Блюменфельд Л.А. Проблемы биологической физики

Подождите немного. Документ загружается.

8.4] МЕМБРАННОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ: ТЕРМОДИНАМИКА 271

яый

перенос

двух

электронов через пункт сопряже-

ния

II *).

Аналогичные представления развиваются в работах

[47-49].

В пункте сопряжения III аналогичным способом ис-

следовали зависимость от энергизации митохондрий ОВП

цитохромов а

и а [44]. Оказалось, что стандартное зна-

чение ОВП цитохрома а

понижается с 395 до

300—290

мв

после энергизации митохондрий добавкой АТФ. Ра-

зобщители снимают этот эффект. Стандартное значение

ОВЩцитохрома а (+190 мв) не меняется под действием

АТФ. Чане и Эресинска [50] предложили на основании

этих данных

схему

трансформации энергии и образования

первичного химического макроэрга в пункте III. Первич-

ным

макроэргом является в этом

случае

низкопотенциаль-

ная

форма цитохрома а

с ОВП около +300 мв. Незна-

чительная величина изменения ОВП при энергизации

делает

такую интерпретацию данных [44, 45] не очень

правдоподобной (изменение свободной энергии системы

при

протекании окислительно-восстановительного про-

цесса в пункте III оказывается приблизительно в шесть

раз меньше величины необходимой для синтеза одной мо-

лекулы АТФ).

Приведенная выше интерпретация измерений Уилсона

Даттона становится еще более сомнительной в свете

результатов, полученных недавно Кэзуэллом [51]. Он

указал, что окислительно-восстановительный медиатор

ТМФД,

использованный в измерениях Уилсона и Дат-

тона, свободно взаимодействует в мембранах митохонд-

рий

лишь с цитохромом с, очень плохо взаимодействует

с цитохромом

и совсем не взаимодействует с цитохромами

а и а

(см. [52]). Будем считать, что медиатор, обеспечи-

вающий связь

между

ОВ процессами в среде и ОВ реак-

циями

переносчиков ЦЭТ митохондрий, взаимодействует

лишь с цитохромом с и собственный электронный транс-

порт в ЦЭТ пренебрежимо мал (в опытах Уилсона и Дат-

тона были применены ингибиторы). Ниже приведена схема

*) Строго говоря, даже в этом случае суммарной энергии (около

0,55 эв) слегка не хватит для синтеза одной молекулы АТФ (пример-

но

,0,63 эв).

272

ТРАНСФОРМАЦИЯ

ЭНЕРГИИ

КЛЕТКЕ

[ГЛ. 8

соответствующего участка ЦЭТ:

Г(медиатор)

Если

между

цито хромом с и цитохромами Ь

и а

имеется

хотя бы по одному пункту сопряжения, то отношения

концентраций

окисленных и восстановленных форм этих

цитохромов при данном ОВП среды не являются одно-

значными функциями их стандартных ОВП. Пусть

между

электронным переносом через пункт сопряжения и син-

тезом АТФ устанавливается равновесие (при стехиомет-

рическом отношении два электрона на одну молекулу

АТФ);

тогда

для пунктов сопряжения II и III должны

удовлетворяться уравнения

[6р [Т

МФД

воост

р [АТФ]

[Ь

восстр

[ТМф

док

ИСЛ]21АДф] [ф1

' К •& )

КНТМФДНАТФ1

Ш -

[й

окисл

[ТМ

фдво

стр

[АДф] [фн)

• ( • )

Измеряемые отношения

[аГ

исл

М«!°

сст

]

[&™]/[b?°

CCT

]

бу-

дут для сопряженных митохондрий меняться с добавкой

АТФ согласно уравнениям

(8.29)

и (8.30), а не в зависи-

мости от изменения состояния и стандартных ОВП пере-

носчиков.

Действительно, подобрав медиаторы, непосред-

ственно реагирующие с цитохромом Ь (витамин К

и 2,6-

дихлорфенолиндофенол), Кэзуэлл показал, что измеряе-

мый стандартный потенциал цйтохрома Ь в митохондриях

равен +75 мв и не меняется при энергизации под дейст-

вием АТФ и при добавке разобщителей. Таким образом,

в энергизованных митохондриях не

существует

особой

высокопотенциальной равновесной для данного состояния

митохондриальной мембраны формы цйтохрома Ъ. По су-

ществу, дело сводится к

следующему.

