Емцев В.Т., Мишустин Е.Н. Микробиология: учебник для вузов

Подождите немного. Документ загружается.

ты до кетоглюконовых кислот. Перечисленные превращения осу-

ществляются по пентозофосфатному пути представителями рода

Gluconobacter. Особый интерес представляет окисление уксусно-

кислыми бактериями D-сорбита до L-сорбозы. Последняя требуется

в больших количествах для синтеза витамина С.

Интересно отметить, что представитель рода Acetobacter —

A. xylinum при росте на среде с глюкозой или другими источниками

углерода способен формировать внеклеточную слизистую пленку,

состоящую из чистой целлюлозы. Целлюлозные фибриллы пред-

ставляют собой рыхлую массу, окружающую клетки. В культуре этот

организм образует пленку толщиной 1 см и более, состоящую из

целлюлозы и бактериальных клеток.

Окисление углеводов до лимонной и других органических

кислот. Углеводы могут окисляться до лимонной кислоты и других

органических кислот. При рассмотрении процессов дыхания и бро-

жения было отмечено, что некоторые микроорганизмы не полно-

стью окисляют те или иные органические соединения. В этом слу-

чае происходит накопление продуктов неполного окисления — ок-

салата, цитрата, сукцината, фумарата, малата, аконитата, глюконата

и других кислот. Подобные процессы часто вызывают грибы. Так,

виды родов Rhizopus и Мисоr вызывают окисление углеводов глав-

ным образом до малата, в небольших количествах до сукцината, фу-

марата, малата, ацетата и муравьиной кислоты, а также этанола; ро-

дов Aspergillus и Penicillium — до глюконата, оксалата и цитрата.

Микробиологический синтез цитрата, глюконата, а-кетоглу-

тарата, сукцината, фумарата, малата и ряда других органических

кислот обычно осуществляется при интенсивной аэрации. Перечис-

ленные кислоты служат промежуточными продуктами метаболизма

соединений углерода, в том числе цикла трикарбоновых кислот.

Большое практическое значение имеет микробиологическое

получение цитрата из углеводов с использованием гриба Aspergillus

niger, превращающего почти 60% глюкозы в лимонную кислоту.

Возможность такого процесса была установлена С. П. Костычевым

и В. С. Буткевичем. Сейчас разработан и промышленный способ

микробиологического получения лимонной кислоты, необходимой

в медицине, фармацевтической, пищевой и химической промыш-

ленности, а также при дублении кож, в печатном деле и т. д.

В процессе окисления глюкозы наряду с цитратом всегда об-

разуется глюконат, причем выход последнего зависит от штамма

гриба и от рН среды. Попутно выделяются оксалат и сукцинат.

В России, США и Японии налажено производство итаконо-

вой кислоты на основе деятельности Aspergillus terreus. Итаконовая

кислота — продукт превращения углеводов при участии и другого

гриба рода Aspergillus — A. itaconicus. Итаконовую кислоту применя-

184

ют в производстве синтетических смол, синтетических волокон, ин-

сектицидов, красителей и других веществ.

В последнее время разработан способ получения цитрата из

углеводородов (н-парафинов) с помощью дрожжей рода Candida.

Указанные дрожжи используют также для получения изоцитрата,

а-кетоглутарата, фумарата, малата и сукцината.

9.6. Разложение целлюлозы и других органических

веществ микроорганизмами

В состав целлюлозы входит более 50% всего органического углерода

биосферы, это наиболее распространенный полисахарид раститель-

ного мира, высшие растения на 40—70% состоят из целлюлозы.

В связи с большим количеством синтезируемой в природе целлюло-

зы микроорганизмы, ее разлагающие, играют очень важную роль

в процессе минерализации органического вещества и круговороте

углерода.

Разнообразие микрофлоры, способной разлагать целлюлозу в

почве, позволяет трансформировать это вещество в различных усло-

виях аэрации, в кислой или щелочной среде при низких или высо-

ких влажности и температуре. Для большинства микроорганизмов,

разлагающих целлюлозу, характерна высокая специфичность по от-

ношению к этому веществу. Разложение целлюлозы осуществляют

аэробные микроорганизмы (бактерии и грибы) и анаэробные мезо-

фильные и термофильные бактерии.

Аэробное разложение целлюлозы. Группа аэробных целлю-

лозоразлагающих микроорганизмов наиболее богато представлена в

почве. В 1918 г. X. Б. Хутчинсон и Дж. Клейтон выделили из почвы

целлюлозоразлагающую бактерию, имеющую вид длинной верете-

нообразной палочки с острыми концами. Микроорганизму было да-

но название Spirochaeta cytophaga. Сейчас эту бактерию относят к се-

мейству Cytophagaceae, роду Cytophaga. Впоследствии были описаны

другие виды цитофаг. В настоящее время среди видов этого рода из-

вестны формы, разлагающие хитин (рис. 39).

Бактерии рода Cytophaga очень требовательны к условиям сре-

ды, обычно они в большом количестве встречаются в навозе и поч-

вах, удобренных навозом. То же свойственно и представителям рода

Sporocytophaga, разлагающим целлюлозу. Последние отличаются от

видов рода Cytophaga способностью образовывать микроцисты.

В расщеплении целлюлозы принимают участие миксобактерии

порядка Myxobacteriales, семейств Мухососсасеае (род Myxococcus),

Archangiaceae (род Archangium), Sorangiaceae (роды Sorangium и Poly-

angium), широко распространенные в почвах разных климатических

зон.

185

Рис. 39. Разложение фильтровальной бумаги в местах роста бактерий рода Cytophaga —

слева; целлюлозное волокно, покрытое бактериями, — справа (по: С. Н. Виноградский)

В почвах встречаются представители рода Cellulomonas. Это

аэробные грамположительные подвижные палочковидные бактерии

неправильной формы; с возрастом они иногда превращаются в кок-

ки. Бактерии данного рода участвуют в разложении целлюлозы в

аэробных условиях, однако способны и к анаэробному развитию.

