Елинов Н.П. Основы биотехнологии

Подождите немного. Документ загружается.

ющими методами: сменой температурных режимов выращивания,

голоданием с последующим переносом на полные среды, фильтра-

цией клеток одинаковых размеров. В синхронизированном состо-

янии они сохраняются в течение 2-4 генераций, после чего пере-

ходят к асинхронному росту, развитию и размножению.

В случаях синхронизации клеток млекопитающих применяют

сепарацию и индукцию. В первом случае проводят дифференци-

альное центрифугирование в градиентах бычьего сывороточного

альбумина, сахарозы или фиколла (синтетический высокомолеку-

лярный сополимер сахарозы и эпихлоргидрина.

При этом отделяются, в основном, клетки el—СН —СН—СН

одинакового возраста и объема, перешедшие

\ /

из фазы митоза в фазу G-2 (см. раздел 5.1.),

3nHXAO

P"w»H О

когда их объем возрастает примерно вдвое. Синхронизированные

клетки составляютт 65-70%. Во втором случае (при индукции)

блокируют клетки в определенной фазе жизненного цикла с

помощью ингибиторов синтеза ДНК (аметоптерина, 5-аминоура-

цилла, гидроксимочевины) или ингибиторов митоза (винобластин

— см. раздел 4.3, колхицин и его производные).

A ^

^СН, -

—С >- CO-NH-CH-(CH

)

-COOH

N | ] * ' СООН

аметоптерин (метотрексат; Л-амино-И -метилфолмевая кислота)

2 Hj

СО

NHOH lL,CO

NHCOCH,

гидрокси-

5-аминоурацил

моч

евина колхицин '

Клетки затем промывают для освобождения от ингибиторов

(блокаторов) и дают им синхронно развиваться, учитывая тот факт,

что после одной-двух генераций они становятся асинхронными.

При индукции достигают меньшей синхронизации клеток (2-50%),

чем при сепарации, однако данный показатель можно повысить

при осуществлении повторных блокировок.

Степень синхронизации определяется митотическим индексом

(Ml),

то есть индексом частоты митозов на 1000 клеток (оценивают

в окрашенных препаратах): Ml = 1000:МС, где МС—число клеток

с признаками митоза. Зависимость здесь обратно пропорциональ-

ная — чем меньше Ml, тем синхронизация больше.

153

Для некоторых представителей эукариот (не прокариот) изве-

стны фазовые состояния, сопровождающиеся изменением росто-

вых характеристик — трансформация. Так, отдельные грибы

являются диморфными, то есть фенотипически двойственными,

растущими либо в мицелиальной форме, либо в дрожжевой

(Aureobasidium spp., Histoplasma spp., Candida spp., Mucor spp. и

др.).

Так, например, A. pullulans — продуцент экзогликана в

глубинных условиях растет в виде одноклеточных, почкующихся

дрожжевых клеток, тогда как на поверхности агаризованных

питательных сред дрожжевые клетки трансформируются в мице-

лиальные, мало или совсем не образующие экзогликана. Подобная

морфо-физиологическая трансформация является обратимой. В

этой связи выделяют три главные группы диморфных грибов —

температурозависимые (Blastomyces dermatitidis), зависимые от

температуры и от питательных веществ (Histoplasma capsulatum),

и зависимые только от питательных веществ (Candida albicans).

У животных клеток трансформация — процесс необратимый.

Он может протекать под влиянием онкогенных РНК- или ДНК-ви-

русов и называется вирусной трансформацией. К РНК-онкоген-

ным вирусам относятся лейковирусы кошек, мышей и птиц, вирус

опухоли Биттнера, поражающий млекопитающих, вирусы сарко-

мы;

к ДНК-онкогенным вирусам относятся: аденовирусы, вирусы

папилломы, полиомы и SV-40 (от лат. simian virus — вирус обезьян)

из группы папова-вирусы, герпес-вирусы и вирусы оспы. Следует

иметь в виду и тот факт, что ДНК нормальных клеток могут

содержать в себе провирусный материал и поэтому такие клетки

способны к необратимой трансформации под влиянием физиче-

ских и химических мутагенов. Провирусные сегменты ДНК назы-

вают онкогенами.

