Березовская В.А. Биохимия. Лабораторный практикум

Подождите немного. Документ загружается.

ГЛИКОПРОТЕИДЫ

1. ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить состав и строение гликопротеидов.

2. ЗАДАНИЕ

2.1. Выделить муцин из слюны.

2.2. Провести реакции, доказывающие присутствие углевод-

ного компонента в муцине.

2.3. Провести реакции, доказывающие присутствие белково-

го компонента в муцине.

2.4. Открыть углеводный компонент в яичном белке.

3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Гликопротеиды (глюкопротеиды) – это сложные белки, про-

стетической группой которых являются углеводы. Углеводный

компонент может содержать нейтральные сахара, аминосахара,

уроновые кислоты и некоторые другие соединения. У некоторых

гликопротеидов углеводная часть непрочно связана с белком

и легко от него отделяется. Простетические группы некоторых

гликопротеидов могут встречаться в тканях и в свободном со-

стоянии. К ним относятся мукополисахариды.

В состав мукополисахаридов помимо гексоз могут входить

гексозамины (глюкозамины, галактозамины), гексуроновые (ча-

ще всего глюкуроновая) кислоты, уксусная и серная кислоты

и другие вещества:

D-глюкозамин N-ацетил-глюкозамин глюкуроновая

кислота

В зависимости от состава различают кислые и нейтральные

мукополисахариды. К кислым относятся гиалуроновая, хондрои-

тинсерная кислоты и гепарин.

Молекула гиалуроновой кислоты построена из остатков глю-

куроновой кислоты и ацетилглюкозамина. Гиалуроновая кислота

входит в состав соединительной ткани, роговицы глаза, стекло-

видного тела, сердечных клапанов. Хондроитинсерная кислота

содержится в хрящевой и соединительной ткани, гепарин – в тка-

ни печени и легких.

В состав нейтральных мукополисахаридов входят нейтраль-

ные сахара (галактоза, манноза, L-фукоза), сиаловые кислоты.

Нейтральные мукополисахариды входят в состав слизистых сек-

ретов – слюны, желудочного сока, содержатся в плазме крови,

в гормонах и т. д.

Гликопротеиды, в состав которых входят мукополисахариды,

получили название мукопротеидов. К ним относятся муцины,

входящие в состав многих тканей и особенно в большом количе-

стве встречающиеся в хрящах, костной и соединительной ткани,

слюне и т. д. Гликопротеиды не растворимы в воде, хорошо рас-

творимы в щелочах и осаждаются при подкислении.

4. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

4.1. Выделение муцина из слюны.

В пробирку собирают 1–2 мл слюны. Затем по каплям (под

тягой!) приливают 10–20 мл концентрированной уксусной ки-

слоты. При этом выпадает осадок муцина. Жидкость осторожно

сливают из пробирки, а последнюю ее порцию вместе со сгуст-

ком муцина переносят на фильтр. Сгусток слегка подсушивают

фильтровальной бумагой и переносят в чашку Петри или на ча-

совое стекло.

4.2. Открытие углеводного компонента в муцине.

4.2.1. Реакция Молиша.

Реакция Молиша является качественной реакцией на пентозу.

Для ее проведения часть сгустка муцина переносят в пробирку,

добавляют к нему 1%-ный спиртовой раствор тимола в количестве,

приблизительно равном 1/3 объема муцина, и тщательно переме-

шивают. Затем осторожно, по стенке, прибавляют концентриро-

ванную серную кислоту в объеме, в 8–10 раз превышающем затра-

ченный объем тимола, и несколько раз хорошо встряхивают про-

бирку. При встряхивании на дне пробирки образуется продукт

конденсации фурфурола с тимолом, который имеет красный цвет.

Внимание! Эту реакцию проводят только в сухой пробирке.

Химизм этой реакции следующий. При взаимодействии кон-

центрированной серной кислоты с гексозами или пентозами про-

исходит их дегидратация. При этом из пентоз образуется фурфу-

рол, а из гексоз – оксиметилфурфурол, которые дают с тимолом

продукт конденсации красного цвета:

продукты

конденсации

красного

цвета

пентоза фурфурол тимол

4.2.2. Реакция с α-нафтолом.

Реакция с α-нафтолом является качественной реакцией на уг-

леводы. Часть сгустка муцина переносят в пробирку, добавляют к

нему приблизительно двукратный объем 0,2%-ного спиртового

раствора α-нафтола, 20 капель концентрированной серной кислоты

и хорошо перемешивают. Появление розово-фиолетового окраши-

вания говорит о присутствии в муцине углеводов.

Внимание! Эту реакцию проводят только в сухой пробирке.

4.3. Определение в муцине белкового компонента.

Белки в муцине обнаруживают с помощью биуретовой реак-

ции. Для этого берут пробирку и переносят в нее часть сгустка

муцина, прибавляют равный объем 10%-ного раствора NaOH и в

пять раз меньше 1%-ного раствора сульфата меди (CuSO

). Все

тщательно перемешивают и наблюдают за изменением цвета (по-

является сине-фиолетовая окраска).

