Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

(от англ. cap — шапка, кепка). КЭП повышает устойчивость

про-мРНК и мРНК к действию ряда рибонуклеаз и других гидро-

лизующих агентов. Пример КЭПа: 7

G5' ppp5' Nr^p ...(7'-метил-

гуанозил-5'-трифосфорил-5'-нуклеозил-метилрибозил-фосфорил

-нуклеотид...); локализация КЭПа и предшествующие ему нуклео-

тидные последовательности в ре-

комбинантной плазмиде рТК1

показаны на рис. 62. З'-Конец

мРНК, как правило, полиадени-

лирован.

РНК-полимераза III катали-

зирует синтез 5S РНК, всех

тРНК, ряда малых РНК, а также

ча,сть гяРНК.

Скорость синтеза белков у

различных представителей над-

царств прокариот и эукариот

варьирует в широких пределах.

Это зависит от многих внутрен-

них и внешних факторов. Тем не

менее, у бактерий при 37°С за 1

секунду может включаться в рас-

тущую полипептидную цепь от

10 до 20 аминокислот. Подсчита-

но,

например, что белковая мо-

лекула, включающая 300 амино-

кислот, синтезируется бактериальной клеткой за 20 секунд.

Скорость синтеза белков в эукариотических клетках заметно

ниже (в среднем, за 1 секунду присоединяется 1—2 аминокислоты

к растущей цепи полипептида). Здесь следует иметь в виду и тот

факт, что для синтеза белка с прерывистого гена, включающего

экзоны и интроны, требуется дополнительное время. Ген вначале

транскрибируется целиком (со всеми экзонами и интронами) в

пре-мРНК, которая затем в ходе сплайсинга освобождается от

интронов и превращается в мРНК (см. рис. 53), в которой экзоны

соединены последовательно конец в конец. Только после этого

образованная мРНК включается в процесс синтеза белка. Следует

иметь в виду, что, например, у человека 80—90% ДНК оказывается

некодирующей.

Вырезание интронов из пре-мРНК происходит с участием

ферментов, распознающих границы интронов. Если это распозна-

ние окажется неточным, то соединившиеся экзоны будут кодиро-

вать другой белок — произойдет сдвиг рамки считы -

173

Amp

Рис.

62. Локализация КЭПа в рекомби-

нантной плазмиде рТК1 (показаны нук-

леотидные последовательности, участву-

ющие в регуляции экспрессии гена ти-

мидинкиназы — tk; нумерация нуклео-

тидов проставлена относительно КЭП-

участка; буквами внутри круга показаны

места действия соответствующих фер-

ментов-рестриктаз; Amp — устойчивость

к ампициллину.

в а н и я. Свершившуюся поломку в механизме биосинтеза

полипептида можно сравнить с типографским браком. Например,

в словах "копна сухого сена" сдвинули рамку считывания и пол-

учили бессмыслицу — "коп насухо госена" (интервалы между

словами засчитываются за одну букву). Механизмы сплайсинга

могут быть различными в зависимости от типа генов (ядерных и

внеядерных) и классов интронов (рис. 63). С распознаванием

механизмов сплайсинга связано выдающееся открытие конца 1982

г., когда Т. Чех с сотрудниками выявил авторестрикцию (самовы-

резание) интрона в гене рРНК у одного из видов Protozoa. При

этом не требовалось каких-либо ферментов и приложения энергии

1 г з

Экзон 1@Г

Инт

Р°

фз^

Эндонукяеаза

Эндонуклеаза

Авто -

каталитическая

транс •

этерификации

H^JT^POHJ^

Дрожжи

HeLa

Tetrahymena

Рис. 63. Транскрибирование гена (сравнение механизмов сплайсинга тРНК в

дрожжах, в экстрактах клеток HeLa и самосплайсинга рРНК Tetrahymena). Символы

вокруг фосфатных групп отражают судьбу каждой из них в ходе реакции.

174

извна Этим доказываются автокаталитические свойства нуклеи-

новых кислот, и предложенный Т. Чехом термин "рибозим" не

представляется алогичным.

Компартментализация эукариотической клетки служит веским

доказательством специального (более высокого, чем у прокариот)

разграничения функций и привязки их к определенным структу-

рам. Это относится и к белковому синтезу. Мономерные рибосомы,

в отличие от полисом, находятся в цитоплазме клетки в свободном

состоянии. Полисомы, как правило, располагаются либо цепочкой

ближе к ядерной мембране (связанные полисомы) и в тех местах,

где мРНК входит в цитоплазму, либо они (так называемые "сво-

бодные полисомы") ассоциируются через посредство мРНК с

клеточным цитоскелетом (см.). Это обусловлено качеством синте-

зируемых белков на полисомах.

