

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

Антитела – это сложные белковые молекулы, построенные из нескольких субъединиц,

вырабатывающиеся в организмах позвоночных в ответ на проникновение чужеродных

агентов (антигенов), например, токсинов, вирусов или чуждых организму

макромолекул. Циркулирующие в крови антитела связываются с антигенами,

деактивируют их и выводятся из организма. Кроме того, связанные антитела служат

метками для микроорганизмов, подлежащих уничтожению. Взаимодействие антиген –

антитело считается наиболее селективным для применения в биосенсорах. Это

взаимодействие осуществляется теми же по природе силами, что и взаимодействие

фермента с субстратом: вандерваальсовыми силами, ионными, гидрофобными и

гидрофильными взаимодействиями, водородными связями. Сложность применения

антител в биосенсорах состоит в том, что акт связывания антигена сложно

зарегистрировать. Это является общим недостатком аффинных биосенсоров и приводит

необходимости применения специальных методов, например, использования меток.

Другая сложность состоит в том, что аффинные взаимодействия часто имеют высокие

значения константы ассоциации, т.е. слабо обратимы, и использующие их

распознающие элементы часто являются одноразовыми или требуют специальных

методов регенерации.

Рецепторы – это мембранные белки, способные связывать определенные лиганды и

вызывать определенный физиологический отклик в ответ на акт связывания. Рецепторы

обычно используются в биосенсорах в составе клеток, так как в очищенном виде они

недостаточно стабильны.

Распознающий элемент биосенсора находится в непосредственном контакте с

исследуемым образцом, именно он отвечает за химические и биохимические реакции,

протекающие в процессе анализа. Наиболее универсальным направлением развития

являются биосенсоры, использующие антитела, т.к. могут быть изготовлены для

связывания чрезвычайно широкого класса веществ. Существенным является

закрепление (иммобилизация) распознающего элемента – биологического материала –

на трансдьюсере. Основные требования, предъявляемые к методам иммобилизации:

а) закрепленный биологический материал должен сохранять свою активность в течение

как можно более продолжительного времени;

б) перенос молекул аналита к распознающему элементу не должен быть затруднен, а

если в распознающем элементе осуществляется каталитическая реакция, то должен

быть обеспечен отвод продуктов реакции;

в) метод иммобилизации должен быть применим в достаточно широких диапазонах

температур, значений pH и давлений;

г) метод иммобилизации должен обеспечивать хорошую воспроизводимость.

Основными методами иммобилизации являются (рис. 6.1.3):

• адсорбция,

• включение в полимер, в частности в гель,

• сшивка,

• ковалентное связывание,

• капсулирование или изоляция с помощью мембран.

Адсорбция является наиболее простым методом, практически не требующим

подготовки компонент сенсора и использования специальных химических реагентов.

При физической адсорбции частицы удерживаются на подложке под действием сил

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

Ван-дер-Ваальса (рис. 6.1.3а), которые по своей природе делятся на диполь-дипольные,

индукционные и дисперсионные взаимодействия, а также под действием водородных и

ионных связей. Полученные методом адсорбции элементы обычно характеризуются

низкой чувствительностью и существенной зависимостью от температуры и pH.

Включение биологического материала в полимерную матрицу является универсальным

методом, применимым для разных типов распознающих элементов. Обычно

используются такие полимеры, как полиметилметакрилат, крахмал, нейлон, желатин,

коллаген и другие. Если матрица состоит из синтетического полимера, его получение

проводится в присутствии биологического материала. Обычно добавляется сшиватель,

чтобы отдельные полимерные нити объединились в трехмерную сетку. При этом

биологически активные молекулы оказываются захваченными внутрь полимера (рис.

6.1.3б). Достоинством этого метода является его универсальность; его недостаток в

том, что сетка затрудняет диффузию и мешает проникновению аналита. Кроме того,

если включаемые в сетку молекулы не связаны с ней химически, то они могут

выходить из нее через поры.

Рисунок 6.1.3. Методы иммобилизации биологического материала

В тех случаях, когда молекулы биологического материала связаны между собой или

связаны с опорной сеткой, говорят о методе сшивки. Фактически сшитые

распознающие молекулы могут использоваться без подложки, если обладают

достаточно хорошими механическими характеристиками (рис. 6.1.3в). Сшивка обычно

используется в сочетании с другими методами. Например, она может стабилизировать

элементы, полученные адсорбцией.

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

Метод ковалентного (химического) связывания является наиболее распространенным в

различных приложениях. Он предполагает создание ковалентной связи между

биоматериалом и подложкой (рис. 6.1.3г). Выбор химических реагентов для его

реализации зависит от типа связываемых молекул и материала подложки. Обычно

метод реализуется в три этапа: очистка и модификация поверхности подложки, т.е.