Встречаются эти бактерии в почвах, богатых минеральными форма-

ми азота.

Могут усваивать целлюлозу единичные виды Pseudomonas

(P. fluorescens var. cellulosae) и некоторых других бактерий. Актино-

мицеты и грибы, обитающие в относительно бедных, кислых поч-

вах, в аэробных условиях медленно разрушают целлюлозу. К актино-

мицетам, разлагающим целлюлозу, относятся представители родов

Streptomyces {Streptomyces cellulosae), Streptosporangium, Micromonospora

(Micromonospora chalcea); к грибам — представители родов Fusarium,

Chaetomium, а также отдельные виды — Trichoderma viride, Aspergillus

fumigatus, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Myrothecium verrucaria.

В разрушении целлюлозы участвуют и хитридиомицеты, среди кото-

рых много паразитов.

Анаэробное разложение целлюлозы. Большинство предста-

вителей анаэробных целлюлозоразлагающих бактерий, найденных

в природе, относят к семейству Васillасеае, роду Clostridium. Эти ви-

ды обитают в почвах, компосте, навозе, речном иле и сточных во-

дах. Клостридии устойчивы к кислотности и распространены не

только в нейтральных, но и кислых почвах. Типичный представи-

тель рода, участвующий в разложении целлюлозы при температуре

186

30—40 °С, — Clostridium omelianskii. Впервые вид выделен известным

микробиологом В. Л. Омелянским в 1902 г. Этот микроорганизм

имеет палочковидную форму (4—8 х 0,3—0,5 мкм), подвижен. Для

него характерны толстые споры, поэтому спорообразующая клетка

сильно раздувается и становится похожей на барабанную палочку.

Разлагать целлюлозу может и другой мезофильный вид — С. cellobio-

pаrит.

Среди анаэробных целлюлозоразлагающих бактерий, встре-

чающихся в почве, навозе и компостах, есть и термофилы. Они ак-

тивно сбраживают целлюлозу. Так, оптимальная температура для

развития С. thermocellum около 60 °С, биологический максимум при-

ближается к 70 °С; при 40, 45 °С эта бактерия развивается слабо.

К термофильным целлюлозоразлагающим анаэробам относится и

вид Thermoanaerobacter ethanolicus, выделенный из горячих источни-

ков. Мезофильные и термофильные анаэробные бактерии хорошо

используют целлюлозу, но на обычных средах, содержащих простые

сахара, они развиваются слабо, плохо переносят даже незначитель-

но повышенные концентрации Сахаров.

В рубце жвачных животных обитают специфичные облигат-

ные анаэробные целлюлозоразлагающие бактерии. Они вызывают

разложение целлюлозы кормов до глюкозы, которая затем сбражи-

вается с образованием органических кислот (уксусной, пропионо-

вой, масляной, молочной, муравьиной, янтарной и др.), спиртов и

газов (СО

и Н

). Разложение целлюлозы в рубце животных

осуществляется при участии кокковидных и палочковидных бакте-

рий: Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus albus, Bacteroides succino-

genes, Butyrivibrio fibrisolvens, Ruminobacter parvum. Бактерии рубца

очень важны для нормального питания жвачных животных.

Кратко остановимся на биохимической стороне процесса рас-

пада целлюлозы. Это линейный гомополисахарид, состоящий из

соединенных β-l,4-гликoзидными связями глюкозных остатков.

Молекулярная масса полисахарида — до 500 000. В молекуле целлю-

лозы может содержаться до 14 000 молекул β-D-глюкозы. Целлюлоз-

ные волокна представляют собой пучки микрофибрилл и мицеллы

(кристаллиты) — весьма плотно упакованные цепочки макромоле-

кул, чередующиеся с некристаллическими или паракристаллически-

ми участками. Последние в первую очередь подвергаются воздейст-

вию ферментов микроорганизмов.

Разложение целлюлозы с помощью микроорганизмов прохо-

дит в несколько этапов. Сначала идет ферментный гидролиз поли-

мера. Ферментная система, осуществляющая разложение целлюлозы

до глюкозы, носит название целлюлазного комплекса. В его состав

входят: эндо- β-1,4-глюканаза (1,4- β-D-глюкан-4-глюкогидролаза),

экзо-1,4- β-глюканаза (целлобиогидролаза), экзо-1,4- β-глюкозидаза

(1,4-D-глюкан-глюкогидролаза), целлобиаза ( β-глюкозидаза).

187

Процесс расщепления целлюлозы протекает следующим обра-

зом: при действии на целлюлозу фермента эндоглюконазы образу-

ются олигосахара различной степени полимеризации, а также цел-

лобиоза. Затем под влиянием эндоглюканазы и целлобиогидролазы

олигосахара гидролизуются до целлобиозы. Целлобиаза катализи-

рует расщепление целлобиозы на две молекулы глюкозы. Все фер-

менты целлюлазного комплекса бактерий, за исключением целлоби-

азы, внеклеточные. При аэробном разложении целлюлозы из обра-

зовавшейся глюкозы в основном получается два продукта — СО

О. Могут накапливаться и небольшие количества органических

кислот.

В последние годы у ряда анаэробных целлюлозоразлагающих

бактерий были обнаружены на поверхности клеток высокомолеку-

лярные мультисубъединичные протуберантные структуры, ответст-

венные за разложение целлюлозы, получившие название целлюло-

сом. Это связанный с поверхностью клетки комплекс, содержащий

набор целлюлолитических ферментов, а также белки, не имеющие

ферментной активности. Входящие в комплекс ферменты представ-

лены эндоглюканазами, а также ферментами, играющими основную

роль в разложении целлюлозы. Комплекс обеспечивает прикрепле-

ние клеток к целлюлозе и ее высокоэффективный гидролиз.