В 1980 г. Трифонов и Зусман выяснили, что в геноме человека

пары адениновых нуклеотидов встречаются с периодичностью 10,5

на протяжении любой последовательности ДНК, которая взаимо-

действует с единицей гистонового ок-

тамера и образует нуклеосому. Эта

периодичность хорошо коррелирует с

периодичностью завитков в В-спирали

(см.) молекулы ДНК. Указанная пери-

одичность адениновых пар кодирует

закручивание спирали ДНК в одном

направлении вокруг комплекса гисто-

новых октамеров (рис. 64) и этот код

был назван "хроматиновым" или "код

упаковки хроматина". Высказано

предположение, что в структурах бло-

ков тандемно повторяющихся после-

довательностей потенциал скручива-

ния спирали как бы амплифицируется

(отангл. amplification — обилие). Более

того,

показано, что и при альтернатив-

ных вариантах закручивания спирали

(например, левостороннем) обнару-

живаются тандемные блоки пурино-

пиримидиновых оснований. Очевидно

блоки тандемных повторов кодируют

локус-специфичную упаковку ДНК и

структуру хроматина в ядре клеток

человека.

175

Рис.

64. Упаковка хроматина на

примере нуклеосомы: 1 — гистон

HI,

2 — двухнитевая ДНК, обви-

тая вокруг структуры, содержа-

щей 8 молекул гистонов — по 2

молекулы Н2А, Н2В, НЗ и Н4, 3

— спейсерный участок ДНК.

Локус-специфичный "код упаковки хроматина" участвует не

только в структурной организации хромосом в ядре клетки, но

может выступать как "код экспрессии гена", "код репликации"

(сайты репликации на протяжении данной повторяющейся после-

довательности) и "код рекомбинации".

Суммируя основные представления о структуре и функциях

генома акариотических, прокариотических и эукариотических ви-

дов,

необходимо подчеркнуть следующие его особенности:

1) Геном акариот и прокариот, а также митохондрий и пластид

эукариот является компактной совокупностью генов с небольшим

содержанием структурных повторов, что характеризует его эко-

номичность. Он кольцевидно замкнут (непрерывен), интервалы

между генами минимальны. Например, вся генетическая инфор-

мация умеренного фага X размещается в кольцевой молекуле ДНК

длиной в 50 kb, где содержится порядка 40 генов; плазмидная ДНК

из 95—97 kb включает до 100 генов; замкнутая ДНК Е. coli из 400

kb может содержать до 3000 генов (примерно 1500 пн составляют

один ген);

2) Генетический аппарат в клетках эукариот организован в

форме нескольких линейных хромосом, в которых ДНК прочно

связана с белками-гистонами, обеспечивающими упаковку и упо-

рядочение ДНК в виде структурных единиц—н уклеосом

(учитывая при этом "код упаковки хроматина" и экстраполируя

его на клетки большинства эукариот). Так, в гаплоидной клетке

Saccharomyces cerevisiae содержится 17 хромосом, в каждой из

которых детектировано ЮООкЬи, следовательно, число генов могло

бы достигать в такой клетке 11 000; для 23 хромосом в гаплоидной

клетке человека, где в одной хромосоме содержится 125 000 kb,

число генов должно бы возрасти до 2 млн. Предположительно

близкое число генов могло бы оказаться в гаплоидных клетках

кукурузы, где имеется 10 хромосом, в клетках кролика с 22

хромосомами, или мыши с 20 хромосомами. Однако, в хромосомах

эукариотических организмов содержится генов меньше, чем неко-

дирующих участков (спейсеров, или разделителей), и также име-

ется масса сходных между собой фрагментов ДНК, повторяющихся

десятки-сотни тысяч раз. Вот почему, например, у человека лишь

10 - 20% всей ДНК относится к разряду кодирующей. Но и в этом

случае число генов в 23 хромосомах гаплоидной клетки может

достигать порядка 200 000.

176

3) Гены эукариот, нередко располагаясь в хромосомной ДНК

рядом, образуют мультигенные семейства, состоящие

из небольшого числа родственных последовательностей. Напри-

мер,

гены, кодирующие рРНК у млекопитающих, обнаруживаются

в геноме сотнями своих копий, сгруппированных в зоны, а это

свидетельствует об избыточности генетических программ у вы-

сших организмов (создание "повышенной прочности").