формирование на ней слоя из необходимых функциональных групп, затем нанесение

биоматериала, и, наконец, смывание слабо закрепленных молекул чистыми

растворителями. Материалы подложек, используемые в сенсорах: металлы (золото,

серебро, платина), стекло, кремний, углерод, полисахариды, нейлон, полимеры и т.д.

Главные достоинства метода ковалентного связывания состоят в том, что, с одной

стороны он обеспечивает надежную связь биоматериала с подложкой и предотвращает

его утечку, а с другой позволяет создавать сенсоры с длительным временем жизни.

Один из распространенных методов, используемых при создании сенсоров, состоит в

том, что ферменты отделены от остального раствора полупроницаемой мембраной,

через которую могут проходить молекулы аналита и продукты каталитической реакции

(рис. 6.1.3г). Практически ферменты находятся в свободном состоянии, но они

локализованы в одной части измерительной ячейки. Этот метод также иногда

называется микрокапсулированием.

В ДНК-биосенсорах (еще их иногда называют биочипами) распознающим элементом

обычно являются одноцепочечные ДНК, которые связывают комплементарные цепи.

Биочипы представляют собой системы различных распознающих элементов, собранные

на малой площади; каждый тип распознающих элементов занимает свой участок

(сайт). Применительно к ДНК, это означает, что на одной твердой подложке собрано

большое количество различных типов одноцепочечных олигонуклеотидов. В процессе

анализа каждый из них связывает комплементарный участок молекул из образца.

Каждый тип олигонуклеотидов занимает сайт диаметром ~100 мкм; детектирующая

система считывания обрабатывает сигналы от разных участков и регистрирует

присутствие различных последовательностей в исследуемом образце. Для

иммобилизации олигонуклеотидов применяются различные методы, среди которых

наиболее популярным является ковалентное связывание на золотой поверхности. При

этом используются олигонуклеотиды с привитыми группами –SH, способными

непосредственно связываться с золотом. Размещение распознающих элементов на

подложке осуществляется тонкими иглами и капиллярами при помощи контактной (pin

printing

) или бесконтактной (ink-jet printing) микропечати. Малые порции

биоматериалов наносятся на определенные точки подложки.

6.2.«Микросистемы полного анализа» и «лаборатория на чипе». Аналитические

микрочипы (гибридизационные или матричные, микро- и нанофлюидные,

гибридные микрочипы).

В разделе 1.2 уже упоминалось о концепции создания новых аналитических

систем - "микроаналитических систем" (

-TAS – micro-Total Analysis System) и

"лабораторий на чипе" (LOC - Lab-on-a-Chip).

Основой таких систем является миниатюрное устройство – аналитический микрочип.

В общем случае в аналитическая система на микрочиповой платформе состоит из:

• Микрочипа,

• Вспомогательных устройств,

• Высокочувствительной системы детектирования,

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

• Микропроцессора (контроллеры, электроника),

• Программно-математического обеспечения,

• Методик анализа,

• Баз данных.

Существующие микрочипы условно можно разделить на несколько классов:

матричные (гибридизационные), микрофлюидные (к ним же можно отнести и

нанофлюидные) и гибридные микрочипы

В матричных чипах (биочипах) осуществляется локальная иммобилизация селективно

чувствительных веществ (рецепторов) на небольшом участке инертной подложки, что

дает возможность проведения качественного, а в некоторых случаях и количественного

экспресс-анализа.

Микро/нанофлюидные чипы представляют собой устройства, в которых с помощью

современных технологий на небольшой площадке сформированы различные

функциональные элементы: смесители, нагревательные камеры, фильтры, реакционные

камеры, сепарационные и разделительные устройства, камеры сбора фракций, датчики,

насосы и т.п. В этих устройствах обеспечена возможность проведения манипуляций с

изучаемым объектом - пробой: ввод, дозирование пробы, перемешивание, смешивание

с реагентами, специфические реакции, разделение полученного продукта на

компоненты, сбор разделенных компонентов, обнаружение и регистрацию

компонентов.

В гибридных микрочипах пытаются объединить достоинства матричных чипов (высокая

селективность и экспрессность определения) и преимущества микрофлюидных чипов

(проведение измерений в непрерывном режиме, расширенные манипуляции с пробой и

т.д.).

6.3.Биочипы. Получение гибридизационных микро- и наночипов. Принципы

функционирования. Протеомный анализ.

Биочип - это микроматрица различных соединений, главным образом биополимеров,

иммобилизованных на поверхности стекла, в микрокаплях геля, в микрокапиллярах и

т.п. Эффективность биочипов обусловлена возможностью параллельного проведения

огромного количества специфических реакций и взаимодействий молекул

биополимеров, таких как ДНК, белки, полисахариды и др. Биочип позволяет получить

огромное количество биологической информации.