При анаэробном распаде целлюлозы первоначальный продукт

ее гидролиза — глюкоза в дальнейшем подвергается сбраживанию, в

результате чего возникает много органических веществ, состав кото-

рых различается у отдельных культур микроорганизмов:

Мезофилы:

Clostridium omelianskii Этанол, уксусная, молочная

и муравьиная кислоты, СО

, Н

С. dissolvens Этанол, уксусная, молочная

и масляная кислоты, СО

, Н

С. cellobioparum Этанол, уксусная, муравьиная

и молочная кислоты, СО

, Н

Термофилы:

С. thermocellum Этанол, уксусная, молочная,

муравьиная кислоты, СО

, Н

Thermoanaerobacter ethanolicus Этанол

Раньше считали, что при брожении целлюлозы образуется ме-

тан СН

. Однако позднее было показано, что метан выделяется не

в результате деятельности бактерий, использующих полисахариды,

а вследствие жизнедеятельности вторичного бактериального насе-

ления — микробного сообщества, утилизирующего продукты разло-

жения целлюлозы. В конце этой пищевой цепи находятся метаноге-

ны (архебактерии), продуктом жизнедеятельности которых является

метан.

188

Имеющиеся в растениях моно- и дисахариды, а также низко-

молекулярные полисахариды (крахмал, инулин, камеди и т. п.) лег-

ко разрушаются различными микроорганизмами.

Разложение гемицеллюлозы. Гемицеллюлозы наряду с лиг-

нином и пектинами входят в состав межклеточного вещества расти-

тельных тканей, в значительных количествах содержатся в древеси-

не, соломе, кукурузных початках и т. д. Как и целлюлоза, они при-

сутствуют в клеточной стенке. Кроме растений, гемицеллюлозы

обнаружены у грибов и дрожжей, входят в состав внеклеточных по-

лисахаридов.

Гемицеллюлозы — гетерополисахариды, состоящие из пентоз

(ксилозы, арабинозы) или гексоз (глюкозы, маннозы, галактозы),

что отражено в их названиях: пентозаны (ксилан или арабан), ман-

наны, галактаны и т. д. Ксилан — полимер ксилозы — по содержа-

нию в растениях занимает второе место после целлюлозы. Солома и

луб содержат до 30% ксилана, древесина хвойных — 7—12, листвен-

ных пород — 20—25%. Молекулы ксилана состоят из остатков β-D-

ксилозы, соединенных 1,4-гликозидными связями. Многие геми-

целлюлозы содержат также уроновые кислоты.

Перечисленные вещества активно разлагаются грибами,

аэробными и анаэробными бактериями. В этих процессах участвует

значительно больше видов микроорганизмов, чем в разложении

целлюлозы. Многие из них не очень специфичны и кроме полиса-

харидов способны усваивать органические кислоты и многие прос-

тые сахара.

Микробное население, участвующее в разложении гемицел-

люлоз растений, очень разнообразно. Это связано с неодинаковым

химическим составом указанных полисахаридов у разных растений,

что оказывает влияние и на характер конечных продуктов распада.

К микроорганизмам, обладающим гемицеллюлозоразлагающими

свойствами, относят бактерии родов Clostridium, Bacillus, Cytophaga,

Sporocytophaga (например, Sporocytophaga myxococcoides), Vibrio, Strep-

tomyces; грибы родов Aspergillus, Rhizopus, Forties, Polyporus и др. Геми-

целлюлозы в кислых почвах обычно разлагают грибы, в нейтральных

и щелочных — бациллы, Sporocytophaga и ряд других бактерий.

Большая молекулярная масса гемицеллюлоз не позволяет их мо-

лекулам проникать через цитоплазматическую мембрану бактериаль-

ной клетки. Молекулы должны быть превращены в простые соедине-

ния сахара, и только тогда микроорганизмы смогут их использовать.

Ферменты, катализующие расщепление гемицеллюлоз, носят

название гемицеллюлаз (ксиланаз). Многие микроорганизмы, обла-

дающие способностью к синтезу целлюлазного комплекса, имеют

и ксиланазу.

Первое время, после того как растительные остатки попадают

в почву, гемицеллюлозная фракция полисахаридов разлагается со

значительной скоростью, затем процесс замедляется. Это, вероятно,

189

результат химической гетерогенности гемицеллюлозных фракций:

одни разлагаются медленнее, другие — быстрее. Скорость превра-

щения гемицеллюлоз микроорганизмами почвы зависит и от усло-

вий среды — температуры, влажности, рН среды и т. д.

Разложение лигнина. Растения, особенно древесные, содер-

жат большое количество лигнина во вторичных слоях клеточной

оболочки и как основной компонент в составе межклеточного ве-

щества и вторичных слоях клеточной стенки. В молодых растениях

количество лигнина относительно невелико, но с возрастом его со-

держание в тканях увеличивается. Молодые травы содержат от 3 до

6% лигнина (на сухое вещество), древесина разных деревьев — от 18

до 30%. Вероятно, это соединение никогда не встречается в свобод-

ном виде, обычно оно связано с полисахаридами.

Лигнин, содержащийся в растениях разных видов, родов и се-

мейств растительного царства, химически неоднороден. Даже в од-

ном растении в зависимости от фазы развития химический состав

лигнина может меняться.

Молекулярная масса лигнина 1000—10 000, он нерастворим в

воде и в большинстве органических растворителей. Молекула лиг-

нина содержит только три элемента — углерод, водород и кислород,

однако это весьма сложное соединение, состоящее из большого

числа полимеризованных мономерных блоков, которые представля-

ют собой производные фенилпропана. Главный мономер лигнина —

конифериловый спирт, он составляет скелет лигнина хвойных по-

род. Лигнин лиственных пород состоит из кониферилового и сина-

пового спиртов, лигнин злаковых растений имеет еще и кумаровый

спирт.