4) Представители микробного, растительного и животного мира

имеют в составе генетического материала одни и те же строитель-

ные блоки, то есть их "кодовый словарь" в основном однотипен,

или универсален, и функционирует преимущественно в соответ-

ствии с центральными постулатом молекулярной генетики, сфор-

мулированным Ф. Криком в 1967 г.: генетическая информация

переносится по схеме ДНК

—>

РНК

—»

Белок (у вирусов может быть

несколько видоизменена), но никогда — от белка к РНК.

5) Каждый ген проявляет себя (экспрессируется) путем обра-

зования, или биосинтеза мРНК (транскрипция гена) с последую-

щим переводом (трансляция) информации в специфическую по-

липептидую цепь, фактически являющуюся продуктом гена. Ген и

его продукт колинеарны,то есть последовательность кодонов

(триплетов) в гене точно соответствует последовательности амино-

кислот в белке.

6)'

Ген кодирует строение белковой молекулы и регулирует

процесс ее синтеза.

В таблице 19 суммированы основные представления о строении

и функциях генетического аппарата клеток разного уровня орга-

низации.

Зная строение и функцию генов, а также владея методами их

выделения и переноса в различные клетки или молекулы нуклеи-

новых кислот, можно с достаточной уверенностью подходить к

постановке генноинженерных работ.

5.2.КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНОВ МЕТОДАМИ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ

ИНЖЕНЕРИИ;

рДНК-БИОТЕХНОЛОГИЯ

5.2.1.

Общая характеристика генетической инженерии. Гене-

тическая инженерия — это методы получения рекомбинантных

ДНК, объединяющих последовательности разного присхождения.

Некоторые ученые трактуют генетическую инженерию "как ис-

кусство использования знаний, методов и техники физико-хими-

ческой биологии и молекулярной генетики для конструирования

177

организмов

заданными наследственными свойствами"

(В. Н.

Рыбчин, 1986).

а б л и ц а

19. Основные характеристики генетического аппарата

прокариот

и эукариот

Характеристика

генов

про-

це-

ссов

анскри

Е-

ции

транс

по строению

по стабильности

по координации

экспрессии

по числу'

РНК-полимераз

по наличию

энхансеров

по строению

промоторов

по мРНК

по константе

седиментации

рибосом

по сайту

связывания рибосом

,по

ко-

донам

инициации

терминации

Прокариоты

непрерывны

стабильны

опероны

(регулоны)

управляются

операторами

сайтами

связывания

регуляторных

белков

одна

отсутствуют

типичен единый

план строения;

наличие двух

консервативных

последованостей:

ТАТААТ

(-10) и

ТТТАЦА

(-35)

колинеарна гену

или оперону

70S (50S

и 30S)

последователь-

ность

ядром АГГА

АУГ, редко

ГУТ

УАА, УАГ,

УГА

Эукариоты

прерывны

(содержат интроны)

возможны

перестройки

оперонов

нет. В

индуцибельных

генах имеются

регуляторные

элементы

три

имеются.

Энхансеры

тканеспецифичны

промоторы генов,

кодирующих

белки, имеют одну

консервативную

последователь-

ность TATA

(А/Т)

А(А/Т)

(-30) и

богатый

ГЦ-участок (-40...

100)

первичный

транскрипт

колинеарен гену.

"Зрелая" мРНК

образуется

процессе

сплайсинга

80S (60S

и 40S)

консервативной

последователь-

ности

не

выявлено

АУГ

УАА, УАГ,

УГА

178

Очевидно, что под искусством автор понимает умение органи-

зовать и методически реализовать генноинженерную задачу —

получить рекомбинантную ДНК с последующим включением ее в

реципиентную клетку или осуществить перенос целых хромосом

от клеток-доноров в клетки-реципиенты.

Иногда понятия "генная инженерия" и "биотехнология" отож-

дествляются (А. А.Баев, 1984), хотя несомненно генная инженерия

представляет собой один из методов науки биотехнология.

основу

генноинженерных методов заложена способность ферментов —

рестриктаз расщеплять ДНК на отдельные нуклеотидные последо-

вательности, которые могут быть использованы для встраивания

их в геномы бактериальных плазмид и фагов с целью получения

гибридных, или химерных форм, состоящих из собственной

ДНК и дополнительных встроенных фрагментов несвойственной

им ДНК. Поэтому методами генетической инженерии добиваются

клонирования генов, когда выделяют нужный отрезок ДНК

из какого-либо биообъекта и затем получают любое количество

его,

выращивая колонии генетически идентичных клеток, содер-

жащих заданный участок ДНК. Другими словами клонирование

ДНК — это получение ее генетически идентичных копий.