В условиях, ограничивающих рост нормальных клеток, транс-

формированные клетки как менее требовательные к факторам

роста, пролиферируют до более высокой плотности и они стано-

вятся способными культивироваться в глубинных условиях (сус-

пензионные культуры) при изменении своей формы до сфериче-

ской. Следовательно, и у грибных, и у животных, а также у ряда

растительных клеток их морфологическое сходство (сферичность,

округлость) в глубинных условиях выращивания находится под

контролем генотипа и сопровождается изменением преимущест-

венно клеточной мембраны.

Трансформированные in vitro клетки представляют собой по-

тенциально важные объекты для выбора оригинальных продуцен-

тов ценных веществ.

154

Глава 5.

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

В ОБЛАСТИ ГЕНЕТИКИ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ

БИОЛОГИИ ВИРУСОВ, КЛЕТОК

И КЛЕТОЧНЫХ СИСТЕМ

Генетика — наука о наследственности прошла сложный путь

своего развития; фактические данные и обоснованные гипотезы в

ней были, к сожалению, использованы даже для утверждения таких

социально-политических доктрин, которые противоречили науч-

ным истинам, этике и здравому смыслу (например, попытка обос-

нования превосходства одних рас людей над другими; полное

отрицание генов как якобы надуманных, "мифических" и несуще-

ствующих структур в зародышевых клетках любых организмов;

доминирующую зависимость наследственности от условий внеш-

ней среды обитания того или иного

вида;

отрицание внутривидовой

борьбы и признание межвидовой в параллели с борьбой классов

в человеческом обществе, и т. д.). Подобные грустные страницы в

истории генетики канули в вечность и этому помогло выдающееся

событие в науке, когда Дж. Уотсон и Ф. Крик в 1953 г. расшифро-

вали двойную спираль ДНК и подвели материальную базу под ранее

упомянутый "мифический" ген — материализация гена. С тех пор

прошло более 40 лет, и трудно охватить все области генетической

науки, где бы ни были сделаны открытия или которые не получили

бы мощного стимула для своего развития, включая современную

биотехнологию. Однако на фоне всех достижений в течение

последних 20 лет, нельзя забывать о том, что М. Фишер еще в 1868

г. открыл нуклеин, Ф. Гриффит в 1928 г. описал явление трансфор-

мации у бактерий, а О. Т. Эйвери, К. М. Мак-Леод и М. Мак-Карти

в 1944 г. доказали, что трансформирующим агентом является ДНК;

Ж. Ледерберг в 1947 г. открыл процесс конъюгации у Е. coli, a

позже было доказано, что спаривание клеток бактерий обусловле-

но генетически.

К времени расшифровки ДНК Э. Чаргафф (1950) уже сформу-

лировал свои правила, согласно которым: 1) число оснований с

аминогруппами в шестой позиции равно числу оснований с кетог-

руппами в той же позиции, то есть А (аденин) + Ц (цитозин) = Г

(гуанин) + Т (тимин); это единственное правило, приложимое к

ДНК и к большинству типов РНК, в которых Т заменен на У

(урацил);

2) молярное содержание аденина равно молярному содержа-

нию тимина (А = Т или А/Т= 1);

155

3) молярное содержание гуанина равно молярному содержа-

нию цитозина

(Г

= Ц или Г/Ц = 1);

4) сумма пиримидиновых оснований равна сумме пуриновых

оснований, то есть Ц + Т=А+Г (Пир/Пур= 1);

5) у бактерий отношения А/Т и Г/Ц близки единице, тогда как

отношение А/Г изменяется в интервале 0,4—2,7. Интервал изме-

нения А/Г для растений (1,1—1,7) и животных (1,3—2,2) меньше,

чем для ДНК бактерий. По соотношению нуклеотидов выделены

АТ-тип ДНК, когда А+Т >

+ Ц, или ГЦ-тип ДНК, когда

+ Ц >

А+Т.

