Блюменфельд Л.А. Проблемы биологической физики

Подождите немного. Документ загружается.

8.3]

СУБСТРАТНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ

261

фосфоглицераткиназой:

II Е

Р-О

С—С-СН

ОРО

АДФ

II !

-t

НО-С—С—СН

ОРО

АТФ.

(8.23)

он

Естественно, алгебраическая сумма реакций (8.19),

(8.20),

(8.22)

(8.23)

соответствует процессу (8.18)1

Собственно говоря, макроэргическая фосфорноэфирная

связь

уже

появилась после образования кинетически

ус-

тойчивого

(в

отсутствие

)

1,3-дифосфоглицерата.

По-

следняя стадия процесса, реакция (8.23), представляет

собой реакцию переноса этой связи

на АДФ. Мы

ограни-

чимся поэтому рассмотрением процесса

до

стадии

(8.22)

включительно

*).

Выше

уже

было сказано,

что в

отсут-

ствие неорганического фосфата фермент

ведет

себя

как

реагент,

а не как

катализатор. Комплекс

с НАД вза-

имодействует

субстратом, образуя ацилфермент

НАД-Н

(реакция

(8.20)). Медленно идущий гидролиз ацилфермен-

та представляет собой фактически реакцию, разобщающую

процессы окисления

фосфорилирования глицеральде-

гид-3-фосфата.

Из

сказанного

ясно,

что по

существу

ацил-

фермент является макроэргическим соединением. Ацили-

рование

водной

фазе термодинамически невыгодно,

а гидролиз ацилфермента приводит

понижению свобод-

ной

энергии системы, причем избыток

ее

рассеивается

в виде тепла.

Это

означает,

что

образование

S ~

С-связи

ходе

реакции

(8.20)

(в

отсутствие фосфата) энергети-

чески невыгодно

происходит только потому,что

однов-

ременно

реализуется другой, энергетически выгодный

процесс

—

окисление

НАД.

Слово «одновременно»

под-

черкнуто

не

случайно. Ниже

мы

постараемся уточнить,

Это не

означает,

что

физические механизмы замены одной

макроэргической связи

на

другую

(8.23)

ясны. Просто

при

их

рассмотрении

не

возникает новых проблем, которые нельзя было

бы

проанализировать

при

обсуждении предшествующих стадий.

262 ТРАНСФОРМАЦИЯ

ЭНЕРГИИ

КЛЕТКЕ

[ГЛ. 8

какой

смысл

следует

вкладывать

этом

случае

понятие

одновременности.

Детальный механизм фосфорилирования субстрата

при

взаимодействии ацилфермента

неорганическим

фос-

фатом (реакция (8.22))

не

вполне ясен. Известно

(см. [2]),

что фосфат также образует комплекс

ферментом

Последний представляет собой

«двуглавый

фермент»

двумя активными центрами; один

из них

ответствен

за

перенос фосфата,

другой

— за

ацилирование. Весьма

вероятно,

что

взаимодействие субстрата

ферментом

с фосфатом осуществляется

один

акт и в

присутствии

фосфата ацилфермент

при

нормальном функционировании

не

существует

качестве кинетически независимой

еди-

ницы.

Каким

бы ни был

конкретный механизм,

ясно,

что

образование фосфорноэфирной связи

положении

1 (см.

(8.22))

водной среде энергетически невыгодно

и оно мо-

жет произойти либо

за

счет

одновременно

идущего

тер-

модинамически выгодного восстановления

НАД,

либо

результате

фосфорилирования

уже

образованного

кине-

тически стабилизированного макроэрга (ацилфермента).

Во

всех

случаях одной

из

стадий процесса должен быть

элементарный

акт, в

котором

одновременно

осуществля-

ется термодинамически выгодный (здесь восстановление

НАД)

термодинамически невыгодный процессы (здесь

ацилирование

или

фосфорилирование глицеральдегид-

3-фосфата).

данном

случае

«одновременно» означает,

что

промежуток времени

между

обоими элементарными

про-

цессами настолько

мал, что

энергия, выделяемая

ходе

экзэргонического процесса,

не

успевает диссипировать

в виде тепла. Тогда можно

утверждать,

что оба

процесса

представляют собой,

сущности, один элементарный

акт

(или

— в

рамках теории абсолютных скоростей реакции

—

имеется один активированный комплекс).

случае

обычных реакций низкомолекулярных соединений речь

идет

временах колебательной

вращательной релак-

сации,

т. е. о

временах порядка

10~

—10~

сек.

