Емцев В.Т., Мишустин Е.Н. Микробиология: учебник для вузов

Подождите немного. Документ загружается.

Рис. 46. Схема образования клубенька

на корне бобового растения: 1 — инфи-

цированный корневой волосок; 2 — ин-

фекционная нить; 3 — делящиеся клетки

растения; 4 — эндодерма; 5 — централь-

ный цилиндр корня; 6 — ксилема

(по: Г. Торнтон)

вом волоске клубеньковые бакте-

рии образуют так называемую

инфекционную нить. Последняя

представляет собой гифообразную

слизистую массу, в которую по-

гружены размножающиеся клетки

клубеньковых бактерий. Нить пе-

редвигается к основанию волоска

и клеткам эпидермиса. Такой

путь, равный 100—200 мкм, она

проходит за одни-двое суток, т. е.

со скоростью 5—8 мкм/ч. Затем

нить из корневого волоска про-

никает через клетки коры в па-

ренхиму.

После внедрения в расти-

тельные клетки инфекционная

нить покрывается целлюлозной

оболочкой, которая формируется

из целлюлозной оболочки клетки,

вероятно, для изоляции клубень-

ковых бактерий. Клубеньковые

бактерии могут размножаться

только в тетраплоидных клетках коры и частично эпидермиса кор-

ня. Когда на пути инфекционной нити встречаются тетраплоидные

клетки, часть бактерий переходит из нити в цитоплазму и начинает

там размножаться. После инфицирования клубеньковыми бактерия-

ми растительная клетка, а также соседние незараженные начинают

активно делиться. Усиленное размножение инфицированных клеток

и находящихся под их стимулирующим влиянием (при участии рос-

тового вещества) соседних незараженных клеток приводит к форми-

рованию ткани клубенька (рис. 46). Обычно инфекция распростра-

няется через тетраплоидные клетки, а кора и проводящие сосуды

клубенька образуются из диплоидных клеток.

Бактероиды. Клетки клубеньковых бактерий, перешедшие

в цитоплазму растительных клеток, растут, делятся, а затем транс-

формируются в своеобразные образования — бактероиды. Этим за-

канчивается процесс инфицирования — приблизительно через

три-четыре недели после заражения. Бактероиды в 3—5 раз больше

по размерам, чем обычные клетки, причем их форма меняется в за-

висимости от вида бобового растения от шаровидной и грушевид-

ной до вильчатой и ветвистой (рис. 47). Бактероиды не делятся, они

составляют до 50% массы клубенька.

Клубеньковые бактерии в клетках растения располагаются в ва-

куолях, окруженных перибактероидной мембраной — производным

224

плазмалеммы растительной клет-

ки. Бактероиды содержат больше

поли-B-гидроксимасляной кислоты,

гликогена и полифосфатов, чем

обычные клетки клубеньковых бак-

терий, но меньше ДНК. Фактиче-

ски бактероиды становятся своего

рода азотфиксирующими органел-

лами клеток бобового растения-

хозяина. Поэтому их называют

азотосомами. Таким образом, рас-

смотренный симбиоз является вну-

триклеточным.

Ткань клубенька, заполнен-

ная бактероидами, обычно приоб-

ретает красноватую окраску благо-

даря пигменту леггемоглобину, род- Рис. 47. Клетки клубеньковой ткани,

ственному гемоглобину. Обычно наполненные бактероидами клубень-

такая окраска характерна для клу- ковых бактерий (по: Ф. Бергерсен)

беньков, активно фиксирующих азот. Леггемоглобин выявляют уже

на второй день после образования клубенька, а фиксацию азота —

на четвертый день.

Леггемоглобин — один из важнейших продуктов симбиоза; в его

образовании участвуют оба партнера — растение и бактерии: просте-

тическая группа (протогем) синтезируется бактериями, а белковый

компонент (апогемоглобин) образуется при участии растения. Легге-

моглобин непосредственно не участвует в фиксации молекулярного

азота, так как бактероиды могут связывать азот и без этого пигмента.

Однако леггемоглобин обладает высоким сродством к кислороду,

что облегчает его диффузию через клетку растений к бактероиду.

Благодаря такой особенности леггемоглобина бактероиды получают

кислород в количестве, достаточном для их роста и получения энер-

гии. В то же время в клубеньке не возникает слишком высокого пар-

циального давления кислорода, которое могло бы оказывать ингиби-

рующее влияние на фиксацию азота бактероидами.

Клубеньки, образованные активными и неактивными клу-

беньковыми бактериями, различают по ряду признаков. Клубеньки,

образовавшиеся при инфицировании неактивными клубенько-

выми бактериями, содержат мало леггемоглобина и имеют зеленова-

тый цвет. Клубеньки, образованные активными штаммами, ок-

рашены в розовый цвет. Кроме того, клубеньки неодинаково рас-

пределены по корневой системе растений. Активные расы

клубеньковых бактерий образуют многочисленные клубеньки на

главном корне, а на боковых их бывает мало.

По мере старения и дегенерации клубеньки отмирают. Опре-

деленную роль в этом процессе играет опробковение клеток сосу-

8 Микробиология

225

дистой системы, задерживающее обмен питательными веществами

между растением-хозяином и клубеньком. В клетках клубеньков по-

являются вакуоли, ядро перестает окрашиваться, а бактероиды рас-

творяются (лизируются). Лизис бактероидов по окончании актив-

ной жизни клубеньков обычно совпадает с некрозом клубеньков,

наступающим после цветения растения-хозяина. Бактерии, сохра-

нившиеся в неразвившихся инфекционных нитях, выходят в почву,

где могут довольно долго (от одного года до 20 лет) существовать

в отсутствие растения-хозяина.