Последующие успехи в области генетики нарастали исключи-

тельно быстро: в 1956 г. А. Корнберг выделил ДНК-полимеразу, в

1961 г. М. Ниренберг предложил подходы и сам участвовал в

расшифровке генетического кода, в 1964 г. осуществлен первый

синтез полирибонуклеотидов (X. Г. Корана), в 1965 г. В. Арбер

открыл ферменты-рестриктазы, или рестрикционные эндонуклеа-

зы,

в 1969 г. Дж. Бекуит с сотрудниками выделил из кишечной

палочки лактозный оперон, в 1970 г. Г. Темин и Д. Балтимор

открыли ревертазу, или обратную транскриптазу, в 1972 г. П. Берг

с сотрудниками выполнили первый генно-инженерный экспери-

мент — объединили ДНК R-плазмиды (плазмида множественной

устойчивости к лекарственным веществам) с ДНК мушки дрозо-

филы и размножили рекомбинант в кишечной палочке. В 1975—

1978 гг. ученые овладели методами выделения из хромосомной и

плазмидной ДНК любых генов и исследования их структуры (У.

Гилберт, Р. Дейвес, Ф. Курильский, П. Ледер, А. Максам, Т.

Манниатис, Б. Мах, Ф. Ружон, Ф. Сэнгер, С. Тонегава).

Каждый год удваивается число прочитанных генов у разных

организмов, которое собирается в банках данных. Эти банки

накопили уже порядка 2,5

•

пн суммарного текста, пользование

которым стало возможным лишь с привлечением ЭВМ.

В 1976 г. была основана фирма "Генентек" в г. Сан-Франциско

(США),*

а в 1977 г. в этой фирме был осуществлен синтез челове-

ческого соматотропного гормона

—

соматостатина клетками Е. coli

в ферментаторе объемом 8 л.; в 1978 г. там же был получен гормон

инсулин при выращивании Е. coli в глубинных условиях. В начале

80-х годов так же с помощью Е. coli были получены эндорфины

(эндогенные пептиды мозга с подобным морфину действием). В

1980 г. в компании "Биоген" (США) впервые получили с помощью

биосинтеза (продуцент — кишечная палочка) интерферон.

Таким образом, расшифровка строения ДНК стала эпохальным

156

событием не только в генетике, но и в биологии в целом. Общая

генетика и общая биология обогатились фундаментальными дан-

ными по строению и составу ядерного аппарата, по углублению

подходов к пониманию эволюции жизни на Земле, по изменчиво-

сти и наследственности организмов и по другим направлениям.

Частные генетика и биология (например, микроорганизмов, рас-

тений, животных) получили почти неограниченные возможности

манипулировать с генетическим материалом, определять механиз-

мы и диапазон его контролирующих функций в процессах мета-

болизма.

Биологическая технология как пограничная научная дисципли-

на с 1972 г. перешла на новый генотехнический уровень (см. главу

1),

когда методы генной инженерии были перенесены из лабора-

торных условий в производственные —получила развитие реком-

бинантная АНК-биотехнология. или сокращенно рАНК-биотехно-

логия. По существу рДНК-биотехнология^базируется на природных

возможностях наследственных структур различных представите-

лей живого мира, даже когда приходится вводить чуждую реципи-

енту, но воспринимаемую им генетическую информацию. Такая

рецепция генетического материала и определяется природными

возможностями реципиента.

5.1.

Природа и передача генетической информации. Исходя их

установленных данных о том, что ДНК, в силу комплементарности

нуклеиновых оснований, представляет собой двойную спираль, что

в бактериальных клетках эта спираль кольцевидно замкнута и

составляет единственную хромосому, что в клетках любых орга-

низмов имеются механизмы синтеза и гидролиза ДНК с помощью

специфических ферментов, и, наконец, что процессы размножения

обусловлены и непосредственно связаны с функцией ДНК микро-

организмов или зародышевых клеток макроорганизмов, целесооб-

разно расширить представление о ядре и ядерном аппарате клеток,

считая первое составной частью

второго.

В таком случае к ядерному

аппарату должны быть отнесены все те структуры, которые обес-

печивают его запрограммированные функции — у прокариот:

нуклеоид, рапидосомы (у некоторых видов), перегородочные ме-

зосомы, рибосомы; у эукариот: ядро, ядрышко, нуклеолемма, по-

росомы, центриоли, митотический аппарат, рибосомы.