Если с помощью

медиатора, непосредственно реагирующего с переносчи-

ком,

измеряется отношение концентраций окисленной и

восстановленной форм переносчика при данном ОВП сре-

ды, то оно равно отношению скоростей восстановления и

S 8.4] МЕМБРАННОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ: ТЕРМОДИНАМИКА 273

окисления

переносчика и

соответствует

истинному окис-

лительно-восстановительному равновесию. В

случае

ме-

диатора, непосредственно реагирующего с

другим

пере-

носчиком и отделенного от интересующего нас перенос-

чика пунктом сопряжения, скорость восстановления или

окисления

будет

лимитироваться медленным процессом

синтеза или гидролиза макроэрга. Поэтому,

хотя

измеря-

емое отношение концентраций и равно отношению ско-

ростей восстановления и окисления, оно не

соответствует

истинному окислительно-восстановительному равновесию

переносчика.

Следует

сделать

еще одно замечание. Отношение кон-

центраций окисленных и восстановленных форм перенос-

чиков измеряется в этих экспериментах спектрофотомет-

рически, т. е. определяется в основном окислительно-

восстановительное состояние простетической группы.

Однако, как мы видели в гл. 5, окисление и восстанов-

ление цитохромов может сопровождаться значительными

конформационными

превращениями, идущими, как пра-

вило, медленнее изменений простетической группы. Та-

ким

образом, измеряемые отношения концентраций

могут

не соответствовать отношению равновесных, отрелакси-

ровавпшх окисленных и восстановленных форм. Мы уви-

дим ниже (см. §8.6), что при таком способе измерения

фактором, определяющим изменение окислительно-вос-

становительного состояния переносчика при энергизации

мембраны (и, следовательно, измеряемый скачок

«сво-

бодной энергии»), может стать именно скорость конфор-

мационного превращения. Лишь при бесконечно медлен-

ном

превращении измеряемые величины

будут

строго со-

ответствовать энергии, освобождаемой при электронном

переносе и доступной для использования в синтезе АТФ.

Во

всех

других

случаях

должны получаться заниженные

значения.

Собственно говоря, измеряемые обычными ме-

тодами значения стандартных ОВП переносчиков в ЦЭТ

либо не являются стандартными ОВП в строгом смысле

этого слова, а их изменения при энергизации

всегда

мень-

ше истинных изменений энергии системы, либо являют-

ся

равновесными (при измерениях методом Кэзуэлла), но

их'разность для соседних переносчиков не

соответствует

истинным изменениям энергии при электронном переносе

в кинетически неравновесной сопряженной мембране.

274 ТРАНСФОРМАЦИЯ

ЭНЕРГИИ

В КЛЕТКЕ 1ГЛ. 8

В последние годы все возрастает количество работ,

посвященных изучению фотофосфорилирования в фото-

синтезирующих системах, но до сих пор пункты сопря-

жения в ЦЭТ хлоропластов и хроматофоров точно не ус-

тановлены. По-видимому, можно считать доказанным,

что фотофосфорилирование является по

существу

темно-

вым процессом, сопряженным с процессами электронного

транспорта

между

фиксированными переносчиками в ЦЭТ

хроматофоров и хлоропластов (см. § 7.3). Правда, Жолио

Кок [53], измерившие значение темновой константы

равновесия для процесса электронного переноса

между

активными центрами фотосистем I и II в хлоропластах

зеленых растений и в хлорелле и установившие малость

этой константы и ее независимость от присутствия раз-

общителей и АТФ, заключили, что электронный перенос

между

двумя фотосистемами не сопряжен с фосфорилиро-

ванием, которое, вероятно, каким-то образом обеспечи-

вается энергетически непосредственно за счет поглощае-

мого светового кванта. Мы видели уже, что так называе-

мые равновесные термодинамические характеристики,

полученные при изучении фиксированных в мембране цент-

ров и переносчиков, обычно не имеют отношения к реаль-

но

осуществляющемуся процессу. Общее рассмотрение

вопроса о числе и характере пунктов сопряжения при

нециклическом электронном транспорте можно найти

в обзоре [54]. Еще в 1965 г. Аврон и Чане [55] убедительно

показали, что по крайней мере один пункт сопряжения

находится в ЦЭТ

между

двумя фотосистемами в хлоро-

пластах и локализован до цитохрома /. Интересные ре-

зультаты были опубликованы Рэкером с сотрудниками

в 1970 г. [56].