4.4. Открытие углеводного компонента в яичном белке.

Открытие углеводного компонента в яичном белке, так же

как и его открытие в муцине, проводится с помощью реакции

Молиша и с помощью α-нафтола (пп. 4.2.1 и 4.2.2).

Для этого в две пробирки наливают по 10 капель 10%-ного

раствора яичного белка. Затем в одну добавляют 2–3 капли

1%-ного спиртового раствора тимола, а в другую – 1–2 капли

0,1%-ного раствора α-нафтола. Содержимое обеих пробирок хо-

рошо перемешивают и затем в каждую из них осторожно,

по стенке, наслаивая, приливают по 10–15 капель концентриро-

ванной серной кислоты. При стоянии на границе раздела двух фаз

в первой пробирке появляется красное окрашивание, а во второй

– фиолетовое.

5. СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Отчет составляется с указанием цели, задания, включая урав-

нения реакции, экспериментальную часть и выводы.

6. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПРОВЕРКИ

6.1. Какой состав имеют гликопротеиды?

6.2. Что входит в состав простетической группы гликопро-

теидов?

6.3. Какую роль играют гликопротеиды в организме?

6.4. Какая реакция является качественной на пептозу и каков

её химизм?

6.5. Какая реакция является качественной реакцией на угле-

воды?

6.6. Какие ткани в живых организмах содержат большое ко-

личество гликопротеидов?

7. ЛИТЕРАТУРА

7.1. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. – М.: Высшая шко-

ла, 1985.

7.2. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: Высшая шко-

ла, 1989.

7.3. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лаборатор-

ным занятиям по биохимической химии. – М.: Медицина, 1983.

ВИТАМИНЫ

1. ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучить качественные реакции витаминов и провести коли-

чественное определение некоторых из них.

2. ЗАДАНИЕ

2.1. Провести качественные реакции на жирорастворимые

витамины:

– витамин А (ретинол);

– витамин Д (эргокальциферол, холикальциферол);

– витамин Е (токотриенол).

2.2. Провести качественные реакции на водорастворимые ви-

тамины:

– витамин В

(тиамин);

– витамин В

(рибофлавин);

– витамин РР (никотиновая кислота и ее амид);

– витамин В

(пиридоксин);

– витамин С (аскорбиновая кислота).

2.3. Приготовить экстракт из растительного материала.

2.4. Определить содержание витамина С в исследуемом ма-

териале.

3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Витамины – это разнообразные по химическому строению

низкомолекулярные органические вещества, необходимые для

нормальной жизнедеятельности организма. Они являются необ-

ходимой составной частью пищи, так как в организме человека

не синтезируются. Содержание витаминов в пище по сравнению

с ее основными компонентами очень мало. При отсутствии в пи-

ще витаминов развиваются заболевания, которые носят общее

название – авитаминозы, а при их недостаточном содержании –

гиповитаминозы. Если содержание витаминов в пище велико, это

тоже приводит к заболеваниям – гипервитаминозам. Суточная

потребность в витаминах измеряется в милли- или микрограммах.

Витамины – это вещества, обеспечивающие нормальное про-

текание биохимических и физиологических процессов в организ-

ме. Поэтому они относятся к группе биологически активных ве-

ществ (БАВ), которые влияют на обмен веществ. Это связано с

тем, что водорастворимые витамины входят в состав сложных

ферментов всех классов, кроме гидролаз, в качестве их простети-

ческих групп или коферментов. Следовательно, изменения в об-

мене веществ, происходящие при авитаминозах, являются ре-

зультатом нарушения деятельности ферментативных систем.

Роль жирорастворимых витаминов в процессе обмена веществ

изучена в меньшей степени.

Все витамины в зависимости от их отношения к воде делятся

на две группы: водорастворимые и жирорастворимые. Все водо-

растворимые витамины, за исключением витамина С и Р, содер-

жат в своем составе азот, поэтому их объединяют в комплекс ви-

таминов группы В. Они обычно сопровождают друг друга в

продуктах и обладают общим свойством – устойчивостью к на-

греванию. В отличие от них витамин С к нагреванию неустойчив.

При нагревании он быстро разрушается, особенно в присутствии

кислорода и солей тяжелых металлов.

К водорастворимым витаминам относятся В

– тиамин, В

– ри-

бофлавин, РР (В

) – никотиновая кислота и ее амид, В

– пиридок-

син, В

– пантотеновая кислота, Н – биотин, В

– фолиевая кислота,

– цианкобаламин, В

– пангамовая кислота, С – аскорбиновая

кислота, Р – рутин и некоторые другие.

Витамин В

(тиамин) состоит из пиримидинового и тиазоло-

вого колец. В организме он входит в состав коферментов ТПФ

(тиаминпирофосфата) и ТТФ (тиаминтрифосфата).