У однолетних растений клубеньки также однолетние, у мно-

голетних клубеньки могут функционировать в течение ряда лет.

К концу сезона бактероидная ткань клубеньков многолетних расте-

ний разрушается, но клубеньки не отмирают и на следующий год

вновь начинают функционировать.

Количество клубеньков на корнях бобовых растений всегда

более или менее ограниченно. Клубеньки содержат больше азота,

чем остальные части растения. Это служит доказательством того,

что именно в клубеньках протекает процесс усвоения азота. Причем

фиксация азота атмосферы осуществляется только в бактероидах, и

около 90% связанного азота переходит из них в виде ионов аммония

в цитоплазму корня бобового растения. Передача связанного азота

из тканей клубенька в наземную часть растения происходит в пери-

од, когда бактероиды жизнеспособны. Определенное количество ус-

военного растениями азота выделяется корнями в почву с продукта-

ми корневых выделений, например с аминокислотами (аспарагино-

вой кислотой).

Условия формирования азотфиксирующей ассоциации. Эф-

фективность азотфиксации симбиотической ассоциации бобовое

растение — клубеньковые бактерии определяется наличием у клубень-

ковых бактерий целого комплекса симбиотических приз-

наков:

• вирулентности — способности клубеньковых бактерий вхо-

дить в контакт с корневой системой бобовых растений, про-

никать в ткани корня, размножаться в них и индуцировать

образование клубеньков;

• азотфиксирующей активности — способности связывать мо-

лекулярный азот атмосферы при помощи специальной фер-

ментативной системы и превращать его в ионы аммония;

• эффективности — способности увеличивать урожай и содер-

жание белка у бобового растения-хозяина за счет передачи

растению фиксированного азота и синтезированных биоло-

гически активных веществ;

• конкурентоспособности — способности внесенного в почву

определенного штамма клубеньковых бактерий образовы-

вать клубеньки в присутствии других штаммов того же вида;

226

• специфичности — способности вступать в эффективный сим-

биоз со строго определенным набором сортов и видов бобо-

вых растений.

Перечисленные признаки генетически обусловлены и детер-

минированы в определенных генах. Так, способность к симбиозу

у клубеньковых бактерий обычно детерминирована плазмидными

генами: hos-гены обусловливают узнавание хозяина; nod-гены опре-

деляют способность образовывать клубеньки; nif-гены — способ-

ность к связыванию молекулярного азота. Плазмиды, в которых ло-

кализованы указанные гены, называют sym-плазмидами (от англ.

symbiosis inducing). У разных видов, а в ряде случаев и штаммов клу-

беньковых бактерий, число и размеры плазмид сильно варьируют.

Так, отдельные штаммы бактерий могут иметь до семи плазмид мо-

лекулярной массой от 80 до 4000 МД.

Формирование симбиоза бобовых растений с клубеньковыми

бактериями обеспечивается согласованным взаимодействием гено-

мов растений и бактерий. Процесс возникновения и функциониро-

вания симбиотического сообщества сопровождается изменением

экспрессии некоторых растительных и бактериальных генов. Ряд

растительных генов, необходимых для возникновения симбиоза и

осуществления азотфиксации, определены в генетических экспери-

ментах.

Взаимодействие бактерий и растений базируется на существо-

вании специальных генетических структур, связанных общими регу-

лирующими механизмами. У бобового растения гены контролируют

способность к формированию симбиотических взаимоотношений и

место инфицирования. Например, штамм клубеньковых бактерий

коровьего гороха заражает растение через корневые волоски, а штамм

люпина — через «расщелины» в эпидермисе коры в местах отхожде-

ния боковых корешков. Геном бобового растения оказывает влия-

ние на дифференцировку и морфологию бактероидов, количество

клеток бактероидов, которые локализованы в одной вакуоли. Счита-

ют, что между бобовым растением и бактериями возможен прямой

обмен генами.

Проявлением экспрессии генов служит возникновение в рас-

тении специфичных белков в ответ на инфицирование его клубень-

ковыми бактериями. Идентифицировано уже около 40 растительных

белков — нодулинов, появляющихся лишь в клубеньках. Гены ноду-

линов обеспечивают бобовым растениям уникальную возможность

удовлетворять потребности в азоте за счет его фиксации из воздуха.

Можно считать установленным, что эффективность симбиотическо-

го сообщества бобовые растения — клубеньковые бактерии опреде-

ляется в большей степени генотипом растения-хозяина, чем геноти-

пом бактерий-симбионтов.

227

Рис. 48. Растения клевера, зараженные

клубеньковыми бактериями: слева —

растения, зараженные, активным

штаммом; справа — растения, заражен-

ные неактивным штаммом

Эффективность функциони-

рования симбиотического аппа-

рата также во многом зависит от

способности бактерий активно

фиксировать молекулярный азот

в симбиозе с растением. В почве

могут присутствовать штаммы клу-

беньковых бактерий активные, не-

активные и переходные между ни-

ми. Заражение бобовых растений

активными штаммами клубенько-

вых бактерий способствует актив-

ной фиксации азота. Неактивный

штамм дает образование клубень-

ков, но фиксации азота в них не

происходит (рис. 48). Активность

клубеньковых бактерий меняется

и в зависимости от внешних усло-

вий. Особенно легко бактерии те-

ряют активность при неблагопри-

ятных почвенных условиях.

Исследования показывают,

что неактивные штаммы клубень-

ковых бактерий в почвах если и не

преобладают, то встречаются очень часто. Возможно, уменьшение

активности клубеньковых бактерий вызывается комплексом небла-

гоприятных свойств почв: повышенной кислотностью, недостатком

органических веществ и т. д.