Если

эти

временные критерии выбраны правильно,

то

весьма

маловероятно, чтобы сложный процесс,

котором

при-

нимают участие

три

низкомолекулярных 'соединения

по

крайней мере

две

различные группы

двух

активных

центрах макромолекулы белка, действительно

мог

прои-

зойти

один

акт.

8.3] СУБСТРАТНОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ 263

Проблема физического механизма энергетического со-

пряжения

химических реакций и является центральной

проблемой биоэнергетики. Ниже

будет

рассмотрен один

из

возможных путей ее решения.

В гл. 6, посвященной физике ферментативного ката-

лиза, была изложена новая концепция элементарного

акта в ферментативных каталитических реакциях. Со-

гласно этой концепции присоединение

субстрата

к ак-

тивному центру фермента приводит к появлению нового

кинетически доступного конформационного состояния

макромолекулы.

Исходная конформация становится напряженной и

медленно релаксирует к новому состоянию. В

ходе

ее

релаксации и реализуется катализируемое химическое

превращение. Это медленное конформационное изменение

является, по

существу,

механическим движением. Если

химическое превращение

субстрата

сопровождается зна-

чительным понижением энергии (как, например, при про-

цессе окисления глицеральдегид-3-фосфата и восстановле-

ния

НАД), то можно сказать, что освобождение энергии

в основном происходит в

ходе

этой медленной конформа-

ционной

релаксации. После присоединения

субстрата

ферменту первичным макроэргом становится неизменная

исходная конформация макромолекулярного комплекса,

ставшая механически напряженной. Время, в течение

которого эту энергию можно использовать для прове-

дения эндэргонического процесса, т. е. длительность

элементарного акта, сравнимо со временем релаксации

выделенных механических степеней свободы,

возбуждае-

мых присоединением

субстрата

(10~

—10~*

сек).

Если в

ходе

конформационного изменения, затрагива-

ющего весь макромолекулярный комплекс, изменяется

распределение электронной плотности в активном центре,

ведущем

эндэргонический процесс, причем это изменение

облегчает

осуществление эндэргонической реакции, то

оба процесса, экзэргонический и эндэргонический, про-

текают в один акт,

хотя

могут

быть отделены

друг

от

друга

во времени десятками и сотнями миллисекунд.

Передача энергии от одного процесса к

другому

проис-

ходит

путем

возбуждения медленно релаксирующих

'механических степеней свободы макромолекулярного

комплекса.

264 ТРАНСФОРМАЦИЯ ЭНЕРГИИ В КЛЕТКЕ [ГЛ. 8

8.4.

МЕМБРАННОЕ

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ:

ТЕРМОДИНАМИЧЕСКИЕ

АСПЕКТЫ

Наиболее важными примерами мембранного фосфори-

лирования

являются окислительное фосфорилирование,

происходящее во внутренних мембранах митохондрий,

фотосинтетическое фосфорилирование (фотофосфорили-

рование),

осуществляющееся в мембранах хлоропластов

высших растений и водорослей и в хроматофорах фото-

синтезирующих бактерий. Мы начнем с рассмотрения ос-

новных экспериментальных данных, относящихся к окис-

лительному фосфорилированшо в митохондриях. Как и

всегда, мы ограничимся изложением лишь тех данных,

которые

будут

необходимы в дальнейшем для понимания

существа обсуждаемых физических проблем. Детальное

описание

строения митохондрий можно найти во многих

монографиях и обзорах (см., например, [2, 3, 25]).

Вероятно, открытие окислительного фосфорилирова-

ния

следует

отнести к 1930 г., когда Энгельгардт [26, 27]

установил связь

между

дыханием и фосфорным обменом

эритроцитах. Калькар [28, 29] получил аналогичные

результаты на бесклеточных препаратах, а Белицер и

Цыбакова

[30] впервые установили стехиометрические

соотношения

между

дыханием и фосфорилированием. Эти

важнейшие исследования были продолжены Очоа [31, 32]

на

бесклеточных препаратах. Основной

результат

про-

веденных работ состоит в установлении того, что окисле-

ние

одной молекулы субстрата (т. е. образование одной

молекулы воды в

результате

реакции 2Н -f

/^O

-*• Н

О)

сопровождается образованием более чем одной молекулы

АТФ. Мы знаем теперь, что если субстратом^ЦЭТ (см.

7.3) служит НАД-Н, то в неповрежденных «сопряжен-

ных»

митохондриях на каждый атом поглощенного кисло-

рода (т. е. на каждую пару электронов, прошедшую через

ЦЭТ)

приходится образование

трех

молекул АТФ (други-

ми

словами, отношение Р/О = 3). Если субстратом ЦЭТ

служит сукцинат, то Р/О = 2, а в

случае

субстратного

фосфорилирования

соответствующее отношение равно

единице.