тиамин (В

)

ТПФ является коферментом ферментов декарбоксилирования

(декарбоксилаз) α-кетокислот, поэтому при его недостатке процес-

сы декарбоксилирования будет нарушены. Это в первую очередь

относится к декарбоксилированию пировиноградной кислоты

(ПВК) – важнейшего промежуточного продукта обмена углеводов:

тиаминпирофосфат (ТПФ)

Витамин В

(рибофлавин) относится к группе естественных

пигментов, известных под названием флавинов. Он представляет

собой метилированное производное изоаллоксазина, к которому

присоединен спирт рибитол. Его биологическое действие во мно-

гом определяет наличие активных двойных связей в циклической

структуре рибофлавина. По месту двойных связей легко присое-

диняется водород, при этом рибофлавин, вещество желтого цве-

та, восстанавливается в бесцветное лейкосоединение:

рибофлавин (В

)

Рибофлавин входит в состав коферментов аэробных (вторич-

ных) дигидрогеназ – в состав флавинадениндинуклеодида (ФАД).

Поэтому при недостатке рибофлавина происходит нарушение

процесса биологического окисления органических веществ, в ча-

стности окисления β-оксикислот (восстановленной формы нико-

тинамидадениндинуклеотида (НАД · Н

) и др.

Витамин РР (никотиновая кислота и ее амид) является про-

изводным пиридина. Никотинамид входит в состав коферментов

анаэробных (первичных) дегидрогеназ: никотинамидаденинди-

нуклеотида (НАД) и никотинамидадениндинуклеотидфосфата

(НАДФ). Поэтому при недостатке витамина РР происходит на-

рушение процессов биологического окисления органических ве-

ществ – как тканевого дыхания, так и брожения:

никотиновая никотинамид

кислота

Витамин В

(пиридоксин). Пиридоксин – это общее название

группы веществ, обладающих активностью витамина В

: пири-

доксола, пиридоксаля и пиридоксамина. Все они является произ-

водными пиридина:

пиридоксол пиридоксаль пиридоксамин

В организме витамин В

играет большую роль в обмене бел-

ков и аминокислот. Он входит в состав коферментов ферментов

трансаминирования (переаминирования) и поэтому участвует в

процессах трансаминирования аминокислот (переносе амино-

группы с аминокислоты на кетокислоту). Он также входит в со-

став декарбоксилаз некоторых аминокислот. Поэтому при недос-

татке витамина В

нарушается белковый обмен.

Витамин С (аскорбиновая кислота) – вещество, которое по

своей химической природе близко к углеводам. Оно очень неус-

тойчиво:

аскорбиновая кислота

В живых организмах витамин С присутствует как в свобод-

ном, так и в связанном виде. Связанная с белком аскорбиновая ки-

слота – аскорбиноген – обладает большей устойчивостью к окисли-

телям, чем свободная кислота. Важнейшей особенностью

аскорбиновой кислоты является ее способность к обратимому окис-

лению (дегидрированию) с образованием дегидроаскорбиновой ки-

слоты. В живых организмах витамин С принимает участие в окис-

лительно-восстановительных процессах, в синтезе стероидных

гормонов, в образовании тетрагидрофолиевой кислоты, в превраще-

ниях аминокислот (тирозина и фенилаланина) и др. Это говорит о

том, что биологическая роль аскорбиновой кислоты многообразна.

К жирорастворимым витаминам относятся витамины А (ре-

тинол), Д (эргокальциферол, холикальциферол), Е (токоферол),

К (филлохинон), Q (убихинон), F (комплекс ненасыщенных жир-

ных кислот – линолевой, линоленовой и араxидоновой).

Витамин А – ретинол. Биологически активный витамин А

содержится только в животных продуктах. В настоящее время

выделены два вещества, обладающих активностью витамина А:

витамин А

– из печени морских рыб и витамин А

– из печени

пресноводных рыб. Витамин А

отличается от витамина А

нали-

чием дополнительной двойной связи в кольце (между 3 и 4 угле-

родными атомами).

В растениях содержатся пигменты, которые являются провита-

минами витамина А. В животных организмах под влиянием фер-

мента каротинокиназы они превращаются в витамин А. К ним отно-

сится каротин – желтый пигмент растений. Витамин А в организме

принимает участие в образовании зрительного пурпура – родопсина.

Кроме этого, он поддерживает стабильность клеточных мембран:

ретинол (А

)

Витамин Д является производным циклопентанпергидрофе-

нантрена. Выделено несколько веществ, обладающих активностью

витамина Д. Наиболее распространены витамин Д

– эргокальци-

ферол и витамин Д

– холекальциферол:

эргокальциферол

Биологически активный витамин Д содержится только в жи-

вотных продуктах. Провитамином витамина Д

является эргосте-

рол. Он содержится в грибах и дрожжах. Провитамином витамина

является холестерол – он содержится в коже. Провитамины

превращаются в витамины при облучении их ультрафиолетовыми

лучами. Витамин Д в живых организмах участвует в процессе кос-

теобразования, так как влияет на обмен кальция и фосфора, а так-

же на группу ферментов, осуществляющих всасывание кальция.

При его недостатке кости становятся мягкими и искривляются:

холекальциферол

Витамин Е (токоферол) существует в виде нескольких изо-

меров α-, β- и γ-токоферолов. Они отличаются друг от друга по-

рядком расположения метильных групп в бензольном ядре:

α-токоферол