Авторы

получили субхлоропластные час-

тицы, способные фотовосстанавливать НАДФ и осущест-

влять циклическое фотофосфорилирование. Они показали,

что в этих частицах (содержащих главным образом фото-

систему I) циклического транспорта электронов недоста-

точно для циклического фотофосфорилирования, а необ-

ходимо вводить некоторое количество электронов извне,

специально добавляя экзогенный восстановитель. Воз-

можно, что в исходных хлоропластах функцию внешнего

электронного донора для циклического фосфорилирова-

ния

выполняет фотосистема II. Действительно, уже дав-

но

было показано [57], что ингибитор дихлорметилмоче-

§8.4] МЕМБРАННОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ: ТЕРМОДИНАМИКА 275

вина, блокирующий перенос электронов

между

двумя

фотосистемами, ингибирует также циклическое фотофос-

форилирование. Во всяком случае, результаты работы

[56] можно интерпретировать как свидетельство в пользу

необходимости параллельного переноса

двух

электронов

для образования первичного химического макроэрга (под-

робнее см. ниже, в § 8.5). Здесь важно отметить, что ав-

торы [56] приходят к выводу о том, что пункт сопряжения

м8

-0,6

-о,ч

-0,2

0,2

0,4

0,6

0,8

ФС

Н,0

~~**пх

цит

559

(вый

• АТФ

'ПЦ,

Фд

НАДФ-Н

ФС

Р700*

Рис» 8.2. Локализация фосфорилирования в нециклической ЦЭТ

хлоропластов (по [58]).

в циклическом фотофосфорилировании локализован меж-

ду Р 700 и цитохромом Ь

(замыкающим в их

схеме

цикл в

обход

цитохрома / и пластоцианина (ПЦ) и непосредствен-

но

восстанавливающим (Р 700)

). При нециклическом фо-

тофосфорилировании пункт сопряжения локализован меж-

ду пластохиноном (ПХ) и цитохромом /. К этому же вы-

воду

пришли недавно Боме и Крамер [58], исследовавшие

кинетику электронного транспорта и фосфорилирования

в хлоропластах. По их данным, цитохром / и ПХ распо-

ложены рядом в нециклической ЦЭТ (рис. 8.2) и в сопря-

женных хлоропластах именно перенос электрона от пла-

стохинона к цитохрому / становится лимитирующей ста-

дией. Они считают, что это единственный пункт сопряжения

на

всем пути нециклического электронного транспор-

та. Разница стандартных значений ОВП ПХ и цитохрома /

составляет около 250 мв, и при прохождении одного

276 ТРАНСФОРМАЦИЯ

ЭНЕРГИИ

В КЛЕТКЕ [ГЛ. 8

или

даже

двух

электронов через пункт сопряжения ее не

хватает

для синтеза хотя бы одной молекулы АТФ. При

нециклическом фосфорилировании число синтезируемых

молекул АТФ на каждую пару электронов, прошедшую

от воды до НАДФ, приближается к

двум

[59], и поэтому,

по-видимому, либо

существует

по крайней мере еще один

пункт сопряжения, либо истинное падение энергии од-

ного электрона при переходе его от ПХ к цитохрому /

близко к 0,63 эв и не соответствует разности равновесных

значений ОВП.

Исследуя электронный транспорт и фотофосфорили-

рование в хлоропластах с разными электронными акцеп-

торами, Саха и др. [60] пришли к выводу, что в нормаль-

но

функционирующих хлоропластах отношение Р : 2е

равно

двум

(см. также [61]) и имеется два отдельных пунк-

та сопряжения, один из которых, по всей вероятности,

локализован

между

водой и активным центром фотосис-

темы II. Такое же предположение еще раньше было вы-

сказано в работе [62]. Поскольку падение стандартных

значений ОВП

между

водой и активным центром фотосис-

темы II, вероятно, не превышает 100 мв, термодинамика

процесса остается в рамках классических представлений

непонятной.

Таким образом, термодинамические аспекты проблем

фотофосфорилирования в хлоропластах и окислительного

фосфорилирования в митохондриях весьма близки. По-

видимому, и в том и в

другом

случае

близки также детали

обоих механизмов (см., например, [63]).