Обычно почвы содержат в достаточно большом количестве

клубеньковые бактерии тех видов бобовых растений, которых много

в составе дикой флоры данной местности или которые длительное

время там культивируются. Если в данной местности не произраста-

ет определенный вид бобовых или родственные ему по инокуляци-

онной способности виды, то и свойственные им клубеньковые бак-

терии в почвах отсутствуют. Поэтому для обеспечения эффективного

симбиоза семена бобовых перед посевом заражают высокоактивны-

ми штаммами клубеньковых бактерий, специфичных для данного

растения.

На количество клубеньковых бактерий в почве влияют ее

свойства и состояние. Например, в нейтральных почвах (черноземах

и др.) бактерии размножаются лучше, чем в кислых, здесь чаще

встречаются активные формы. Окультуривание почв, особенно с

внесением органических удобрений, улучшает условия для размно-

жения клубеньковых бактерий.

228

11.4. Бактерии-симбионты небобовых растений

У многих небобовых растений, как древесных и кустарниковых, так

и травянистых, также существуют корневые клубеньки, способные

связывать молекулярный азот. Фиксация азота в таких случаях, как

и у бобовых, основана на симбиозе с прокариотами. У древесной и

кустарниковой растительности клубеньки чаще всего образуются

азотфиксирующими актиномицетами, у травянистой — бактериями.

В большинстве случаев симбионтами деревьев и кустарников служат

актиномицеты рода Frankia (рис. 49). Это аэробные организмы

с септированным мицелием, образующим спорангии.

Известны 17 родов древесных и кустарниковых покрытосе-

менных растений, образующих с Frankia клубеньки. Они относятся

к порядкам Casuarinales, Coriariales, Fagales, Cucurbitales, Myricales,

Rhamnales и Resales. Среди растений, которые весьма эффективно

связывают азот, казуарина (Casuarina), ольха (Alnus), облепиха (Hip-

pophae), менее эффективны в этом отношении восковница (Myrica),

куропаточья трава (Dryas), лох (Elaeagnus) и шефердия (Shepherdia).

Корневые клубеньки древесных растений довольно крупные,

обычно они формируются на боковых корнях. Клубеньки бывают

двух типов — коралловые (густые сплетения корней, разветвленных

наподобие кораллов) и с прорастающими через дольки клубенька

корнями (рыхлый пучок утолщенных корней), направленными

Рис. 49. Влияние заражения актиномицетами рода Frankia на рост ольхи:

А, В — растения, инфицированные Frankia; Б — незараженное растение

(по: С. О. Суэтин)

229

вверх. Первый тип клубеньков наблюдается у ольхи и облепихи,

второй — у казуарины. Установлено, что азотфиксирующие актино-

мицеты обладают определенной специфичностью к растениям. На-

пример, одна группа Frankia заражает ольху, восковник и «сладкий»

папоротник (компония), другая — лох, облепиху и шефердию.

Актиномицеты-симбионты способны инфицировать только

паренхимные клетки коры корня. Как и при заражении бобовых,

микроорганизм проникает в корни из почвы через корневые воло-

ски, которые в результате скручиваются. В месте инфицирования

стенки корневого волоска утолщаются и гифы, проникшие внутрь

клетки, покрываются толстым чехлом. По мере продвижения гиф

по корневым волоскам чехол утоньшается, и вокруг гиф формирует-

ся капсула, которая, как считают, образуется как растением, так и

актиномицетом.

Из корневого волоска гифы проникают в эпидермис и кору

корня, вызывая деление и гипертрофию инфицированных клеток.

Как правило, клубки гиф заполняют центр клеток растения, у кле-

точных стенок происходит расширение и деление концов гиф,

в последнем случае формируются специфичные структуры, так на-

зываемые везикулы (рис. 50). В клубеньках образуется вещество, по-

добное леггемоглобину бобовых растений. В конце вегетации вези-

кулы деградируют, но в клетках растений сохраняются гифы, зара-

Рис. 50. Везикулы, образованные мицелием Frankia в клубеньках ольхи

(по: И. Гарднер)

230

жающие весной новые ткани. Обычно при симбиозе с небобовыми

растениями энергия азотфиксации актиномицетами рода Frankia

больше, чем у клубеньковых бактерий бобовых растений.

Клубеньки обнаружены у большой группы травянистых расте-

ний — злаковых, осоковых, лютиковых и др. В клубеньках этих рас-

тений выявлены микробные ассоциации, состоящие из двух-трех

видов микроорганизмов, которые представлены грамположительны-

ми и грамотрицательными бактериями. Установлено, что в клубень-

ках осуществляется азотфиксация, однако роль отдельных бактерий

в нем пока не определена.

В последнее время из клубеньков на растениях, не относя-

щихся к бобовым, — тропическом кустарнике Trema orientalis

(семейство крапивных) и близком к нему Parasponia parviflora — вы-

делены бактерии, близкие к клубеньковым бактериям бобовых. Ука-

занные бактерии способны заражать бобовые растения и образовы-

вать клубеньки. Их относят к роду Rhizobium. Из клубеньков на

листьях тропических кустарников Pavetta и Psychotria выделены

азотфиксирующие бактерии, отнесенные к роду Klebsiella {Klebsiella

rubacearum). Листовые клубеньки также обогащают растение азотом.

Поэтому в Индии, Шри-Ланке и других странах листья Pavetta ис-

пользуют как зеленое удобрение.

Азотфиксирующие симбионты обогащают почву азотом в сле-

дующей степени: однолетние бобовые (фасоль, соя, вика, бобы, го-

рох, чечевица) накапливают 40—110 кг/га азота в год), многолетние

(клевер, люцерна) — 150—220, тропическое бобовое — Sesbania ros-

trata — от 324 (сухой сезон) до 458 (влажный сезон), небобовые рас-

тения — 150—300 кг/га азота в год.