Биохимическим выражением наследственности является мат-

ричный синтез специфического белка согласно уточненному прин-

ципу

Дж.

Бидла и Э. Тейтама "один ген — одна белковая молекула".

157

ужения рибосом ^

АУГ (кодом - инициатор ^

в цепи мРНК)

УАА (колон

пунктуации)

Рис.

51.

Схема синтеза N-формилметионил-полипеп-

тида.

Матричный синтез

подразделяют на ре-

пликацию, транс-

крипцию и трансля-

цию.

На уровне транс-

крипции (по крайней

мере, у прокариот)

осуществляется в ос-

новном контроль экс-

прессии генов, а у

эукариот — и на уров-

не трансляции.

_При матричном

синтезе матрицей вы-

ступает одна из нитей

ДНК, "слепок" с кото-

рой — комплементар-

ная матричная (ин-

формационная) РНК, или мРНК, обеспечивает синтез белковой

молекулы в рибосомах с участием транспортных РНК (тРНК) и

соответствующих ферментов — полимераз. Участок мРНК, комп-

лементарный участку смысловой цепи ДНК, называется транс-

криптом.

Показанная на рис. 51 схема синтеза белковой молекулы в

действительности значительно сложнее. Вспомним, что среди по-

следовательно расположенных генов в хромосоме имеются гены

— регуляторы, операторы, структурные, терминаторы, и что каж-

дая хромосома представлена одной молекулой ДНК. Поскольку

хромосомы в клетках находятся в незамкнутом состоянии, постоль-

ку у них имеются 3' и 5' свободные концы, которые отсутствуют

в единственной кольцевидно замкнутой хромосоме прокариотиче-

ской клетки или организованной вирусной частицы (таблица 17).

Различают следующие формы ДНК по архитектонике двойной

спирали: В, А, С, Z и SBS. В форме В на шаг спирали (3,4 нм)

приходится 10 пн (пар нуклеотидов), располагающихся перпенди-

кулярно к оси спирали; форма

является трансформантом формы

при снижении влажности ее ниже

75%;

шаг спирали уменьшается

до 2,8 нм, на виток приходится уже 11 пн, располагающихся под

углом 20° к оси спирали, а длина цепи укорачивается примерно на

25%.

Форма С имеет шаг спирали, равный 3,3 нм и на один виток

158

"»Дг а б л и ц а 17. Характеристика молекул днк в некоторых хромосомах

*5*

Организм/

вирион

Человек

Saccharomyces

cerevisiae

Eschexichia

coli

Бактериофаг

X174

число

(гаплоид)

Хромосомы

форма

незамкнутая

— " —

замкнутая

длина, см

4,1

0,33

0,14

0,00018

Среднее

число пар

оснований в

ДНК на

хромосому,

х10

кЬ

125 000

1 000

4000

5,4

Примечание: кЬ-килооснования (от англ. kilobases).

ее приходится 9 пн. Форма Z (зигзаг) присуща углеводно-фосфат-

ному остову ДНК в участке с чередующимися последовательностя-

ми гуанина (Г) и цитозина (Ц). Это левая спираль (все предыдущие

формируются в виде правых спиралей) с 12 пн в одном витке.

Форма SBS (от англ. side by side — бок о бок) лишена взаимозак-

рученности цепей в двойную спираль, что важно для биосинтеза

ДНК.

Названные выше гены в хромосомной ДНК обладают специ-

фическими функциями (средний размер гена оценивают в 1500

пн).