Это означает, что прохождение электронов вдоль

ЦЭТ

должно сопровождаться фосфорилированием АДФ в

нескольких местах ЦЭТ (в так называемых пунктах со-

пряжения)-.

I 8.4] МЕМБРАННОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ: ТЕРМОДИНАМИКА 265

Ферменты Ц9Т, ответственные за перенос электронов,

фосфорилирующие ферменты, необходимые для синтеза

АТФ из АДФ и фосфата, объединены в митохондриальных

мембранах; они

входят

в сложную липопротеиновую

структуру

и разделяются лишь с большим трудом.

Суммарный процесс, осуществляющийся в сопряжен-

ной

ЦЭТ при окислении^НАД-Н, можно записать в виде

НАД-Н + ЗФн + ЗАДф'+ V,O

+ H+ +

-> НАД+ + ЗАТФ + Н

О.

(8.24)

достаточно большой степенью уверенности можно

предположить, что фосфорилирование АДФ реализуется

с помощью особого фермента — АТФ-азы, непосредствен-

но

не входящего в ЦЭТ, но локализованного в мембране

поблизости от полиферментной системы ЦЭТ. Исследова-

нию

митохондриальной АТФ-азы и белковых компонент,

необходимых для ее связи с компонентами ЦЭТ (так на-

зываемых сопрягающих факторов), посвящено множество

работ. Однако большинство химических проблем, отно-

сящихся к митохондриальной АТФ-азе, остается нерешен-

ным

до настоящего времени. Существуют разные точки

зрения

даже

по вопросу о том, имеются ли разные АТФ-

азы (для каждого пункта сопряжения своя) или один и

тот же фермент обслуживает все пункты сопряжения.

По-видимому, более правдоподобно последнее предполо-

жение (см. [2]).

Можно

различать пять состояний ЦЭТ митохондрий

[33—36]. В состоянии 1, которое реализуется в

отсутст-

вие добавляемых извне субстратов дыхания и фосфори-

лирования,

переносчики ЦЭТ частично восстановлены.

Добавление АДФ (субстрата фосфорилирования) пере-

водит митохондрии в состояние 2: все переносчики ста-

новятся

окисленными, а скорость дыхания лимитируется

только Количеством субстрата окисления. Если добавить

теперь

субстрат

окисления, то митохондрии переходят в

активное состояние 3, в котором переносчики снова ста-

новятся

частично восстановленными, а скорость электрон-

ного транспорта определяется скоростью поступления

субстратов через внешнюю мембрану митохондрий и ак-

тивностью фосфорилирующих ферментов. Когда значи-

тельная часть добавленной АДФ израсходуется (превра-

тится в АТФ) или когда специально введен большой из-

266 ТРАНСФОРМАЦИЯ

ЭНЕРГИИ

В КЛЕТКЕ [ГЛ. 8

быток АТФ, возникает состояние

дыхательного

контроля,

или состояние 4, в котором дыхание снова замедляется и

его скорость лимитируется отношением [АДФ]/[АТФ].

Изменяя

это отношение (добавляя, например, АДФ),

можно снова перевести митохондрии из состояния 4 в ак-

тивное состояние 3. В

отсутствие

митохондрии нахо-

дятся в состоянии 5, т. е. в состоянии анаэробиоза, в ко-

тором все переносчики ЦЭТ восстановлены.

Эта предложенная Чансом классификация оказалась

весьма полезной.

Умело

используя данные по влиянию

перехода

от состояния 4 к состоянию 3 на степень окисле-

ния

отдельных переносчиков, по действию ингибиторов

электронного транспорта и разобщителей фосфорилиро-

вания,

Чане выдвинул гипотезу о локализации отдельных

пунктов сопряжения в ЦЭТ, которая мало изменилась

вплоть до настоящего времени. Вопрос о пунктах сопря-

жения

будет

рассмотрен несколько ниже.

Учитывая сказанное выше, представляется очевидным,

что основной биофизической проблемой, возникающей при

рассмотрении процесса окислительного фосфорилирова-

ния,

является вопрос о механизме образования первич-

ного макроэрга, который затем с помощью АТФ-азы

дает

АТФ. В этом смысле проблема отличается от проблемы

субстратного фосфорилирования только тем, что химиче-

ской

реакцией, идущей с понижением энергии, которая

используется для создания первичного макроэрга, ока-

зывается в данном

случае

перенос электрона

между

фик-

сированными соседними компонентами ЦЭТ.