11.5. Биохимия азотфиксации

Молекула азота характеризуется очень прочной тройной связью, кото-

рая обусловливает инертные свойства газа. Так, азот с трудом вступает

в химическую связь с другими элементами и веществами. Используе-

мый в производстве азотных минеральных удобрений метод Габера—

Боша, заключающийся в синтезе аммиака из молекулярного азота и

водорода на катализаторах, требует высоких температуры и давления.

В то же время микробиологическое связывание молекулярного азота

осуществляется при обычных температуре и давлении.

Фиксация азота атмосферы представляет собой восстанови-

тельный процесс, и первым его продуктом, который можно вы-

явить, служит аммиак. Процесс восстановления азота представляет

собой ряд ферментативных реакций, осуществляемых ферментным

комплексом нитрогеназой. Активный центр нитрогеназы содержит

два компонента: первый состоит из белка, в состав которого входят

молибден, железо и сера, или Mo-Fe-белка, второй — из белка, со-

держащего железо и серу, или Fe-S-белка. Выявлена также ванадий-

231

содержащая нитрогеназа, однако уровень активности ее на 30% ни-

же, чем у молибденсодержащей нитрогеназы. В природных субстра-

тах при нехватке молибдена последний может замещаться ванадием.

Впервые нитрогеназа была обнаружена в клетках анаэробного

азотфиксатора Clostridium pasteurianum, затем у аэробных свободножи-

вущих бактерий, клубеньковых бактерий и других связывающих азот

микроорганизмов. Нитрогеназа и катализуемый ею процесс фиксации

азота характеризуются чрезвычайно высокой чувствительностью к мо-

лекулярному кислороду. Последний служит энергичным акцептором

водорода и подавляет образование восстановленных продуктов азота.

У свободноживущих азотфиксаторов существуют особые меха-

низмы, защищающие нитрогеназу от кислорода. Как уже отмечалось,

у клубеньковых бактерий функцию защиты нитрогеназы от высокого

парциального давления кислорода выполняет леггемоглобин, обла-

дающий высоким сродством к кислороду. Леггемоглобин цитоплазмы

клеток клубенька, в которых локализованы бактероиды, препятствует

свободному доступу кислорода, обеспечивая дозированное его пос-

тупление, что необходимо бактероидам для роста и получения энер-

гии, и в то же время не сказывается отрицательно на фиксации азота.

Считают, что процесс связывания молекулярного азота начина-

ется с поступления азота, растворенного в воде, в азотфиксирующий

центр, где в активации молекулы азота участвуют два атома молиб-

дена (рис. 51). В результате взаимодействия с азотом молибден вос-

станавливается, принимая электроны, которые поступают в активный

центр через Fe-S-белок и Mo-Fe-белок. Такой перенос электронов

связан с гидролизом АТФ, т. е. идет с затратой энергии. В транспорте

электронов к нитрогеназе принимает участие железосодержащий

водорастворимый белок-фермент ферредоксин, а в активации водо-

рода воды и переносе протонов — фермент гидрогеназа.

Рис. 51. Схема взаимосвязи процессов, лежащих в основе фиксации

молекулярного азота (по: В. Л. Кретович)

232

Восстановленный ферредоксин, служащий донором электро-

нов, образуется у свободноживущих азотфиксаторов рода Clostridium

при так называемом фосфорокластическом расщеплении пирувата с

образованием ацетилфосфата, а у пурпурных зеленых серобактерий

и цианобактерий — в процессе фотосинтеза.

Главный источник АТФ у аэробных азотфиксаторов — окис-

лительное фосфорилирование, у анаэробных — фосфорокластиче-

ская реакция, у фототрофных фиксаторов азота — фотофосфорили-

рование. Для клубеньковых бактерий источником энергии для про-

цесса фиксации азота служат продукты фотосинтеза, поступающие

из листьев растений. Они трансформируются и запасаются в бакте-

роидах главным образом в виде поли-В-гидроксимасляной кислоты,

при использовании которой происходит образование АТФ.

Восстановление одной молекулы азота до двух молекул NH

требует

затраты энергии в виде 12 молекул АТФ:

+ 6Н

+ бе

+ 12АТФ > 2NH

+ 12АДФ + 12Ф

Как видно, процесс фиксации молекулярного азота связан с затратами

большого количества энергии. Например, Clostridium pasteurianum для связы-

вания 1 мг N

в процессе брожения перерабатывает 500 мг сахара. Источни-

ками протонов, электронов и АТФ служат процессы брожения (у анаэроб-

ных азотфиксаторов), дыхания (у аэробных азотфиксаторов) и фотосинтеза

(у цианобактерий, пурпурных и зеленых серных бактерий).

Восстановление молекулярного азота до аммиака осуществ-

ляется в три последовательные стадии. Вначале N

превращается

в диимид (HN=NH), затем в гидразин <H

N—NH

и, наконец, в NH

Установлено, что нитрогеназа может восстанавливать не толь-

ко молекулярный азот (N=N), но и ацетилен (НС=СН), азид, за-

кись азота, цианид, нитриты, изонитрилы и протоны. На восстанов-

лении ацетилена основан метод, который используют для выявле-

ния нитрогеназы. Ацетилен восстанавливается только до этилена,

который достаточно легко определить методом газовой хроматогра-

фии. Все до настоящего времени изученные азотфиксирующие бак-

терии и симбиотические ассоциации обладают способностью восста-

навливать ацетилен в этилен. Нитрогеназная система при участии

АТФ катализует также восстановление протонов, сопряженно обра-

зующихся в процессе азотфиксации, до молекулярного водорода.