Генетическую инженерию подразделяют на генную инжене-

рию,

геномную инженерию и хромосомную инженерию. Сущ-

ность первой состоит в целенаправленном использовании пере-

строек естественного генома, осуществляемых in vivo или in vitro,

для изменения генетических характеристик известных вирусов и

клеток. В качестве примеров генной инженерии in vivo можно

назвать: транслокацию (перемещение) в вирусные геномы некото-

рых клеточных генов, придающих вирусам свойства онкогенности;

трансдукцию (перенос) клеточных генов от клеток-доноров в клет-

ки-реципиенты с помощью фагов, и др. Примером генной инже-

нерии in vitro является создание молекулярных химер из фрагмен-

тов ДНК разного происхождения, включение их в реципиентные

клетки Е. соП, Вас. subtilis и др. с последующим культивированием

этих организмов в целях получения необходимых белковых про-

дуктов (пептидных гормонов, ферментов и т. д.).

Сущность геномной инженерии заключается в целенаправлен-

ной глубокой перестройке генома акариот, прокариот или эукари-

от, вплоть до создания новых видов. При геномной инженерии

добиваются внесения большого количества дополнительной гене-

тической информации и в результате получают гибридный орга-

низм, отличающийся от исходного по многим признакам. Гибриды

179

оказываются жизнеспособными лишь в тех случаях, когда они

содержат все безусловно необходимые (облигатные) гены, когда у

них налажены и взаимно согласованы регуляторные связи между

совмещенными генами, и, наконец, когда имеется структурное

соответствие между продуктами матричного синтеза (белками).

При геномной инженерии возможно получение половых (сли-

яние гамет) или соматических (слияние неполовых клеток) гибри-

дов.

Половые гибриды получают либо в естественных, либо в

искусственных (экспериментальных) условиях. Соматические гиб-

риды способны формироваться лишь в искусственных условиях у

прокариот и эукариот, то есть у клеточных форм (клеточная

инженерия).

Примером естественной (природной) геномной инженерии

является рекомбинация геномов вирусов гриппа, относящихся к

типу А. На основании антигенных характеристик рибонуклеопро-

теинов выделяют вирусы гриппа А, В и С. Изменения антигенных

свойств постоянно происходят у вирусов типа

А,

меньше — у типов

В,

тогда как вирусы типа С являются антигенно стабильными. К

тому же известны штаммы вируса гриппа А, изолируемые от

свиней, лошадей, уток, цыплят. Некоторые изоляты вируса от

животных антигенно подобны штаммам, циркулирующим среди

людей. Поэтому более полно изученными к настоящему времени

также оказались вирусы типа А. Их геном состоит из 8 различных

однонитевых сегментов РНК с общей молекулярной массой 2—

А-

кДа (см. рис. 22а). Большая часть полинуклеотидов, состав-

ляющих вирусные РНК-сегменты, содержат уридин на З'-конце. С

вирусным геномом ассоциирована РНК-зависимая РНК-полимера-

за. Рибонуклеопротеин окружен белковым слоем (М), образующим

внутреннюю часть вирусной оболочки. Белок М включает малый

протеин с ММ 26 кДа, составляющим 40% от всего белка вирусной

частицы. Порядка 20% массы частицы приходится на липидный

бислой, который, по-видимому, имеет клеточное происхождение.

Гемагглютинин отвечает за агглютинацию эритроцитов вирусом

А. Он представляет из себя гликопротеин с ММ 75 кДа. Нейрами-

нидаза ответственна за рецепторцо-разрушающую активность ви-

руса, обеспечивая ему выход из эритроцита или клетки-"хозяина".

Нейраминидаза состоит из четырех полипептидных молекул с ММ

порядка 60 кДа, и, наряду с гемагглютинином, обладает антигенной

активностью. Их используют для регистрации и объяснения анти-

генных изменений вируса. К началу 90-х годов было известно 11

подтипов гемагглютинина (HI—HI

и 8 подтипов нейраминидазы

180

(N1—N8) у вирусов

А.