Лигнин устойчив к воздействию микроорганизмов, разлагается

значительно медленнее, чем целлюлоза и гемицеллюлоза. В аэроб-

ном разложении лигнина могут принимать участие многие предста-

вители класса Basidiomycetes. Так, при умеренной температуре лиг-

нин усваивают многие высшие грибы родов Clavaria, Armillariella,

Fomes, Polystictus, Polyporus и Ustilina. Активны по отношению к лиг-

нину Fusarium lactis, F. nivala, Trichoderma lignorum, Alternaria tenuis,

Stremphylium botryosum.

В почве есть аэробные бактерии рода Pseudomonas, участвую-

щие в термофильном разложении лигнина. Бактерии рода Clostridi-

um разлагают это соединение в анаэробных условиях. Считают, что

лигнин может трансформироваться и актиномицетами.

Лигнин деполимеризуется до простых ароматических веществ,

таких, как ванилин и другие метоксилированные ароматические

структуры. Ферментная система микроорганизмов, воздействую-

щих на лигнин, внеклеточная и представлена лигниназами — спе-

цифичными пероксидазами. В связи с тем что лигнин разрушается

190

относительно медленно, он накапливается в почве, и продукты раз-

ложения служат основой при образовании гумусовых веществ.

Разложение пектиновых веществ. Межклеточные вещества

растительных тканей — пектины — найдены в так называемых сре-

динных пластинках, расположенных между отдельными клетками

тканей растений. Первичные и вторичные клеточные стенки также

содержат полисахариды пектинового типа. Пектиновые вещества —

сложные полисахариды, полигалактурониды, это неразветвленные

полимеры, состоящие из остатков D-галактуроновых кислот, соеди-

ненных 1,4-гликозидными связями.

Существуют три типа пектиновых веществ: протопектин —

водонерастворимая составная часть клеточной стенки; пектин — во-

дорастворимый полимер галактуроновой кислоты, содержащей метил-

эфирные связи; пектиновая кислота — водорастворимый полимер

галактуроновой кислоты, свободный от метилэфирных связей. Пек-

тиновая кислота образована длинными цепочками галактуроновых

кислот, способных после обработки кальциевыми солями к форми-

рованию твердого пектинового геля.

Бактерии и грибы воздействуют на пектин, протопектин и пек-

тиновую кислоту в аэробных и анаэробных условиях. В почве обна-

ружено большое число микроорганизмов, разлагающих пектиновые

вещества (до 1 млн клеток на 1 г почвы). Высокой пектинолитиче-

ской активностью обладают представители семейства Ваcillасеае —

аэробные бактерии рода Bacillus (В. macerans, В. polymyxa) и ана-

эробные рода Clostridium (С. pectinovorum, С. felsineum, С. aurantibu-

tyricum, С. pectinolyticum, С. соralliпит, С. flavum и др.), а также мно-

гие грибы. Пектины разлагаются и под влиянием фитопатогенных

грибов (Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum f. lycopersici) и бактерий

Erwinia carotovora), использующих эту свою способность для про-

никновения в ткани растений.

Микроорганизмы синтезируют следующие экзоферменты (эс-

теразы и деполимеразы), катализующие распад пектиновых веществ:

• протопектиназу, участвующую в разложении протопектина

с образованием растворимого пектина;

• пектинэстеразу, гидролизующую метилэфирную связь пек-

тина с образованием пектиновой кислоты и метилового

спирта;

• пектиназу (полигалактуроназу), разрушающую связи между

отдельными составляющими галактуроновой кислоты, пек-

тина или пектиновой кислоты с образованием небольших

цепочек и в конечном счете свободной D-галактуроновой

кислоты.

При гидролизе пектиновой кислоты пектиназой на первых

этапах аккумулируются только небольшие количества свободной

D-галактуроновой кислоты. Обычно при участии ферментов разла-

191

гаются ди-, три-, тетра- и пентагалактуроновые кислоты. В после-

дующих этапах гидролиза длинные молекулы распадаются под влия-

нием каталитической деятельности пектиназы и накапливаются

свободная D-галактуроновая кислота и другие соединения.

Распад пектиновой кислоты может быть выражен следующей

схемой:

Продукты распада пектиновой кислоты (галактоза, арабиноза

и др.) подвергаются окислению или сбраживанию при воздействии

разнообразных микроорганизмов. При анаэробиозе это маслянокис-

лые бактерии, относящиеся к роду Clostridium (С. pectinovorum,

С. felsineum и др., рис. 40). Продуктами распада С. pectinovorum слу-

жат масляная и уксусная кислоты, а также газы Н

и СО

, а в куль-

туре С. felsineum кроме указанных веществ образуется и небольшое

количество ацетона и бутанола.

Разложение пектиновых веществ наблюдается при мочке лу-

боволокнистых растений — льна, конопли, кенафа, джута, канатни-

ка и др. Целлюлозные волокна указанных растений склеены с окру-

жающими их тканями пектином. Для отделения волокон необходи-

мо разложение пектина, для чего используют пектинолитическое

действие ферментов анаэробных бактерий.

При водной мочке после погружения в воду стебли льна набу-

хают. При этом экстрагируются водорастворимые вещества (сахара,

глюкозиды, таннины, растворимые соединения азота и пигменты) и

начинают развиваться бактерии. Сначала размножаются аэробные

формы, так как вода содержит кислород и питательные вещества,

способствующие их развитию. Дрожжи и плесневые грибы развива-

ются на поверхности среды. По-

глощение аэробными микроорга-

низмами из жидкости кислорода

обусловливает создание в среде

анаэробных условий. Начинают раз-

виваться факультативно анаэроб-

ные бесспоровые бактерии, близ-

кие к Escherichia coli. Постепенно

в среде накапливаются органиче-

ские кислоты (в том числе молоч-

ная) и выделяются газы СО

и Н

Отделение волокон происхо-

дит во время основной стадии бро-

жения, когда анаэробные бактерии

192

тиna С. pectinovorum начинают расщеплять пектин. Накопление ор-

ганических кислот приводит к прекращению деятельности С. pecti-

novorum. Последнего сменяет более кислотоустойчивый микроорга-

низм С. felsineum. В результате воздействия ферментов микроорга-

низмов двух указанных видов на пектиновые вещества паренхимной

ткани от коры и древесины отделяются пучки волокон.