Аммиак, образовавшийся в процессе фиксации N

, связыва-

ется кетокислотами, что приводит к синтезу аминокислот. Так, из

233

2-оксоглутарата и аммиака получается глутаминовая кислота. Глу-

таминовая кислота с затратой энергии в виде АТФ превращается в

глутамин, а из него синтезируется важнейший метаболит — аспара-

гин. Из щавелевоуксусной кислоты и аммиака образуется аспараги-

новая кислота, из пирувата и NH

— а-аланин и т. д. В дальнейшем

аминокислоты идут на синтез белков и других азотсодержащих ор-

ганических соединений.

Процесс связывания молекулярного N

бактериями подвер-

жен регуляции. Так, у многих микроорганизмов синтез нитрогеназы

происходит только тогда, когда она нужна, т. е. когда в среде отсут-

ствует источник связанного азота. В присутствии ионов аммония

синтез фермента подавляется. В регуляции образования нитрогена-

зы важная роль принадлежит ферменту глутаминсинтетазе. Глута-

минсинтетаза и глутаматсинтаза необходимы микроорганизмам,

чтобы включать ионы аммония в органические соединения в тех

случаях, когда их концентрация NH

низка. Благодаря высокому

сродству к ионам аммония эти ферменты поддерживают концентра-

цию NH

в бактериальной клетке на низком уровне. Увеличение

концентрации ионов аммония в среде, а следовательно, и внутри

клетки бактерии, ингибирует глутаминсинтетазу, а в конечном итоге

и синтез нитрогеназы.

Бактериальные гены, вовлеченные в процесс азотфиксации,

обозначаются индексами nif и fix. Синтез нитрогеназного комплекса

у микроорганизмов непосредственно кодируется 17 nif-генами, ко-

торые либо входят в состав хромосомы (Klebsiella, Bradyrhizobium),

либо существуют в форме огромной мегаплазмиды (Rhitobium). Ос-

тальные гены, участвующие в азотфиксации (кроме nif-генов), отно-

сят к fix-генам. Гены nif высококонсервативны, поэтому при пе-

реносе в другие виды бактерий продукты указанных генов легко

«вписываются» в метаболизм нового хозяина. Следовательно, спо-

собность к связыванию азота может передаваться от одной бактерии

к другой при прямом межклеточном контакте. Благодаря существо-

ванию эффективных систем обмена генетической информацией nif-

гены достаточно широко распространены в мире микроорганизмов.

В 80-х гг. XX столетия разрабатывался генно-инженерный про-

ект, направленный на перенос nif-генов в высшие растения с тем,

чтобы обеспечивать фиксацию азота непосредственно в растительных

тканях независимо от наличия симбиотических микроорганизмов.

В рамках этого проекта была предпринята попытка передать группу

nif-генов Klebsiella pneumoniae в клетки низших эукариот — дрожжей.

В одном случае все 17 nif-генов были интегрированы в хромосому

дрожжей, а в другом — была осуществлена трансформация дрожже-

вых клеток автономной плазмидой со встроенной nif-областью.

Однако в обоих типах трансформированных клеток дрожжей —

и с хромосомой, и с плазмидной локализацией nif-области — отсут-

234

ствовала как фиксация азота, так и заметная экспрессия каких бы

то ни было трансформированных генов. Осуществление азотфикса-

ции вне клеток азотфиксирующих бактерий сопряжено с большими

трудностями, в частности, поскольку для связывания N

, помимо

нитрогеназы необходимы еще специфичные железо- и серосодержа-

щие белки, требуется также защита этого фермента от кислорода.

Однако удалось передать nif-гены от Klebsiella pneumoniae к Escheri-

chia coli при конъюгации, при этом наблюдались нормальная экс-

прессия nif-генов и успешная азотфиксация. Успешно проведены и

другие эксперименты по переносу плазмидных nif-генов в клетки

неазотфиксирующих прокариот.

Контрольные вопросы и задания

1. Каково значение фиксации молекулярного азота для растений? 2. Приведите

примеры свободноживущих микроорганизмов, усваивающих азот. 3. В чем суть

ассоциативной азотфиксации и какие микроорганизмы ее выполняют? 4. Ка-

кие растения вступают в симбиотические отношения с азотфиксирующими

бактериями? 5. Перечислите симбиотические признаки клубеньковых бак-

терий. 6. На какие стадии можно разделить процесс восстановления моле-

кулярного азота до аммиака?

Глава 12

Микробиологические

превращения соединений серы,

фосфора, железа

В биосфере постоянно происходит круговорот элементов, в ко-

тором основная роль принадлежит микроорганизмам. В предыдущих

главах мы познакомились с разнообразными микробиологическими

процессами, которые связаны с превращениями углерода, кислоро-

да и азота. Ниже рассматриваются циклические превращения таких

важных элементов, как сера, фосфор и железо.

12.1. Биологический цикл соединений серы

Сера — необходимый питательный элемент для организмов. В почве

она встречается в форме сульфатов — CaSO

• 2Н

О, Na

, K

(NH

)

, сульфидов — FeS

, Na

S, ZnS и органических соедине-

ний. Сера содержится в аминокислотах белков — растений, живот-

ных и микроорганизмов, валовые ее запасы в почвах сравнительно

невелики, и растения часто испытывают недостаток в ней.

Органические и неорганические формы серы под влиянием де-

ятельности микроорганизмов подвергаются в почве различным пре-

235

Рис. 52. Биологический цикл превращения серы

вращениям. Направление трансформаций соединений серы регулиру-

ется в основном факторами внешней среды. Органические соедине-

ния серы могут быть разрушены и минерализованы. В определенных

условиях восстановленные неорганические соединения серы подвер-

гаются окислению микроорганизмами, а окисленные (сульфаты,

сульфиты и др.), наоборот, могут быть восстановлены в H

S (рис. 52).