Поэтому система обозначения вируса гриппа

включает название штамма, номера субтипов гемагглютинина и

неираминидазы. Например, вирус гриппа А(свиной) Тайвань

/1/70(H3N2). Это значит, что вирус изолирован от свиней на

острове Тайвань в 1970 году, содержит гемагглютинин 3(НЗ) и

нейраминидазу 2 (N2). Оба антигена (Н и N) формируются и

контролируются генами (РНК-фрагментами) независимо друг от

друга. Вследствие сегментарности генома вирус проявляет реком-

бинацию с высокой частотой и, как следствие, происходят изме-

нения в антигенных свойствах вирусов (прежде всего — по

гемагглютинину и нейраминидазе).

В экспериментальных условиях возможно проведение РНК —

РНК-гибридизации с последующим определением профилей плав-

ления молекул гибридных РНК в присутствии формальдегида.

Известны некоторые вирусы бактерий, объединяющие в себе

свойства фагов и плазмид. Их назвали фазмидами. Они могут быть

природного и экспериментального (искусственного) происхожде-

ния. К природным относятся некоторые умеренные coli-фаги (N15,

Р1),

к искусственным — фазмида col 106, способная при 32°С

проявлять свойства плазмиды, а при 37°С индуцирует лизис реци-

пиентных клеток.

Благодаря высокой степени генетической гомологии Е. coli,

Salmonella spp. и Shigella spp. можно получать хромосомные гиб-

риды между ними:

Доноры ДНК (хромосомы) Реципиенты ДНК (хромосомы)

Е. coli Различные штаммы Е. coli

Shigella spp.

Salmonella spp.

Salmonella typhimurium Различные виды и штаммы

Salmonella spp.

Shigella flexneri E. coli, Salmonella typhi и др.

В этих целях чаще прибегают к методу конъюгации бактерий.

Однако следует иметь в виду, что виды с небольшой генетической

гомологией (тем более — при отсутствии ее ) слабо конъюгируют

или не конъюгируют совсем и обмена генами между ними прак-

тически не наблюдается. Здесь перспективным оказывается метод

слияния протопластов, ныне широко используемый в работе с

прокариотами и эукариотами.

181

Клеточные стенки обычно у молодых клеток частично или

тотально лизируют с помощью гидролитических ферментов. Воз-

никающие протопласты затем подвергаются слиянию в среде с

полиэтиленгликолем и соответствующими стабилизаторами про-

топластов, либо используют электрическое или температурное

воздействие в целях деполяризации мембраны. Таким образом

можно создавать межвидовые и, даже, межродовые гетерокарио-

тические гибриды. Другими словами, таким путем удается совме-

щать в одной клетке геномы клеток (организмов) с половой несов-

местимостью. Например, удается слить протопласты клеток мор-

кови и ячменя, кукурузы и сои, дурмана и красавки, картофеля и

томата (pomato), некоторых бактерий и растений, мыши и моркови,

мыши и человека. Однако в большинстве случаев такие гибридные

клетки не развиваются в полноценные организмы. К тому же

стабильность (жизнеспособность) гибридов находится в обратно-

пропорциональной зависимости от эволюционной отдаленности

гибридизуемых видов, то есть эволюционно далекие виды менее

жизнеспособны в гибридном состоянии, чем близкородственные

виды. Жизнеспособные гибриды сохраняют большую часть генома

одного из слившихся партнеров. Поэтому соматическая гибриди-

зация практически реализуется пока на ограниченном числе видов

и родов. Так, используя протопласты из листьев петунии дикого

типа одного вида и "альбиносные" протопласты суспензионных

культур другого вида, удалось сконструировать амфидиплоидные

(от греч. am.fi— с обеих сторон, diploos — двойной, eidos - вид),

или аллотетраплоидные соматические гибриды с 28 хромосомами,

способные трансформироваться в цветущие растения:

а) вид Petunia parodii (2n= 14)

б) вид Petunia hybrida (2n= 14)

•

в) вид Petunia inflata (2n= 14)

Соматические гибриды: 1) P.parodii x P.hybrida (4n = 28)

2) P.parodii x P.inflata (4n = 28).

К. Келер и Ц. Милынтейн в 1975 г. смогли впервые получить

соматические гибриды клеток млекопитающих — гибридо-

м ы, продуцирующие так называемые моноклональ-

ные антитела. В иммунном организме антитела образуются

плазматическими клетками, возникающими в результате диффе-

ренциации В-лимфоцитов в ответ на антигенную стимуляцию.

В-лимфоциты — высоко специализированные клетки, их в орга-

низме порядка 10

клонов и каждый клон синтезирует антитела

182