Прежде всего рассмотрим термодинамический аспект

проблемы. Из изложенного выше

следует,

что суммарный

процесс (8.24), идущий в сопряженных митохондриях,

можно разделить на две стадии, причем экзэргоническая

стадия

НАД-Н + Н+ +

;=> НАД+ + Н

(8.25)

осуществляется в

результате

переноса

двух

электронов

через ЦЭТ от НАД-Н на молекулярный кислород. Можно

считать, что исходные и конечные продукты стадии

(8.25)

равновесно распределены

между

средой и ЦЭТ, и по-

этому при рассмотрении суммарного процесса законно

применение формул равновесной термодинамики. Изме-

нение

свободной энергии AF на этой стадии равно раз-

§8.4] МЕМБРАННОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ: ТЕРМОДИНАМИКА 267

ности

окислительно-восстановительных потенциалов пар

НАД-Н/НАД и V, О

/Н

О и в клетках ([НАД-Н]/[НАД

] ж

ро

0,2 атм, рН х 7) составляет [37]

AF ж —51

ккал/моль.

(8.26)

Эта энергия может использоваться для осуществления

различных эндэргонических процессов, в том числе фос-

форилирования,

причем на каждый моль синтезируемой

АТФ можно потратить 51/3 =. 17

ккал/молъ.

Мураока

Слейтер [38] показали, что в состоянии дыхательного

контроля

(4 по классификации Чанса) после достижения

определенного значения отношения [АТФ]/[АДФ][Ф

]

реализуется термодинамическое равновесие

между

сум-

марным

окислительно-восстановительным процессом и

фосфорилированием

в митохондриях. Поэтому, измерив

концентрации

АТФ, АДФ и Ф

в среде в состоянии 4,

можно определить свободную энергию, необходимую

для синтеза одного моля АТФ:

AF' = MUu + 1,36 lg

pgjgg-j-,

(8.27)

где А^набл — стандартная свободная энергия фосфорили-

рования

АДФ; согласно [7] при 25 С и физиоло-

гических значениях рН А/^набл ~ 8,0

ккал/молъ.

Исполь-

зуя данные [39, 40], по концентрации АТФ, АДФ и Ф

среде в состоянии 4, получают

AF' ж 8,0 + 6,5 = 14,5

ккал/молъ.

(8.28)

Таким

образом, из доступных 17

ккал

на синтез одного

моля

АТФ непосредственно идет примерно 14,5^

ккал

в состоянии дыхательного контроля суммарная реакция

окислительного фосфорилирования

(8.24)

протекает прак-

тически обратимо.

Вспомним теперь (см. гл. 7), что электронный перенос

ЦЭТ во

всех

ее участках происходит, по-видимому, по

одноэлектронному механизму. Поэтому, для того чтобы

понижение

энергии электронов при прохождении через

пункт сопряжения могло обеспечивать в конечном счете

синтез молекулы АТФ, необходимо падение окислитель-

но-восстановительного потенциала в этом пункте либо не

менее чем на 630 мв (если к синтезу одной молекулы АТФ

268 ТРАНСФОРМАЦИЯ

ЭНЕРГИИ

В КЛЕТКЕ [ГЛ. 8

приводит один акт одноэлектронного переноса), либо

не менее чем на 315 мв (если к синтезу одной молекулы

АТФ приводят два акта одноэлектронного переноса) *).

В последнем

случае

должен существовать механизм на-

копления

энергии, освобождающейся в

результате

двух

последовательных актов электронного переноса, без ее

диссипации.

Локализацию пунктов сопряжения в ЦЭТ, согласно

современным представлениям, иллюстрирует рис. 8.1 [41].

Пункт сопряжения 1 локализован

между

группой пере-

носчиков,

связанных с флавопротеином, дегидрирующим

НАД-Н, и убихиноном УХ. Пункт сопряжения II лока-

лизован вблизи цитохрома 6

(см. § 7.3), а пункт III свя-

зан

с комплексом цитохромов а

, а и ионов меди (см. так-

же [42]).

Разность равновесных значений окислительно-восста-

новительных потенциалов любой пары соседних перенос-

чиков ЦЭТ значительно меньше 630 и

даже

315 мв (см.,

например,

[43]). Этот энергетический парадокс представ-

ляет собой, вероятно, одну из центральных проблем мемб-

ранного фосфорилирования.

Здесь прежде всего

следует

выяснить, в какой степени

равновесные значения окислительно-восстановительных

потенциалов (ОВП) изолированных переносчиков

могут

использоваться при анализе энергетических характеристик

ЦЭТ.