Ген-регулятор определяет синтез белка-репрессора, способно-

го связываться с оператором (см.) на ДНК или

РНК, предотвращая

соответственно транскрипцию или трансляцию. Ген-оператор —

участок ДНК, связываясь с которым белок-репрессор предотвра-

щает инициацию (начало) транскрипции на прилежащем промо-

торе,

ответственном за связывание фермента РНК-полимеразы,

инициирующей транскрипцию гена. На промоторе гена эукарио-

тической клетки имеется специфический локус (участок), в десят-

ки—сотни тысяч раз повышающий число посадок РНК-полимера-

зы на промотор ближайшего гена. Этот локус называется энхан-

сером, или усилителем (от англ. enhancer

—

усилитель). Энхансеры

тканеспецифичны. Они представляют собой большую разнообраз-

ную группу регуляторных элементов клетки. Другими словами это

элементы позитивного контроля. К элементам негативного конт-

роля относятся сайленсеры (от англ. silencer — глушитель), угне-

тающие транскрипцию. Энхансеры и сайленсеры обладают только

цис-действием, влияя на гены, локализующиеся на той же молекуле

159

ТАЦА ТАТААТ ЦАТ АГГЛ АТГ ТАА ЦЦГЦ ГГЦГиг ТГТТ

ЧШ

в5'ф!

СР

Уп4

&к.

I.TK

I I

:о

3№-

|Г-"

! f-

!>AAU "

ЦГ УУУУ'

rNII. 'тп^гттяпгтгтртгтп- СООН

л NH

-^mnreresranrawrswra^ соон

З'ОН

РИС.

52. Схематичное строение (а) и экспрессия (в-д)

гена прокариотической клетки: Р-промотор, СР-сайт

связывания, ИК-кодон инициации

ТК-кодон терми-

нации транскрипции, t

—

терминатор транскрипции;

б — некодирующая нить ДНК с характерными сай-

тами; координаты нуклеотидов промотора имеют от-

рицательный знак (-10 для последовательности При-

бноу, -35 для последовательности Хогнесса); транс-

крибируемые нуклеотиды — положительный знак;

в-матричная РНК, г-белок-предшественник, д-актив-

ный белок; п-палиндром, SD — последовательность

Шайна-Далгарно.

ДНК, где располагают-

ся названные элемен-

ты.

Структурные гены

ответственны за син-

тез белковых молекул

(рис.

52).

Ген-термина-

тор блокирует транс-

крипцию и прерывает

синтез белка. К этому

гену примыкает тер-

минатор (стоп-сигнал),

состоящий из опреде-

ленной последователь-

ности нуклеотидов в

ДНК. У Е coli он эф-

фективен только в

присутствии р-факто-

ра белковой природы

с ММ 50 кДа, не свя-

занного с РНК-пол-

имеразой. В терминации у Е. coli участвует и другой белок,

названный к-частицей.

Оперон — это группа сцепления структурных генов, находя-

щихся под контролем гена-оператора и гена-регулятора, а также

контролирующих элементов, узнаваемых продуктами регулятор-

ного гена. На рис. 52 изображена схематичная структура гена

прокариотической клетки. В его состав входят участки, располо-

женные перед кодирующей последовательностью (лидерная

5'-об-

ласть) и после нее (концевая З'-область); синтез мРНК происходит

в направлении от

5'-конца

к 3'-концу. Отсчет нуклеотидов в генах

ведут от первого транскрибируемого нуклеотида, обозначаемого

как +1 (или 1); отсчет в противоположную сторону начинают с

—1.

Нд и РЬ на рисунке обозначают консервативные последова-

тельности Хогнесса и Прибноу соответственно. Первая из них

представляет собою гексамер 5'ТТГАЦАЗ', локализующийся около

координаты —35. Последовательность Хогнесса необходима для

узнавания промотора РНК-полимеразой. РЬ-последовательность

является также гексамером 5'ТАТААТЗ', локализующимся около

координаты

—10.

Эта последовательность необходима для тесного

связывания с РНК-полимеразой. За ней закрепилось название

160

"TATA-box", или "ТАТА-блок". Ядром последовательности

(Шай-

на—Далгарно) служит тетрамер 5'АГГАЗ' на мРНК, являющийся

местом (сайтом) связывания рибосом. Всего в

= последователь-

ности имеется 5—9 нуклеотидов.

В ДНК некоторых прокариот (археобактерии), в ядре и мито-

хондриях эукариот кодирующие области прерываются большими

некодирующими ДНК-последовательностями (до 5000 пар нуклео-

тидов). По предложению У. Гилберта (1978) кодирующие области

называют экзонами, или доменами, некодирующие — интронами.