На льнозаводах тепловую мочку льноволокна выполняют в

особых чанах — мочилах при 32—38 °С в течение трех—пяти суток.

Для ускорения мочки и увеличения выхода длинного волокна пред-

ложен препарат пектолитин, содержащий споры активного пектин-

разлагающего микроорганизма — С. felsineum. Внесение пектолити-

на в мочильную жидкость приводит к ускорению процесса в сред-

нем на 27%, повышается и выход длинного волокна, его качество.

В производство льняного волокна внедряют также препараты пекто-

литических ферментов.

Применяют и аэробную мочку льна и других лубоволокнис-

тых культур. В этом случае пектиновые вещества разрушаются

аэробными микроорганизмами. Предварительно пектиновые веще-

ства гидролизуются до галактуроновых кислот, галактозы, арабино-

чы, ксилозы, уксусной кислоты и метанола, а затем начинается

окисление (бактериями, дрожжами, грибами) возникших соедине-

ний до СО

и Н

О.

Существует несколько способов аэробной мочки льна. Рас-

стил, или росяная мочка, — самый старый и наиболее примитивный

биологический способ получения волокна. При этом лен в осеннее

время года расстилают на траве. Широкий доступ воздуха, система-

тичное и порой длительное отсутствие влаги, воздействие света и

атмосферных осадков, суточные колебания температуры обусловли-

вают длительность процесса (три—восемь недель) и преобладание в

нем не бактерий, а плесневых грибов. Насчитывают до 80 видов

грибов, участвующих в росяной мочке. Первое время после рассти-

ла стеблей на траве наблюдается развитие бактерий, а затем преоб-

ладают грибы — Rhizopus, Aureobasidium, Alternaria и Gonatobotrys.

Развитие перечисленных представителей грибов указывает на опти-

мальную степень мочки льносоломы. Видовой состав микрофлоры

при мочке определяется географическими и почвенно-климатиче-

скими условиями. При мочке расстилом существует опасность, что

многие грибы (например, Cladosporium herbarum, Trichoderma lig-

norum), появляющиеся на льносоломе после Rhizopus, Alternaria и

других, разрушат целлюлозу, т. е. волокно. Особенно часто это про-

исходит при перележивании разостланной соломы.

В благоприятных атмосферных условиях (теплая и влажная

погода), сочетающихся с тщательным уходом за соломой (защита от

спутывания, переворачивание рядков, своевременная уборка со

стлища), расстил дает вполне удовлетворительное по качеству и вы-

ходу волокно.

7 Микробиология 193

Контрольные вопросы и задания

1. Какие микроорганизмы служат возбудителями молочнокислого брожения?

2. В чем сущность пропионовокислого брожения? 3. Чем отличается окисле-

ние углеводов при участии микроорганизмов от различного типа брожений?

Глава 10 Превращение микроорганизмами

соединений азота

От азотного питания растений во многом зависит величина

урожая сельскохозяйственных культур. Большинству растений не-

доступен газообразный азот, в огромном количестве находящийся

в воздухе, а из разнообразных азотных соединений, встречающихся

в почве, они могут усваивать только минеральные. Поэтому столь

важен вопрос о превращениях соединений азота в почве под воздей-

ствием микроорганизмов.

Превращения азота и содержащих этот элемент соединений в

почве довольно сложны, но в них можно выделить основные на-

правления, определяющие круговорот азота в природе:

194

Некоторую часть атмосферного азота связывают свободножи-

вущие или находящиеся в симбиозе с растениями микроорганизмы.

Данный процесс обогащает азотом и почву, и растения. Органиче-

ские азотсодержащие соединения в тканях растений и животных,

попадая в почву, подвергаются минерализации до аммонийных со-

единений. Часть растительных остатков трансформируется в темно-

окрашенное, содержащее азот вещество, — гумус.

Аммонийная форма азота подвергается в почве окислению

нитрифицирующими бактериями с образованием солей азотной

кислоты. При определенных условиях нитраты могут восстанавли-

ваться до молекулярного азота и улетучиваются из почвы. Значи-

тельное количество азотсодержащих соединений микроорганизмы

ассимилируют, а азот в органических формах практически недосту-

пен растениям.

Приведенные примеры показывают, что микроорганизмы

способны вызывать как мобилизационные процессы и накапливать

доступные для растений минеральные азотсодержащие вещества,

гак и диаметрально противоположные им — иммобилизационные,

обедняющие почву ценными для растений соединениями.

10.1. Минерализация азота

Среди органических соединений, составляющих клетку, первое мес-

то по количеству занимают белки — на их долю приходится не ме-

нее 50% сухой массы клетки. Значительная часть белков попадает

в почву с остатками отмерших растений, животных и микроорга-

низмов. При разложении белков и других азотсодержащих соедине-

ний в почве при участии микроорганизмов азот освобождается в ви-

де аммиака. Указанный процесс называют аммонификацией, или ми-

нерализацией азота.

Белки подвергаются разложению как аэробными, так и анаэ-

робными бактериями, а также актиномицетами и грибами. Осо-

бенно активны представители семейства Pseudomonadaceae, рода

Pseudomonas (P. fluorescens, P. aeruginosa), семейства ВасШасеае, рода

Bacillus (В. mycoides, В. cereus, В. subtilis) и рода Clostridium (С. spo-

rogenes, С. putrificus) (рис. 41), семейства Enterobacteriaceae, рода Pro-

teus (P. vulgaris) и др.