Окисление соединений серы. Среди активных окислителей

восстановленных неорганических соединений серы можно выделить

следующие группы микроорганизмов:

• тионовые бактерии, представленные родами Thiobacillus,

Thiosphaera, Thiomicrospira, Thiodendron, а также ахребакте-

рии рода Sulfolobus;

• одноклеточные и многоклеточные (нитчатые, образующие

трихомы) формы, относящиеся к родам Achromatium, Thio-

bacterium, Thiospira, Beggiatoa, Thiothrix, Thioploca и др.;

• фотосинтезирующие пурпурные и зеленые серные бакте-

рии, а также некоторые цианобактерии;

• хемоорганогетеротрофные организмы родов Bacillus, Pseudo-

monas, актиномицеты и грибы (Penicillium, Aspergillus).

Микроорганизмы первой группы обитают в почве. Нитчатые

формы встречаются главным образом в грязевых водоемах, воз-

можно их развитие в затопленных почвах, содержащих восстанов-

236

ленные формы серных соединений. Фотосинтезирующие бактерии

преимущественно обитают в водной среде (пруды, морские лагуны,

озера и т. д.).

Наиболее широко распространены тионовые бактерии рода

Thiobacillus, впервые выделенные из морского ила в 1902 г. М. На-

тансоном, а в 1904 г. — М. Бейеринком. Представители данного ро-

да способны окислять тиосульфат, сероводород, сульфиды, тетрати-

онаты и тиоцианаты. Наиболее изучены виды: Т. thiooxidans, Т. thio-

parus, Т. novellus, Т. denitrificans, Т. ferrooxidans и др.

Бактерии рода Thiobacillus представляют собой неспорообра-

зующие грамотрицательные палочки длиной от 1 до 4 мкм, диа-

метром около 0,5 мкм. Большинство видов рода подвижны и пере-

двигаются с помощью полярного жгутика. Источником углерода для

синтеза органических соединений бактерии служат СО

и бикарбо-

наты.

За исключением Т. novellus и некоторых других видов, относя-

щихся к факультативным хемолитоавтотрофам и хемолитогетеро-

трофам, представители рода Thiobacillus облигатные хемолитоавто-

трофы, т. е. живут за счет энергии, выделяющейся при окислении

неорганических соединений серы. Ход окислительных процессов,

вызываемых серными бактериями, может быть представлен следую-

щими уравнениями:

S + 1/

> S + Н

S + 2O

2S + ЗО

+ 2Н

О > 2H

5Na

+ 4О

+ Н

О > 5Na

+ H

+ 4S

2Na

+ 1/

+ H

O > Na

+ 2NaOH

Тетратионаты могут подвергаться дальнейшему окислению до

серной кислоты:

+ SO

+ 6Н

> Na

+ 3H

Гипотетическая цепь реакций окисления элементарной серы

бактериями рода Thiobacillus может быть представлена в следующем

виде:

По имеющимся данным, для окисления бактериями молеку-

лярной серы необходим ее контакт с клетками, причем скорость

237

процесса зависит от площади соприкосновения элемента с бактери-

альными клетками. Последнее позволяет предположить, что на кле-

точной поверхности бактерий действуют ферменты, способствую-

щие поступлению серы внутрь клетки, и под их влиянием сера

восстанавливается до сульфидного иона, окисление которого проис-

ходит в дальнейшем внутриклеточно. Sulfolobus sp. и Thiobacillus fer-

rooxidans кроме окисления серы обладают также способностью

окислять двухвалентное железо Fe

Тионовые бактерии — облигатные аэробы, за исключением

Т. denitrificans, который в присутствии нитрата развивается как ан-

аэроб. В последнее время обнаружены сероокисляющие бактерии,

способные к жизнедеятельности при рН 2—3 и температуре 70—75 °С

и сохраняющие жизнеспособность при 90 °С. Это термоацидофиль-

ные архебактерии, факультативные хемолитоавтотрофы рода Sulfolo-

bus. Распространены они в термальных серных источниках.

Одноклеточные бесцветные серобактерии представлены Achro-

matium, Thiobacterium, Macromonas, Thiospira и др. Эти организмы

имеют сферическую, овальную, палочковидную или извитую форму,

есть подвижные и неподвижные, грамотрицательные. К многокле-

точным бесцветным (нитчатым) серным бактериям относят микро-

организмы родов Beggiatoa, Thioploca, Thiothrix и др. Они окисляют

сероводород до элементарной серы, которая временно откладывает-

ся внутри клеток. Установлена способность бактерий указанных ро-

дов окислять серу и использовать органические вещества. Способ-

ность автотрофного усвоения СО

для снабжения клеток углеродом

пока не доказана.

Окисляют соединения серы также фотолитоавтотрофные пур-

пурные и зеленые серные бактерии. Они обычно обитают в среде, где

имеется H

S. Большой роли в почвах не играют.

Серу могут окислять многие хемоорганогетеротрофные мик-

роорганизмы, например некоторые виды родов Bacillus, Pseudomo-

nas, актиномицетов и грибов. Хемоорганогетеротрофные организмы

окисляют серу в присутствии органических веществ. Такое пре-

вращение представляется для них побочным процессом в главном

направлении метаболизма. Окисление серы хемоорганогетеротроф-

ными микроорганизмами идет довольно медленно и слабо.

Бактерии, окисляющие неорганические соединения серы,

применяют при разработке месторождений полезных ископаемых.

Так, проведены исследования, которые позволили начать примене-

ние окисляющих серу бактерий из рода Thiobacillus .(Т. ferrooxidans)

для выщелачивания бедных сульфидных руд. Наиболее практически

освоены методы микробиологического выщелачивания меди из ми-

нералов, в которых медь соединена с серой. Обработке подвергают

отвалы бедных руд на поверхности или под землей. Аналогично бак-

238

терии рода Thiobacillus можно использовать для получения различ-

ных металлов и редких элементов из минералов, содержащих серу.