В данном параграфе речь шла только об эксперимен-

тальных данных, относящихся к энергетике суммарного

процесса мембранного фосфорилирования. Основной ре-

зультат

кинетических исследований, заключающийся

том, что сопряжение замедляет электронный перенос

пункте сопряжения, был достаточно подробно изложен

в § 7.3. Естественно, многолетнее изучение мембранного

фосфорилирования в целом ряде лабораторий разных

стран привело к установлению множества

других

экспери-

ментальных фактов и эмпирических закономерностей,

относящихся, например, к появлению разных значений

рН

по обе стороны мембраны, трансмембранному потен-

циалу, действию различных разобщителей и ингибиторов

т. д. Нет никакой возможности излагать эти данные

%8.5l

МЕМБРАННОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ: ТЕОРИЯ 277

сколько-нибудь подробно. Мы

будем

касаться их в сле-

дующем

параграфе лишь постольку, поскольку они

будут

необходимы при рассмотрении отдельных теоретических

концепций

мембранного фосфорилирования.

§ 8.5. МЕМБРАННОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ:

СУЩЕСТВУЮЩИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ

Все распространенные сейчас точки зрения на механизм

мембранного фосфорилирования, точнее, на природу пер-

вичного процесса консервации энергии можно разбить

на

три основные группы: химическая, хемиосмотическая

конформационная концепции [37]. Как уже было ска-

зано выше, общей их чертой является допущение

сущест-

вования первичного макроэрга, не идентичного АТФ.

Они

отличаются

друг

от

друга

представлениями о приро-

де первичного макроэрга и о механизме первичного про-

цесса консервации энергии.

В ее современном виде химическая концепция была

сформулирована Слейтером в 1953 г. [64]. В основе ее

лежит предположение о том, что первичный акт консер-

вации энергии, т. е. процесс преобразования энергии,

освобождающейся при электронном переносе, в долго-

живущую

форму, происходит в молекуле переносчика-

трансформатора и заключается в образовании макроэр-

гического соединения, содержащего один из продуктов

окислительно-восстановительной реакции и низкомоле-

кулярный лиганд (обозначаемый в дальнейшем I):

АН

+ В + I ^ А ~ I + ВН

(8.31)

Затем с помощью фермента АТФ-азы первичный макроэрг

обеспечивает синтез АТФ:

А ~ I + АДФ + Ф

^ А + I + АТФ.

(8.32)

В сущности, химическая концепция мембранного фосфо-

рилирования ничем не отличается от объяснения

субстрат-

ного фосфорилирования, за исключением того, что окис-

лительно-восстановительный процесс сводится к актам

одноэлектронного переноса

между

соседними компонен-

тами ЦЭТ, фиксированными в мембране. Физический

механизм реакции

(8.31)

остается неизвестным. Для пред-

отвращения практически полной диссипации энергии

278 ТРАНСФОРМАЦИЯ ЭНЕРГИИ

КЛЕТКЕ

ЕГЛ. 8

электронный перенос от А к В и образование макроэрги-

ческой связи А ~ I должны осуществляться в один эле-

ментарный акт, что, как было указано в § 8.3, весьма

трудно

себе

представить в рамках классических идей.

Легко видеть, что химическая концепция мембранного

фосфорилирования является естественным распростра-

нением взглядов на субстратное фосфорилирование, из-

ложенных в § 8.3.

Конформационная

концепция основана на многочис-

ленных экспериментальных данных о конформационных

изменениях отдельных белков-переносчиков при окисли-

тельно-восстановительных процессах, а также мембраны

в целом при функционировании ЦЭТ. Согласно этой

концепции

процесс образования химического макроэрга

можно представить

себе

как обращение процесса конфор-

мационного изменения миозина при гидролизе АТФ. Пер-

вичным актом в консервации энергии считается индуци-

рованное электронным переносом изменение конформации

дыхательного

переносчика (флавопротеина, железосерного

белка или цитохрома) [65].

Детальное обсуждение конформационной гипотезы

приведено в

работах

Грина с сотрудниками [66, 67].

Общую

схему

синтеза АТФ можно представить в

следую-

щем виде:

Электронный перенос ^t Конформационно

измененное энер-

гизованное состояние ^ АТФ.