В состав белков обычно входит 20 ос-аминокислот. Аминокис-

юты в полимерной цепи белка располагаются так, что конец одной

аминокислоты связан с началом другой пептидной связью. Такие

полимерные молекулы, называемые полипептидными цепями, со-

держат до сотен аминокислотных звеньев. Белковая молекула вклю-

чает одну или несколько полипептидных цепей. По составу белки

подразделяют на простые и сложные. При гидролизе простых бел-

195

Рис. 41. Аммонифицирующие бактерии:

А — Bacillus sp.; Б — Bacillus cereus; В — Clostridium sp. (по: С. Робиноу)

ков образуются только аминокислоты, сложных — как аминокисло-

ты, так и другие органические и неорганические продукты. Небел-

ковая (не содержащая аминокислот) часть молекулы сложного белка —

это его простетическая группа. В зависимости от ее состава слож-

ные белки называют нуклеопротеидами, липопротеидами, металло-

протеидами и гликопротеидами.

Молекулы белков и большинства пептидов велики и не могут

проходить через цитоплазматическую мембрану микроорганизмов.

Поэтому они расщепляются экзоферментами. Протеолитические

ферменты, или протеазы, выделяемые клетками микроорганизмов в

окружающую среду, осуществляют гидролиз ряда пептидных связей

в молекулах белков. Образующиеся при этом частицы белковой мо-

лекулы (полипептиды и олигопептиды) поступают внутрь клеток

микроорганизмов, где разрушаются внутриклеточными протеолити-

196

ческими ферментами — пептидазами до свободных аминокислот.

Последние используются для синтеза белков клетки или подверга-

ются дальнейшему расщеплению.

Внутриклеточное или внеклеточное расщепление аминокис-

лот может идти следующими четырьмя путями:

Аминокислоты минерализуются с различной скоростью. Не-

которые из них (треонин, метионин) более устойчивы, другие (ар-

гинин, триптофан), наоборот, разлагаются легко. После дезами-

нирования углеродный остаток подвергается воздействию микробов

к аэробных или анаэробных условиях до образования СО, и различ-

ных органических соединений. Если в среде есть амиды, то перво-

начально они разлагаются до аминокислот и только затем уже могут

быть трансформированы тем или иным путем. Например, аспарагин

под действием фермента аспарагиназы превращается в аспарагино-

вую кислоту:

При аэробном распаде белка основными конечными продук-

тами процесса бывают СО

, аммиак, сульфаты и вода. В анаэробных

условиях при распаде белка образуются аммиак, амины, СО

, орга-

нические кислоты (жирные и ароматические — бензойная, ферули-

новая и др.), меркаптаны, а также вещества с неприятным запахом —

индол, скатол и сероводород.

При анаэробном разрушении белков могут образовываться

токсичные соединения, в частности первичные амины (диамины)

или птомаины. К числу последних относят кадаверин, который по-

лучается из лизина:

Накапливающиеся в анаэробных условиях в почве продукты

разложения белков фитотоксичны, поэтому они нередко угнетающе

действуют на растения и снижают урожайность.

При разрушении сложных белков сначала освобождаются ос-

новные составляющие — белок и связанная с ним простатическая

197

группа. В дальнейшем эти соединения (каждое самостоятельно) под-

вергаются более глубокой трансформации.

Разложение нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты вхо-

дят в состав нуклеопротеидов. Последних особенно много в клеточ-

ных ядрах. Нуклеиновые кислоты — РНК и ДНК — органические

вещества большой молекулярной массы, представляющие собой по-

лимеры. При их гидролизе освобождаются пуриновые и пиримиди-

новые соединения, сахар и фосфорная кислота. Сахар в РНК пред-

ставлен рибозой, в ДНК — дезоксирибозой. Пурины — аденин и гу-

анин найдены как в молекулах РНК, так и в молекулах ДНК. Из

пиримидинов — цитозин обнаружен в РНК и ДНК, урацил только в

РНК, а тимин — только в ДНК.

Длинные молекулы нуклеиновых кислот при разложении де-

полимеризуются. Сначала отщепляются небольшие фрагменты, ко-

торые затем распадаются на отдельные мононуклеотиды. Процесс

расщепления идет при участии ферментов рибонуклеазы и дезокси-

рибонуклеазы, синтезируемых некоторыми видами грибов, актино-

мицетами и рядом бактерий. На следующем этапе от мононуклеоти-

дов под воздействием нуклеотидаз отщепляется фосфорная кислота,

затем — сахар, пуриновые и пиримидиновые основания.

В зависимости от типа обмена веществ микроорганизмов сахар

в дальнейшем может окисляться кислородом до СО

и Н

О или под-

вергаться брожению с образованием органических кислот и спир-

тов. Азотсодержащие основания разлагаются до мочевины и амино-

кислот и в конце концов до аммиака и органических кислот.

Разложение мочевины. К азотсодержащим органическим со-

единениям, часто встречающимся в природе, относятся мочевина,

мочевая и гиппуровая кислоты. Мочевина присутствует в моче че-

ловека и животных, ее могут синтезировать почвенные грибы. Так,

до 13% сухой массы плодовых тел шампиньонов составляет мочеви-

на. Это же соединение образуется при гидролитическом распаде ар-

гинина под действием фермента аргиназы:

На земном шаре за год организмы синтезируют до 30 млн т

мочевины, что составляет существенные ресурсы азота: мочевина

содержит 46% этого элемента и используется как удобрение. Под

действием микроорганизмов, содержащих фермент уреазу, мочевина •

в несколько этапов превращается в аммиак и диоксид углерода:

CO(NH

)

+ 2Н

О -----> (NH

)

Мочевина

198

Образующаяся на первом этапе углеаммиачная соль малоус-

ойчива и быстро разлагается:

(NH

)

= 2NH

+ СО

+ Н

Многие бактерии и грибы, синтезирующие уреазу, могут ис-

пользовать мочевину как источник азота для синтеза белков. Обычно

бактерии, разлагающие мочевину, называют уробактериями. Эти орга-

низмы могут развиваться при высокой щелочности среды (рН 9—10),

что позволяет им вызывать распад значительного количества моче-

вины до аммиака. Из специфических уробактерий наиболее важны:

Micrococcus urea из семейства Micrococcaceae, Bacillus pasteurii из се-

мейства Bacillaceae, а также Sporosarcina urea.

