Березовская В.А. Биохимия. Лабораторный практикум

Подождите немного. Документ загружается.

вести хроматографическое разделение смеси в условиях, анало-

гичных тем, при которых определялись коэффициенты распреде-

ления веществ, входящих в ее состав.

Радиальную хроматографию на бумаге проводят в чашках

Петри. В этом случае растворитель перемещается от центра круга

к периферии, перенося с собой аминокислоты, которые концен-

трируются на различном расстоянии от центра, образуя круги. Их

можно обнаружить, проведя нингидриновую реакцию.

Хроматография широко применяется для разделения малых

количеств веществ, которые близки по своему составу и свойст-

вам, в частности для определения аминокислотного состава белка

и различных биологических жидкостей.

4. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

4.1. Подготовка носителя.

Для проведения круговой хроматографии на бумаге носитель

готовят из хроматографической бумаги. Для этого вырезают из нее

квадрат, сторона которого на 5–10 мм больше диаметра чашки

Петри. Затем делают два параллельных разреза приблизительно на

расстоянии 3–4 мм друг от друга от середины одной из сторон до

центра квадрата. При всех операциях бумагу держат только за

углы. Образовавшуюся полоску отгибают перпендикулярно плос-

кости диска так, чтобы образовался четкий сгиб. Проделывают это,

держась пальцами за самый конец полоски. После образования

сгиба конец, к которому прикасались пальцы, срезают ножницами.

4.2. Проведение хроматографию на бумаге отдельных ами-

нокислот.

На место сгиба наносят 1 каплю раствора аминокислоты и

высушивают на воздухе. В хроматографическую камеру, которая

представляет собой закрытый сосуд, образованный двумя одина-

ковыми по диаметру крышками или донышками чашки Петри,

наливают растворитель, который предварительно тщательно пе-

ремешивают. Хроматографическую бумагу помещают в хромато-

графическую камеру так, чтобы отогнутая полоска находилась в

растворителе.

Постепенно растворитель перемещается по полоске и смачи-

вает бумагу. Когда фронт растворителя на бумаге будет иметь

диаметр 80–90 мм, ее достают из камеры и карандашом отмечают

границу фронта растворителя. После этого бумагу сразу

же помещают в сушильный шкаф при температуре 70–80ºС на

8–10 мин для удаления растворителя и фиксации аминокислот.

Внимание! Достав бумагу из камеры, ее нужно как можно

быстрее поместить в сушильный шкаф, так как ее подсушивание

при комнатной температуре может привести к неправильным ре-

зультатам.

4.4. «Проявление» хроматограммы.

В ванночку наливают раствор нингидрина. Высушенную бу-

магу быстро окунают в него, кладут на грани сухой крышки (или

донышка) чашки Петри и сразу же (немедленно!) помещают на

5–6 мин в сушильный шкаф при температуре 90–100 °С. После

высушивания на диске появляется кольцо соответствующей ами-

нокислоты.

4.5. Определение коэффициентов распределения (R

) индиви-

дуальных аминокислот.

При помощи линейки измеряют расстояние, которое прошла

каждая из аминокислот от места старта (места нанесения амино-

кислоты) до фронта пятна, и расстояние, которое прошел раство-

ритель. После этого по формуле (1) вычисляют значение коэффи-

циента распределения (R

) для каждой аминокислот.

4.6. Проведение хроматографического разделения аминокис-

лот в контрольном растворе.

Хроматографическое разделение аминокислот в контрольном

растворе проводят аналогично пп. 4.1–4.4. Определяют коэффи-

циенты распределения для всех проявившихся на хроматограмме

аминокислот (аналогично п. 4.5). Сравнивают полученные значе-

ния R

со значениями коэффициентов распределения индивиду-

альных аминокислот и определяют, какие аминокислоты находи-

лись в исследуемом растворе.

4.7. Делают выводы о разделении и определении аминокис-

лот методом круговой хроматографии на бумаге.

5. СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Отчет составляется с указанием цели, задания, принципа

хроматографического метода, включает экспериментальную

часть и выводы. В экспериментальной части отражаются этапы

проведения работы с кратким их описанием, проводятся расчеты

коэффициентов распределения аминокислот и делаются выводы.

Полученные хроматограммы с указанием, каким аминокислотам

они принадлежат, прикладываются к отчету.

6. КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

6.1. В чем сущность распределительной хроматографии?

6.2. Каковы особенности хроматографии на бумаге?

6.3. В чем состоит техника бумажной хроматографии?

6.4. Как производится идентификация компонентов в разде-

ляемой смеси?

6.5. Что называют коэффициентом распределения?

6.6. В каких случаях применяют метод хроматографии и чем

он удобен?

7. ЛИТЕРАТУРА

7.1. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. – М.: Высшая шко-

ла, 1985.

7.2. Алейникова Г.Л., Рубцова Г.В. Руководство к практиче-

ским занятиям по биологической химии. – М.: Высшая школа,

1988.

7.3. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лаборатор-

ным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина, 1983.

7.4. Филиппович Ю.Б., Егоров Т.А., Севастьянова Т.А. Прак-

тикум по общей биохимии. – М.: Просвещение, 1975.

7.5. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: Высшая шко-

ла, 1989.

НУКЛЕОПРОТЕИДЫ

1. ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Изучение состава нуклеопротеидов.

2. ЗАДАНИЕ

2.1. Выделить нуклеопротеиды из дрожжей.

2.2. Провести гидролиз нуклеопротеидов.

2.3. Определить продукты гидролиза при помощи качествен-

ных реакций:

– на белки и пептиды;

– пуриновые основания;

– пентозы;

– фосфорную кислоту.

2.4. Сделать выводы и оформить отчет.

3. ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

Нуклеопротеиды – это сложные белки, простетической груп-

пой которых являются нуклеиновые кислоты. Белковым компо-

нентом в нуклеопротеидах чаще всего являются основные белки

– гистоны или протамины. Они обладают основными свойствами,

так как в них содержится много основных аминокислот – лизина

и аргинина.

Нуклеиновые кислоты являются сложными биополимерами,

структурной единицей которых является нуклеотид. В состав

нуклеотида входит пуриновое или пиримидиновое основание,

пентоза (рибоза или дезоксирибоза) и остаток фосфорной кисло-

ты. В нуклеиновых кислотах встречаются два пуриновых основа-

ния – аденин и гуанин и три пиримидиновых – тимин, цитозин

и урацил.

Основания связаны с пентозой при помощи N-гликозидной

связи, которая образуется между 1′-углеродным атомом пентозы

и атомом азота пуринового (N

) или пиримидинового (N

) осно-

вания. Соединение, в состав которого входит пуриновое или пи-

римидиновое основание и сахар (пентоза), называется нуклеози-

дом. Фосфорная кислота присоединяется к 3′-углеродному атому

пентозы в результате образования эфирной связи.

Нуклеотиды соединяются друг с другом тоже при помощи

эфирной связи и образуют полинуклеотид. Эфирная связь возни-

кает между остатком фосфорной кислоты одного нуклеотида и

5′-углеродным атомом пентозы другого нуклеотида:

цитидин-3′-фосфат аденозин-3′-фосфат

В состав живых организмов входят два типа нуклеиновых

кислот: дезоксирибонуклеиновые (ДНК) и рибонуклеиновые

(РНК). В состав ДНК входят 4 основания (аденин, гуанин, тимин

и цитозин), сахар – дезоксирибоза и остаток фосфорной кислоты.

В состав РНК входят тоже 4 основания (аденин, гуанин, урацил

и цитозин), сахар – рибоза и остаток фосфорной кислоты.

Если белок связан с ДНК, образуется дезоксирибонуклеопро-

теид (ДРНП), если с РНК – рибонуклеопротеид (РНП). В ДРНП

и РНП нуклеиновые кислоты и белки связаны друг с другом в ос-

новном ионными связями, которые образуются между гуаниди-

новой группой аргинина или свободной аминогруппой лизина со

структурными элементами фосфорной кислоты нуклеиновых ки-

слот. Нуклеиновая кислота и белок в нуклеопротеиде взаимно

стабилизируют друг друга, что значительно повышает их устой-

чивость к денатурации.

Выделение нуклеопротеидов из биологического материала

можно осуществлять различными методами: экстракцией водой

или слабыми и средними растворами щелочей и солей с после-

дующим осаждением нуклеопротеидов уксусной кислотой, ульт-

рацентрифугированием, гельфильтрацией и др. При применении

любого из них сначала надо разрушить клеточную оболочку. Для

этого материал, взятый для исследования, гомогенизируют.