Использование микробов в качестве «металлургов» экономиче-

ски выгодно. Стоимость меди, полученной микробиологическим вы-

щелачиванием, обходится в два с половиной раза дешевле, чем

гидрометаллургическим способом. Микробиологический способ раз-

работки полезных ископаемых применяют во многих странах мира.

Восстановление неорганических соединений серы. Оно осу-

ществляется при разнообразных обменных процессах. Сульфаты мо-

гут быть источником серы как для микро-, так и для макроорганиз-

мов. Усвоение данных соединений сопровождается восстановлением

серы в биосинтетических процессах, при так называемой ассимиля-

ционной сульфатредукции. Если растворимые сульфаты закрепляют-

ся в клетках микроорганизмов, процесс обозначают как иммобилиза-

цию серы.

В плохо аэрированных, затопляемых почвах, с дефицитом

кислорода, а также в водах лиманов, некоторых морей и других во-

доемов в зоне анаэробиоза происходит микробиологическое восста-

новление сульфатов в результате диссимиляционной сульфатредук-

ции, или сульфатного дыхания.

Среди бактерий, вызывающих восстановление сульфатов, наи-

более подробно изучены неспорообразующие — род Desulfovibrio

и спорообразующие — род Desulfotomaculum.

К роду Desulfovibrio относят неспороносные грамотрицательные

изогнутые палочки, иногда S-образные или спиральные, имеющие

полярные жгутики и отличающиеся большой подвижностью. Это об-

лигатные анаэробы, мезофилы (оптимальная температура 30 °С). Об-

наружены в морской воде или иле, пресной воде и почве. Типичный

вид — Desulfovibrio desulfuricans. Известны также D. vulgaris и D. gigas.

Среди представителей рода встречаются галофилы.

Бактерии рода Desulfotomaculum представлены грамотрица-

тельными, прямыми или изогнутыми спорообразующими подвиж-

ными палочками с перитрихальным расположением жгутиков. Это

облигатные анаэробы, восстанавливающие сульфаты до сульфидов.

Они обнаружены в пресных водах, почвах, геотермальных областях,

некоторых испорченных продуктах, в кишечнике насекомых и руб-

це животных. Desulfotomaculum nigrificans может превращать сульфа-

ты в сульфиды при высоких температурах (оптимум 55 °С). К роду

Desulfotomaculum относят также D. orientis, представленный изогну-

тыми палочками, D. ruminis и О. acetooxidans, имеющие прямые па-

лочки.

Обнаружен ряд новых сульфатредуцирующих бактерий, —

в частности, рода Desulfobacter с неспорообразующими палочками,

родов Desulfococcus и Desulfosarcina, представленных кокковыми

239

формами, и рода Desulfonema, — имеющих нитевидную форму и пе-

редвигающихся скольжением.

Сульфатредуцирующие бактерии — специализированная груп-

па анаэробных микроорганизмов, использующих сульфат как ак-

цептор электронов (водорода) для окисления органических соедине-

ний или водрода. Большинство сульфатредуцирующих бактерий

относится к гетеротрофам, но известны и автотрофные виды.

Донором электронов (водорода) для сульфатредукторов служат орга-

нические соединения (кислоты, спирты), а также молекулярный во-

дород; продуктом восстановления соединений серы является H

Анаэробное окисление органических веществ некоторыми

сульфатредуцирующими бактериями (Desulfotomaculum nigrificans,

D. orientis, D. ruminis, D. vulgaris, D. desulfuricans и др.) является не-

полным и ведет к аккумуляции уксусной кислоты и ее солей как ко-

нечного продукта:

Другие виды осуществляют полное окисление органических

веществ, в том числе и ацетата, до СО

Восстановлению могут подвергаться и другие соединения се-

ры, например тиосульфаты и молекулярная сера. Восстановление

и S

2 -

до S

° осуществляют облигатно анаэробные бактерии

Clostridium thermosulfurogenes, выделенные из термального источника.

Это хемоорганогетеротрофы, термофилы, они могут вызывать бро-

жение с образованием этанола, молочной и уксусной кислот, Н

осуществляют гидролиз пектина и крахмала. Восстановление ти-

осульфата С. thermosulfurogenes выполняют с образованием молеку-

лярной серы, которая откладывается на их клеточных стенках и вы-

деляется в среду.

Молекулярную серу могут восстанавливать до H

S многие

термоацидофильные облигатно анаэробные архебактерии — Desulfu-

rococcus mucosus, Pyrococcus furiosus, Thermoproteus tenax и др. Пере-

численные виды обитают в кислых гидротермальных источниках.

Так, для Pyrococcus furiosus оптимальная кислотность среды состав-

ляет 1, температурный оптимум — 100 °С. В анаэробных условиях

серу могут восстанавливать архебактерии рода Sulfolobus, которые,

как указывалось выше, в аэробных условиях серу окисляют.

Значительное количество сероводорода образуется при мине-

рализации белковых соединений. Возбудителями данного процесса

служат бактерии родов Pseudomonas, Bacillus, Proteus, Clostridium и др.

Считают, что биогенная сера, которая поступает в атмосферу в виде

органических летучих соединений, представляет главным образом

продукт жизнедеятельности бактерий, минерализующих белковые

вещества.

240

Сульфатредуцирующие бактерии наносят определенный

ущерб, разрушая материалы, неустойчивые к сероводороду. Указан-

ные организмы разлагают нефтяные продукты, загрязняют серово-

дородом промышленный газ и т. д. Деятельность сульфатредуци-

рующих бактерий — одна из причин коррозии металлического обо-

рудования в анаэробной зоне. Считают, что ущерб от коррозии

трубопроводов под землей наполовину может быть отнесен на счет

этих микроорганизмов.