Физиологический смысл распада мочевины, по-видимому,

сводится к переводу аминной формы азота в более легкоусвояемую

аммиачную.

Разложение мочевой и гиппуровой кислот. Мочевая и гиппу-

ровая кислоты также играют важную роль в белковом обмене мле-

копитающих, пресмыкающихся, насекомых и птиц. В экскрементах

змей содержится до 90% мочевой кислоты, а в помете птиц — 25%.

В моче млекопитающих содержание мочевой кислоты незначитель-

но. Мочевая и гиппуровая кислоты быстро распадаются под влия-

нием гидролитических ферментов ряда микроорганизмов:

Разложение мочевой кислоты в местах скопления помета

птиц (гуано) в условиях засушливого климата приводит к накоп-

лению нитратов. Образующийся в таких местах в массе аммиак под-

вергается окислению нитрифицирующими бактериями. В связи

с низкой влажностью нитраты из гуано не вымываются, а накапли-

ваются. Все это обусловило возникновение богатых залежей нитра-

тов в Чили, Перу, Южной Африке и на островах Карибского моря.

Гуано содержит 9% азота, 13% фосфорной кислоты, калий, каль-

ций, различные микроэлементы, поэтому используется как удобре-

ние в сельском хозяйстве.

Разложение цианамида кальция. Цианамид кальция (CaCN

)

используют как азотное удобрение, которое растения самостоя-

тельно не ассимилируют, но в почве оно быстро превращается в ам-

миак. Разложение цианамида кальция проходит в три этапа. Первый

ротекает самопроизвольно под влиянием почвенной влаги до обра-

ования цианамида. Ряд почвенных катионов (Са, Mn, Fe и т. д.)

199

вызывает превращение цианамида в мочевину. Далее гидролиз мо-

чевины происходит под влиянием уробактерий:

CaCN

+ 2Н

О > H

+ Са(ОН)

+ Н

О > CO(NH

)

CO(NH

)

+ Н

О > 2NH

+ СО

Разложение хитина. Разложение хитина осуществляют мно-

гие почвенные микроорганизмы, он постоянно присутствует в поч-

ве. Это азотсодержащий полисахарид, полимер ацетилглюкозамина.

Хитин содержится в наружном скелете беспозвоночных животных,

в панцирных покровах насекомых, в клеточной стенке многих гри-

бов, в частности базидиомицетов и аскомицетов.

Способностью разлагать хитин обладают около 50 видов бак-

терий родов Pseudomonas, Flavobacterium, Bacillus, Cytophaga, Strepto-

myces, Nocardia и Micromonospora. Из грибов активно воздействуют

на это вещество мукоровые грибы и аспергиллы (Aspergillus fumiga-

tus), а также Mortierella. Особенно легко разлагается хитин актино-

мицетами. Известны и миксобактерии, усваивающие хитин, напри-

мер скользящая бактерия Chitinophaga pinensis.

Под действием синтезируемого микроорганизмами фермента

хитиназы хитин вначале разлагается на хитобиозу и хитотриозу, по-

путно образуется небольшое количество N-ацетилглюкозамина.

Затем хитобиоза и хитотриоза расщепляются в присутствии хитоби-

азы до уксусной кислоты, глюкозы и аммиака.

10.2. Нитрификация

Аммиак, образующийся в почве, навозе и воде при разложении ор-

ганических веществ, довольно быстро окисляется до азотистой, а за-

тем азотной кислоты. Такой процесс называют нитрификацией.

До середины XIX в., точнее, до работ Л. Пастера явление об-

разования нитратов объясняли как химическую реакцию окисления

аммиака атмосферным кислородом, причем предполагалось, что поч-

ва в этом процессе играет роль катализатора. Л. Пастер предположил,

что образование нитратов — микробиологический процесс. Первые

экспериментальные доказательства его гипотезы были получены

Т. Шлезингом и А. Мюнцем в 1879 г. Исследователи пропускали

сточные воды через длинную колонку с песком и СаСО

. При фильт-

рации аммиак постепенно исчезал и появлялись нитраты. Нагревание

колонки или внесение антисептиков прекращало окисление аммиака.

Однако выделить культуры возбудителей нитрификации не

удалось ни упомянутым исследователям, ни микробиологам, продол-

жавшим изучение нитрификации. Лишь в 1890—1892 гг. С. Н. Вино-

градский, применив особую методику, изолировал чистые культуры

нитрификаторов. Ученый предположил, что нитрифицирующие бак-

200

терии не растут на обычных питательных средах, содержащих орга-

нические вещества, это объяснило неудачи его предшественников.

Действительно, нитрификаторы оказались хемолитоавтотро-

фами, т. е. бактериями, использующими энергию окисления амми-

ака или азотистой кислоты для синтеза органических веществ из

СО

(хемосинтез). Поэтому их клетки очень чувствительны к при-

сутствию в среде органических соединений. Нитрифицирующие

бактерии удалось выделить на минеральных питательных средах.

С. Н. Виноградский установил, что существуют две группы ни-

трификаторов: одна осуществляет окисление аммиака до азотистой

кислоты (NH

> NO

) — первая фаза нитрификации, дру-

гая — окисление азотистой кислоты до азотной (NO

> NO

) —

вторая фаза нитрификации.