Все нуклеопротеиды можно подвергнуть гидролитическому

распаду, при котором происходит последовательный разрыв сна-

чала эфирных, а затем гликозидных связей. Сначала нуклеопро-

теиды распадаются на простые белки и нуклеиновые кислоты. За-

тем белки могут подвергнуться гидролизу до пептонов, пептидов и

даже до аминокислот. Нуклеиновые кислоты расщепляются с об-

разованием нуклеотидов, которые затем подвергаются дальнейше-

му гидролизу с образованием пуриновых и пиримидиновых осно-

ваний, рибозы или дезоксирибозы и фосфорной кислоты. Схема

гидролитического распада представлена на рисунке:

При мягком гидролизе происходит сравнительно неглубокий

распад белка. Пиримидиновые нуклеотиды при таком гидролизе

не распадаются, а пуриновые распадаются с образованием пури-

новых оснований (аденин и гуанин), рибозы и фосфорной кисло-

ты. Проводя гидролиз при определенных условиях, можно после-

довательно выделить различные промежуточные продукты

гидролитического распада нуклеопротеидов и определить их при

помощи качественных реакций.

4. ПОРЯДОК ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ

4.1. Выделение рибонуклеопротеидов.

Для получения рибонуклеопротеидов помещают в ступку

10 г дрожжей. Добавляют туда 4 мл водно-эфирной смеси (1:1)

и перемешивают. Затем прибавляют 5 г кварцевого песка и тща-

тельно растирают, приливая небольшими порциями 50 мл

0,4%-ного раствора гидроксида натрия (NaOH). Полученную

массу растирают не менее 15 мин, после чего суспензию фильт-

руют через бумажный фильтр или центрифугируют. Получен-

ный осадок выбрасывают, а весь фильтрат (центрифугат) соби-

рают, помещают в стакан и понемногу прибавляют 10%-ный

раствор уксусной кислоты (около 5–6 мл). После каждого при-

бавления лакмусовой бумажкой проверяют реакцию среды. Ки-

слоту добавляют до тех пор, пока среда не станет слабокислой.

В этих условиях нуклеопротеиды выпадают в осадок. Получен-

ную суспензию центрифугируют, фильтрат сливают и отделяют

осадок нуклеопротеидов.

4.2. Гидролиз нуклеопротеидов.

Полученный осадок нуклеопротеидов переносят в колбу для

гидролиза и добавляют туда 20 мл 10%-ной серной кислоты.

Колбу закрывают пробкой, к которой подсоединен обратный воз-

душный холодильник, и нагревают (слабо кипятят) на водяной

кипящей бане (или на сетке) в течение 1 часа. После этого гидро-

лизат отфильтровывают и проводят с ним качественные реакции

на наличие продуктов гидролиза.

4.3. Определение белков и пептидов.

При проведении гидролиза при условиях, указанных в п. 4.2,

белки подвергаются ему лишь частично и расщепляются только

до пептидов. Белки и пептиды в гидролизате обнаруживают с по-

мощью биуретовой реакции. Для этого берут пробирку и вносят в

нее 10 капель полученного раствора гидролизата, прибавляют

10 капель 10%-ного раствора NaOH и 2 капли 1%-ного раствора

сульфата меди (CuSO

). Все тщательно перемешивают, наблюда-

ют за изменением цвета (появляется розовая или розово-

фиолетовая окраска) и делают выводы.

4.4. Открытие пуриновых оснований.

В пробирку наливают 10 капель гидролизата и осторожно,

по каплям, добавляют концентрированный раствор аммиака до

щелочной реакции по лакмусу, а затем вносят 8–10 капель амми-

ачного раствора нитрата серебра. Через несколько минут выпада-

ет хлопьевидный светло-коричневый осадок солей пуриновых

оснований.

4.5. Открытие пентоз.

Обнаружение пентоз основано на их дегидратации концен-

трированными кислотами с образованием фурфурола, который

дает с тимолом (реакция Молиша), α-нафтолом и орцином окра-

шенные соединения.

Внимание! Эти реакции проводят только в сухих пробирках.

Рибозу и дезоксирибозу можно открыть реакцией с дифенилами-

ном, который с рибозой дает зеленое окрашивание, а с дезокси-

рибозой – синее.

4.5.1. Реакция Молиша.