Действительно, вполне разумно ^было бы предпо-

ложить, что ОВП встроенных в мембрану переносчиков

ЦЭТ

достаточно сильно отличаются от соответствующих

значений изолированных переносчиков. Более того, можно

предположить, что ОВП переносчиков-трансформаторов**)

могут

существенно зависеть от состояния мембраны, в

частности, сильно меняться при ее энергизации. Вместе

с тем допустимо и следующее предположение: в такой

хорошо организованной структуре, как мембранные ЦЭТ,

содержащие переносчики, энергия, высвобождаемая^при

При

этом предполагается,

что

переход

от

первичного макро-

эрга

к АТФ не

сопровождается диссипацией энергии.

противном

случае

требуемые

разности окислительно-восстановительных потен-

циалов должны быть

еще

больше.

**)

То

есть переносчиков, окислительно-восстановительные прев-

ращения которых непосредственно приводят

образованию первич-

ного макроэрга.

{ 8.4l МЕМБРАННОЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ: ТЕРМОДИНАМИКА 269

электронном переносе, весьма значительно отличается от

разности ОВП соседних переносчиков. Медленность кон-

формационной

релаксации переносчиков приводит к то-

му, что

большую

часть времени своего функционирования

FeS

Группа I Группа II

Пункт I Пункт II i Пункт III

Группа III

-400

800^

Рис.

8.1.

Локализация пунктов сопряжения

в ЦЭТ

митохондрий.

Индексом

«т»

отмечены переносчики-трансформаторы энергии.

они

находятся в

кинетически

неравновесном состоянии.

При

этом равновесные значения ОВП для переносчиков

в мембране

могут

оставаться почти такими же, как и у изо-

лированных переносчиков. Последнее

согласуется

с тем

обстоятельством, что электронные спектры поглощения

переносчиков в мембране и изолированных переносчиков

270 ТРАНСФОРМАЦИЯ^ЭНЕРГИИ В.КЛЕТКЕ [ГЛ.

сравнительно мало отличаются

друг

от

друга.

Для выбора

между

двумя

приведенными выше возможными решения-

ми

энергетического парадокса

следует

рассмотреть дан-

ные по измерениям ОВП отдельных переносчиков ЦЭТ

непосредственно в мембранах митохондрий. Такие изме-

рения

провели недавно Уилсон и Даттон [44, 45]. ОВП

среды устанавливали

путем

подбора буферных количеств

окислителя и восстановителя, а в качестве медиаторов

использовали N

,N,N'

,N '-тетраметил-и-фенилендиамин

(ТМФД),

феназинметасульфат (ФМС) или феназинэта-

сульфат

(ФЭС).

Отношение концентраций окисленных и

восстановленных форм переносчиков (цитохромов) опре-

деляли спектрофотометрически. Этим способом исследо-

вали пункты сопряжения II и III.

Удалось

обнаружить, что в пункте сопряжения II

две компоненты цитохрома Ъ (названные 6

и b,

) [46]

неодинаково

ведут

себя при энергизации или разобщении

митохондрий. Кинетические различия были обсуждены

ранее (см. § 7.3). В разобщенных или неэнергизованных

митохондриях измеренные описанным выше способом

ОВП цитохромов йк и Ь

равны соответственно +20 и

—35 мв, т. е. почти одинаковы. При энергизации добав-

кой

АТФ ОВП цитохрома Ь^ остается неизменным, а ОВП

компоненты Ь

повышается примерно на 275 мв, достигая

значения

+240 мв. На основании этих

результатов

было

высказано предположение о существовании

двух

форм

цитохрома Ь

: низкопотенциальной и высокопотенциаль-

ной,

в которую

переходит

первая форма при энергизации

митохондрий. Собственно, высокопотенциальная форма

цитохрома 6

и является, согласно этим представлениям,

первичным макроэргом пункта сопряжения II, и ее можно

обозначить 6

~. Изменение значения ОВП цитохрома 6

при

энергизации и

соответствует

тому

количеству

энер-

гии,

которое можно использовать для синтеза первичного

химического макроэрга (а затем АТФ) при переносе од-

ного электрона через пункт сопряжения II. В работе

[41] Чане предложил конкретный цикл превращения

цитохрома Ь

, в котором переносчик испытывает последо-

вательные переходы

между

всеми четырьмя возможными

формами (б*"

", b\

~ и

~). Из приведенных выше

численных данных

ясно,

что для синтеза АТФ в этом слу-

чае необходим либо параллельный, либо последователь-