Представителей обеих групп относят к семейству Nitrobacte-

riaceae. Это одноклеточные грамотрицательные бактерии. Среди ни-

трифицирующих бактерий есть палочковидные клетки, эллиптиче-

ские, сферические, извитые и дольчатые, плеоморфные. Размеры

клеток колеблются от 0,3 до 1 мкм в ширину и от 1 до 3 мкм в дли-

ну. Существуют подвижные и неподвижные формы с полярным,

субполярным и перитрихальным жгутикованием.

Размножаются бактерии-нитрификаторы в основном делением,

зa исключением Nitrobacter, для которого характерно почкование. По-

чти у всех нитрификаторов хорошо развита система внутрицитоплаз-

матических мембран, значительно различающихся по форме и распо-

ложению в клетках отдельных видов. Мембраны цитоплазмы подоб-

ны мембранам фотосинтезирующих пурпурных бактерий.

Бактерии первой фазы нитрификации представлены ро-

дами: Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus и Nitroso-

vibrio. Наиболее детально к настоящему времени изучен Nitrosomonas

europaea (рис. 42, А). Он представляет собой короткие овальные па-

лочки размером 0,8—1 х 1—2 мкм. В жидкой культуре клетки Ni-

trosomonas проходят ряд стадий развития. Две основные из них пред-

ставлены подвижной формой и неподвижными зооглеями. Подвиж-

ная форма обладает субполярным жгутиком или пучком жгутиков.

Описаны представители и других родов бактерий, вызываю-

щих первую фазу нитрификации.

Вторую фазу нитрификации осуществляют представители

родов Nitrobacter, Nitrospira и Nitrococcus. Наибольшее число ис-

следований проведено с Nitrobacter winogradskyi (рис. 42, Б), однако

описаны и другие виды (например, Nitrobacter agilis). Клетки нитро-

бактepa имеют удлиненную, клиновидную или грушевидную фор-

му, более узкий конец часто загнут в клювик, размеры клеток —

0,6—0,8 х 1—2 мкм. При почковании дочерняя клетка обычно под-

вижна, так как имеет один полярный жгутик. Известно чередование

в цикле развития подвижной и неподвижной стадий.

201

Рис. 42. Нитрифицирующие бактерии:

А — Nitrosomonas europaea; Б — Nitrobacter winogradskyi

Описаны и другие виды бактерий, вызывающие вторую фазу

нитрификации.

Нитрифицирующие бактерии культивируют на простых мине-

ральных средах, содержащих аммиак или нитриты (окисляемые суб-

страты) и диоксид углерода (основной источник углерода). Источником

азота для этих организмов служат аммиак, гидроксиламин и нитриты.

Нитрифицирующие бактерии развиваются при рН 6,0—

8,6, оптимум реакции среды составляет рН 7,5—8,0. При значениях

ниже рН 6 и выше рН 9,2 бактерии не развиваются. Оптимальная

температура для развития нитрификаторов 25—30 °С. Изучение от-

ношения различных штаммов Nitrosomonas europaea к температуре

показало, что некоторые из них имеют оптимум развития при 26 °С

или около 40 °С, другие способны довольно быстро расти при 4 °С.

Нитрификаторы — облигатные аэробы

. Используя кислород

воздуха, они окисляют аммиак до азотистой кислоты (первая фаза

нитрификации):

+ 3/

> NO

+ Н

О + 2H

В последние годы обнаружена способность бактерий к анаэробному

окислению аммиака. Этот процесс, получивший название «анаммокс» (Ап-

аттох), играет важную роль при очистке сточных иод. Осуществляющие его

бактерии относятся к группе планктомицетов. (Прим. ред.)

202

а затем азотистую кислоту до азотной (вторая фаза нитрификации):

+ 1/

> NO

Следовательно, аммиак — продукт жизнедеятельности ам-

монифицирующих бактерий — использует для получения энергии

Nitrosomonas, а нитриты, образующиеся в процессе жизнедеятель-

ности последних, служат источником энергии для Nitrobacter.

Согласно современным представлениям, процесс нитрифи-

кации осуществляется на цитоплазматической и внутрицитоплазма-

тических мембранах и проходит в несколько этапов. Первым про-

дуктом окисления аммиака становится гидроксиламин, затем пре-

вращающийся в нитроксил (NOH) или пероксонитрит (ONOOH),

последний, в свою очередь, преобразуется в дальнейшем в нитрит,

а нитрит в нитрат. Весь процесс нитрификации иллюстрирует сле-

дующая схема:

Нитроксил, как и гидроксиламин, по-видимому, может диме-

ризоваться в гипонитрит или превращаться в закись азота N

O —

побочный продукт нитрификации. Кроме первой реакции (образо-

вания гидроксиламина из аммония), все последующие превращения

сопровождаются синтезом макроэргических связей в виде АТФ.

Нитрификаторы осуществляют фиксацию СО

через восста-

новительный пентозофосфатный цикл (цикл Кальвина). В результа-

те последующих реакций образуются не только углеводы, но и дру-

гие важные для бактерий соединения — белки, нуклеиновые кисло-

ты, жиры и т. д.

Долгое время нитрифицирующих бактерий относили к облигат-

ным хемолитоавтотрофам. Позднее были получены данные о спо-

собности этих бактерий использовать некоторые органические ве-

щества. Так, отмечено стимулирующее действие на рост Nitrobacter

нитрита, дрожжевого автолизата, пиридоксина, глутаминовой кис-

лоты и серина. Предполагают, что некоторые нитрифицирующие

бактерии обладают способностью переключаться с автотрофного на

гетеротрофное питание. Однако нитрификаторы не растут на обыч-

ных питательных средах, так как большое количество легкоусвояе-

мых органических веществ, содержащихся в таких средах, задержи-

вает их развитие. Однако в природе такие бактерии хорошо развива-

ются в черноземах, навозе, компостах, т. е. в местах, где содержится

много органического вещества.

203