В пробирку наливают 10 капель гидролизата, добавляют

2–3 капли 1%-ного спиртового раствора тимола и хорошо пере-

мешивают. Затем осторожно, по стенке пробирки, наслаивая,

приливают 10–15 капель концентрированной серной кислоты.

Появляется красное окрашивание, которое наиболее хорошо вы-

ражено на границе раздела жидкостей.

4.5.2. В пробирку наливают 10 капель гидролизата, добавля-

ют 1–2 капли 0,1%-ного раствора α-нафтола и хорошо перемеши-

вают. Затем осторожно, по стенке пробирки, приливают

10–15 капель концентрированной серной кислоты. При стоянии на

границе раздела двух фаз появляется фиолетовое окрашивание.

4.5.3. В пробирку наливают 10 капель гидролизата, добавля-

ют 10–15 капель орцина и 15–20 капель концентрированной со-

ляной кислоты. Смесь нагревают до кипения и наблюдают появ-

ление окрашивания (зеленого или розово-красного).

4.5.4. Открытие рибозы и дезоксирибозы.

В пробирку наливают 5 капель гидролизата, добавляют

15–20 капель 1%-ного раствора дифениламина и кипятят на во-

дяной бане. Через 15–20 мин кипения в пробирке появляется си-

не-зеленое окрашивание.

4.6. Обнаружение фосфорной кислоты.

4.6.1. В пробирку наливают 10 капель гидролизата, добавля-

ют 20 капель раствора молибдата аммония в азотной кислоте

и кипятят на водяной бане. Жидкость в пробирке приобретает

лимонно-желтый цвет. Пробирку достают из бани и сразу же ох-

лаждают под струей холодной воды. Образуется желтый осадок

фосфоромолибдата аммония (NH

)

· 12MoO

+ 12(NH

)

MoO

+ 21HNO

= (NH

)

· 12MoO

+ 21NH

+ 12H

4.6.2. В пробирку наливают 10 капель гидролизата и посте-

пенно добавляют концентрированный раствор аммиака до появ-

ления резкого запаха, а затем 10 капель магнезиальной смеси.

Образуется кристаллический осадок фосфата магний-аммония

MgNH

5. СОДЕРЖАНИЕ ОТЧЕТА

Отчет составляется с указанием цели, задания, включая экс-

периментальные данные, таблицы и выводы. Все полученные

экспериментальные данные сводятся в таблицу.

Изучение продуктов гидролиза нуклеопротеидов

№

п/п

Название

реакции

Материал

исследования

Используемые

реактивы

Эффект

реакции

Чем

обусловлена

реакция

Приводится схема гидролиза нуклеопротеидов и делается

вывод об их составе.

6. ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПРОВЕРКИ

6.1. Какие вещества называются нуклеопротеидами?

6.2. Каким образом связываются полимерные цепи нуклео-

протеидов?

6.3. Какую роль играют нуклеопротеиды в биохимических

процессах обмена веществ?

6.4. Какие способы выделения нуклеопротеидов существуют

и на чем они основаны?

6.5. Каковы продукты гидролитического распада нуклеопро-

теидов?

6.6. При помощи каких связей соединены нуклеотиды в нук-

леиновой кислоте?

6.7. Что является структурной единицей нуклеиновых кислот

и что входит в ее состав?

6.8. Какие основания входят в состав нуклеотидов?

6.9. Какие сахара входят в состав нуклеотидов?

6.10. При помощи каких связей соединены в нуклеотиде друг

с другом основание и сахар, сахар и фосфорная кислота?

6.11. Какие нуклеиновые кислоты входят в состав живых ор-

ганизмов? Каков их химический состав?

6.12. При помощи каких качественных реакций обнаружива-

ют продукты гидролитического распада нуклеопротеидов: белки

и пептиды; пуриновые основания; пентозы; фосфорную кислоту?

7. ЛИТЕРАТУРА

7.1. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. – М.: Высшая шко-

ла, 1985.

7.2. Николаев А.Я. Биологическая химия. – М.: Высшая шко-

ла, 1989.

7.3. Алейников Г.Л., Рубцова Г.В. Руководство к практиче-

ским занятиям по биохимии. – М.: Высшая школа, 1988.

7.4. Кушманова О.Д., Ивченко Г.М. Руководство к лаборатор-

ным занятиям по биологической химии. – М.: Медицина, 1983.