На пластине биочипа наносится до нескольких тысяч различных микротестов

(биологические макромолекул - ДНК, белков, ферментов), способных избирательно

связывать вещества, содержащиеся в анализируемом растворе. Обычно технология

биочипа основана на принципе высоко специфического взаимодействия нуклеиновых

оснований. В ходе реакции происходит взаимодействие комплементарных цепей ДНК:

одна из них (ДНК-проба) с известной последовательностью нуклеотидов

зафиксирована на подложке, а другая одноцепочечная ДНК-мишень (зонд), меченная

флуоресцентной меткой, вносится в ДНК-чип. На рис. 6.3.1 показан принцип действия

ячейки ДНК или олигонуклеотидного биочипа, основанный на комплементарных

взаимодействиях основания аденина (А) с тимином (Т) или/и гуанина (G) с цитозином

(С) в двух нитях ДНК. Если последовательность оснований в одной нити ДНК (или

олигонуклеотида) полностью комплементарна последовательности другой нити, то

образуется стабильная двухнитчатая спираль - дуплекс. Однако присутствие в дуплексе

даже одной неправильной пары, например G-G, предотвращает образование дуплекса.

Если иммобилизовать в одном из элементов микрочипа специфическую

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

одноцепочечную ДНК или, положим, олигонуклеотид (пробу) содержащий 20

оснований, то при добавлении к микрочипу меченных флуоресцентными красителями

фрагментов ДНК, например генома человека, будет происходить их

высокоспецифичное взаимодействие. Заданный олигонуклеотидный элемент биочипа

специфически свяжет только одну комплементарную последовательность из

≈1.09H10

всех возможных последовательностей этой длины в ДНК. В результате

флуоресцентное свечение наблюдается только на этом комплементарном элементе

биочипа. Таким образом, один элемент биочипа производит одну выборку примерно из

множества возможных вариантов.

Рисунок 6.3.1. Принцип функционирования ДНК-биочипа.

Стандартный процесс получения биочипов иллюстрируется рис. 6.3.2.

Развиваемые в последние годы биологические микрочипы позволяют реализовать в

доступной форме сложные подходы геномики, протеомики и методов анализа клетки.

Детектирование происходящих на биочипах процессов осуществляется с помощью

флуоресцентных, хемилюминисцентных и масс-спектрометрических методов.

Хемилюминисцентные методы, хотя и уступают по чувствительности

люминесцентным, позволяют значительно упростить и удешевить регистрирующую

аппаратуру. Кроме того, разработан специальный метод прямого анализа соединений

непосредственно в гелевых элементах с помощью специальных методов масс-

спектрометрии. Этот важный в протеомике метод позволяет проводить

дополнительную идентификацию взаимодействующих с биочипами соединений по их

массе.

Детекция сигнала осуществляется специально разработанными флуоресцентными

сканерами. Например, система детекции компании Affymetrix - лазерное конфокальное

сканирующее устройство (НP), позволяющее регистрировать участки чипа с

А.А. Евстрапов. Курс лекций «Нанотехнологии в экологии и медицине»

разрешением в несколько мкм. Система детекции Genetic MicroSystems имеет

разрешающую способность ~ 10 мкм и чувствительность ~ 1 молекула

флуоресцентного красителя на 1 мкм

Характерные размеры ячеек микрочипов лежат в интервале от 50 до 200 мкм, объемы

отдельной ячейки от 1 нл до 1 мкл, значения характерных концентраций

анализируемых макромолекул в пределах 1 пM−10 мкM. Общее число ячеек на чипе ~

−10

, линейные размеры чипа ~1 см.

Рисунок 6.3.2. Основные стадии изготовления биочипов.

Протеомный анализ.

Слово "протеом" образовано от слова "протеин" (белок) и окончания слова

"геном", так что в самом названии как бы слиты воедино белок и геном. Протеом -

набор белков данной клетки в данной фазе ее развития в данный момент времени -

меньше генома по общему объему информации.

Протеом - понятие динамическое, тогда как геном стабилен и постоянен, иначе было

бы невозможно передать наследственные свойства от поколения к поколению,

обеспечить сохранение видов и т.д.

Белки (протеины, полипептиды) — высокомолекулярные органические вещества,

состоящие из соединённых в цепочку пептидной связью аминокислот. В живых

организмах аминокислотный состав белков определяется генетическим кодом, при

синтезе в большинстве случаев используется 20 стандартных аминокислот. Множество

их комбинаций дают большое разнообразие свойств молекул белков. Кроме того,

аминокислоты в составе белка часто подвергаются посттрансляционным

модификациям, которые могут возникать и до того, как белок начинает выполнять

свою функцию, и во время его «работы» в клетке.

Протеомика - изучение белков и их взаимодействия в живых организмах, в том числе,

в человеческом. Часто можно прослеживать связь между изменениями протеинов и их

взаимодействием и болезненными состояниями. Таким образом, протеомика может

значительно ускорять разработку эффективных лекарственных средств. Сегодня более

95% всех фармакологических средств на рынке нацелены на воздействие на протеины.

Протеины служат для выполнения огромного числа функций в организме. Например:

энзимные протеины служат катализаторами таких функций как пищеварение;