Сероводород токсичен, поэтому при накоплении его в почве

растительность быстро погибает. Если сероводород образуется в во-

доеме, то растения и животные в нем также гибнут. В некоторых

озерах, лиманах и даже в открытом море на определенной глубине

(в Черном море на глубине 200 м) сероводород накапливается в та-

ком количестве, что полностью подавляет развитие большинства

живых существ.

В то же время бактерии, восстанавливающие сульфаты, игра-

ют большую роль в геологических процессах. Они образуют H

участвующий в образовании серных руд. При окислении серово-

дорода серными бактериями появляются залежи серы промышлен-

ного значения. Сульфатредуцирующие бактерии участвуют и в обра-

зовании сульфидных руд.

12.2. Превращение соединений фосфора

Превращение органических соединений фосфора. По зна-

чению в питании растений фосфор занимает второе место после

азота. Он входит в состав почвы, растений и микроорганизмов в ви-

де органических и неорганических соединений.

В почву соединения фосфора поступают с растительными

и животными остатками, а также с минеральными удобрениями.

Фосфор в почве может быть в следующих формах:

• в составе первичных минералов — в форме фосфатов каль-

ция (апатиты, оксиапатиты, фторапатиты, фосфориты),

фосфатов или оксифосфатов железа (вивианит);

• в органической форме — от 25 до 85% общего фосфора

в разных почвах; органический фосфор составляет от 0,5

до 2% органического вещества почвы; фосфор входит в со-

став фитина и других инозитфосфатов, нуклеиновых кислот

и нуклеотидов, лецитина и гумусовых соединений.

Сельскохозяйственные растения содержат от 0,05 до 0,5%

фосфора. У растений, как и у животных, данный элемент находится

в форме органических соединений (фитин, фосфолипиды, нукле-

иновые кислоты и т. д.). Фосфор (неорганический ортофосфат) мо-

жет также присутствовать в клеточных вакуолях в качестве внутрен-

него буфера.

241

В противоположность азоту и сере, которые в растительных

тканях находятся в восстановленной форме (=NH

, =SH), фосфор

входит в органические соединения в окисленной форме — в виде

фосфата.

В обмен микроорганизмов вовлекаются такие фосфорорганические

соединения, как фитин, фосфолипиды, нуклеопротеиды.

Фитин — кальциймагниевая соль инозитфосфорной кислоты:

Фосфолипиды, или фосфатиды, или сложные жиры, представляют

собой эфиры глицерина и высокомолекулярных жирных кислот. Напри-

мер, один из спиртовых гидроксилов глицерина образует эфир с фосфор-

ной кислотой, которая, в свою очередь, связана с каким-либо другим со-

единением. Таким соединением может быть холин (тогда фосфолипид но-

сит название лецитин), или коламин (тогда фосфолипид именуют кефали-

ном):

Нуклеопротеиды состоят из белков и нуклеиновых кислот. В молеку-

лу последних входит ряд пуриновых и пиримидиновых оснований, пентоза

(сахар) и фосфат.

Большой резерв органического фосфора в почве не может быть ис-

пользован растениями без предварительного превращения его микроорга-

низмами в доступную неорганическую форму.

Органические источники фосфора усваиваются микроорганизмами с

различной скоростью. Легче всего дефосфорилируются нуклеиновые кисло-

ты, фитин разлагается медленно, лецитин по скорости разложения занимает

среднее положение. В качестве примера показано разложение фитина мик-

роорганизмами. Под влиянием фермента фитазы фосфат отщепляется от

242

инозитфосфорной кислоты или ее кальциймагниевой соли — фитина с об-

разованием инозита и фосфорной кислоты:

Органические соединения фосфора разлагаются бактериями

родов Pseudomonas, Bacillus (В. megaterium, В. mesentericus), грибами

родов Penicillium, Aspergillus, Rhizopus, Trichothecium, некоторыми ак-

тиномицетами и другими микроорганизмами. Разложение указан-

ных соединений осуществляют также дрожжи (Rhodotorula, Saccharo-

myces, Candida, Hansenula и др.).

Разложение органических веществ при участии микроорга-

низмов сопровождается фиксацией в клетках определенного коли-

чества фосфора в виде тех же органических веществ. Поэтому вне-

сение в почву органических соединений, слишком бедных фосфо-

ром, например соломы, может вызывать биологическое закрепление

фосфатов и связанное с ним фосфорное голодание растений.

Превращение неорганических соединений фосфора. Ряд не-

органических форм фосфора в почве представлен нерастворимыми

фосфатами кальция (апатиты, оксиапатиты, фосфориты), которые со-

держатся в основном в нейтральных и щелочных почвах (в кислых

преобладают соли железа и алюминия). Такие соединения фосфора

входят в состав минералов и недоступны или слабо доступны растени-

ям. Многие микроорганизмы могут переводить нерастворимые соеди-

нения фосфорной кислоты в растворимое состояние, среди них пред-

ставители бактерий, актиномицетов, грибов и других групп микроор-

ганизмов родов Pseudomonas, Bacillus, Micrococcus, Mycobacterium,

Penicillium, Aspergillus и т. д. Растворение фосфатов в почве происходит

в результате образования диоксида углерода или различных кислот.

Появляющийся в результате дыхания или других процессов

разрушения органического вещества диоксид углерода в присутст-

вии воды переходит в угольную кислоту, которая более или менее

быстро растворяет нерастворимый фосфат:

Са

(РО

)

+ 2СО

+ 2Н

О > 2СаНРО

+ Са(НСО

)

243