(8.33)

В работе [6] речь

идет

о конформационно измененном

энергизованном состоянии всей мембраны. Предпола-

гается, что мембрана может находиться либо в энергизо-

ванном,

либо в неэнергизованном состоянии. Эти состоя-

ния

распространяются по мембране (от одного белково-

липидного комплекса ЦЭТ к

другому)

в виде своеобразной

волны. По-видимому, авторы цитированных выше работ

полагают, что первичным актом является энергизация

(индуцируемое конформационное изменение) макромоле-

кулярных переносчиков. В этом смысле конформационную

концепцию

можно считать одним из вариантов химической,

с тем отличием, что первичный химический макроэрг,

А <~ I, заменен на энергизованное, конформационно

измененное состояние переносчика А.

Вместе

с тем энер-

% 8.5] МЕМБРАННОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ: ТЕОРИЯ 279

гизованное состояние всей мембраны, в котором может

храниться энергия, освобождающаяся при функциони-

ровании"*ЦЭТ,

сближает конформационную концепцию

с хемиосмотической.

Первый

вариант хемиосмотической гипотезы был пред-

ложен Митчеллом в 1961 г. 168]. В основе этой гипотезы

лежало предположение о том, что в определенных

участ-

ках ЦЭТ электронный перенос происходит поперек мем-

браны,

что сопровождается возникновением АрН

между

внешней

и внутренней ее поверхностями. Так, окисление

субстрата

на внешней поверхности:

^S + 2e + 2Н

(8.34)

приводит к накоплению протонов во внешней области, а

восстановление конечного акцептора — молекулярного

кислорода — происходит на внутренней поверхности, где

локализована цитохромоксидаза и возникает дефицит

протонов.

Таким образом,

между

двумя

поверхностями

мембраны образуется разность потенциалов, или мембран-

ный

потенциал. Собственно^говоря, мембраны с разде-

ленными

зарядами, обеспечивающими мембранный потен-

циал,

и являются первичным макроэргом. Адсорбирован-

ные

на поверхности протоны

могут

заменяться другими

катионами

с сохранением заряда мембраны и увеличением

кислотности внешней среды. Электронный перенос

будет

поэтому приводить к

двум

эффектам: появлению мем-

бранного потенциала и различию в величинах рН по обе

стороны мембраны. Наличие мембранного потенциала не-

посредственно приводит к синтезу АТФ, например, по

механизму, обратному активному переносу ионов!через мем-

брану под действием АТФ (кстати, физические основы этого

механизма далеко не

ясны).

Действительно, было показано,

что при обращении движения ионовШа

и К

через мемб-

рану NaK-активируемая АТФ-аза начинает катализиро-

вать синтез аденозинтрифосфата 169].

В первоначальной

схеме

Митчелла 168] фосфорилиро-

вание осуществлялось непосредственно под действием

возникающего при электронном переносе градиента рН.

Впоследствии Митчелл сильно модифицировал свою гипо-

тезу,

включив ряд промежуточных стадий [70]. Принцип

построения

схемы

хемиосмотического сопряжения ясен

из

рис. 8.3. Функционирование ЦЭТ приводит к

эффек-

280

ТРАНСФОРМАЦИЯ ЭНЕРГИИ В КЛЕТКЕ [ГЛ. 8

тивному переносу протонов через мембрану, обусловли-

ваемому в конечном счете различием ОВП переносчиков

ЦЭТ.

В мембране имеются

«интермедиа™

сопряжения»

Внешняя

область

Мембрана

Внутренняя

область

Ферменты сопряжения

Рис.

8.3. Схема хемиосмотического сопряжения.

неизвестной природы ХН и YOH, которые способны к

ионизации

и к реакции конденсации:

ХН ^ Х- + Н

(8.35)

YOH ^ YCT + Н\

(8.36)

YOH + ХН ^ X - Y + Н

О.

(8.37)

Повышение электрохимического потенциала водород-

ных ионов на внешней стороне мембраны за счет увели-

чения

их концентрации и мембранного потенциала при-

водит к смещению вправо равновесия реакции

2Н

+ Х- + YO- ^ Н

О + X - Y.

(8.38)

Нейтральная молекула X — Y мигрирует через мембрану

(не

обязательно одна и та же молекула проходит всю

толщину мембраны). Контактируя с внутренней областью,

где электрохимический потенциал протонов низок, а кон-

центрации ионных форм Х~ и YO~ малы, молекула X — Y

становится лабильной, а связь

между

X и Y — макро-

зргической (X ~ Y). Равновесие

(8.38)

смещается влево,

а за счет гидролиза X ~ Y синтезируется АТФ и обра-