Например, в генах тяжелой Н-цепи иммуноглобулинов (Ig) нахо-

дится не менее 4 интронов и 5 экзонов, в гене яичного белка

(овальбумина)7 интронов и 8 экзонов; из 3,5 биллионов пар нук-

леотидов в ДНК гаплоидного генома человека кодирующими явля-

' ются менее 10%. Прерывистость генов у эукариот — явление

обычное, хотя известны гены, в которых подобная прерывистость

не обнаружена (в генах интерферона, гистонов).

В интронах отсутствует более или менее заметная гомология

между двумя концами их, а на границах с экзонами в разных генах

присутствует так называемая каноническая (усредненная) после-

довательность нуклеотидов (относительно короткая) — нередко

GT—слева и AG—справа:

КП КП

I I I 1

A64G73G100T100A62A68T63 ... 6Ру74—87 NC65A100G10 о N

I -f 11 £ I I £_l

экзон интрон экзон

КП обозначает каноническую последовательность, цифры —

проценты случаев обнаружения

основании на границе экзон-ин- j дашш^1дашшдшхшт1сдата)омашваЬ!воия

трон.

Экзоны во много раз меньше

(1000 пн) интронов. Интрон пред-

]

ставляет собой транскрибируе-

мый (но не кодирующий) участок

ДНК, который удаляется из со-

ЛьтшЬтЬтЬшЬ

става транскрипта при сплайсин-

ге (ОТ англ. splicing — сплетение, Рис.

53.

Сплайсинг (процессинг) РНК: 1

сшивание). Сплайсинг протекает

—

транскрипция,

2 —

трансляция,

а, б,

в ядре, и он заканчивается объе-

—

экзоны,

г,

—

интроны;

—

днк,

ДИНением ЭКЗОНОВ В зрелую П - РНК, Ш - мРНК. IV - Белок.

мРНК (рис. 53). Участок ДНК между правым концом интрона и

левым концом экзона называется акцепторной точкой сплайсинга.

ДНК митохондрий интроны кодируют синтез отдельных белков,

6 т. 8524

,61

которые сами могут участвовать в последующем вырезании нит-

ронов. Некоторые молекулы белков (ферментов) кодируются од-

новременно экзонами и интронами, например, матураза (от англ.

mature — созревать). Возможно, что для каждого интрона сущест-

вует своя матураза. Интроны митохондриальной ДНК похожи на

бактериальные транспозоны

и,

возможно, матуразы происходят из

транспозаз (см.).

Утверждается, что существуют белки, кодируемые ядерными

экзонами и интронами (м-белки), которые принимают участие в

образовании и перено-

се мРНК через ядер-

ную мембрану (П. П.

Слонимский, 1980).

При этом часть белка,

кодируемая интроном,

включает преимуще-

ственно гидрофобные

аминокислоты, вслед-

ствие чего охотно ло-

кализуется в богатой

липидами ядерной

мембране и притяги-

Рис.

54.

Выведение зрелой мРНК через пору ядерной

вает мР

НК. Часть М-

мембраны по П. Слонимскому (1985). белка, кодируемая ЭК-

зоном, притягивает

но-

вую полипептидную цепь, транслирующуюся с того же экзона. На

уровне ядерной мембраны находится ферментный комплекс сплай-

синга интронов. По мере прохождения сплайсинга зрелая мРНК

(без интронов)выводится через пору ядерной мембраны (рис. 54).

В процессе дифференцировки эукариотических клеток обна-

ружена неоднотипность сплайсинга, а именно то, что в одном

случае предстает интроном, в другом может оказаться экзоном, и

наоборот. В частности, доказано, что интрон цитохрома b - это

зкзон, кодирующий матуразу. Следовательно, существуют гены,

способные кодировать не один белок. Например, один из генов

тканевой совместимости кодирует 2 белка; один из прерывистых

генов крысы кодирует синтез парат-гормона в паращитовидной

железе и нейропептида — в гипофизе. Поэтому нельзя абсолюти-

зировать понятие "один ген — одна белковая молекула". В биохи-

мической технологии интроны привносят определенные затрудне-

ния при экспрессии (проявление, выражение свойств) эукариоти-

ческих генов в клетках многих прокариот, лишенных аппарата

сплайсинга мРНК.

162