Автореферат диссертации - Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбинантного штамма-продуцента

Подождите немного. Документ загружается.



На правах рукописи

Гришин Дмитрий Викторович

Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью

рекомбинантного штамма-продуцента

Специальность: 03.00.23 – «Биотехнология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва-2009



Работа выполнена в Московском государственном университете инженерной

экологии (МГУИЭ) Федерального агентства по образованию РФ, на кафедре

«Экологическая и промышленная биотехнология».

Научный руководитель: - Никитин Александр Викторович,

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

- Миронов Александр Сергеевич,

доктор биологических наук, профессор

-Бибикова Маргарита Васильевна,

доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация:

Государственное научное учреждение

«Всероссийский научно-исследовательский

институт пищевой биотехнологии РАСХН»

Защита состоится «___» _______2009 г. в_____часов на заседании объединённого

диссертационного совета ДМ 212.204.13 в Российском химико-технологическом

университете им.Д.И.Менделеева по адресу: 125047, Москва, Миусская пл., д.9,

ауд. 443.

С диссертацией можно ознакомиться в информационно-библиотечном центре

РХТУ им. Д.И. Менделеева.

Автореферат разослан «___» ____________2009г.

Учёный секретарь

диссертационного совета

ДМ 212.204.13

кандидат технических наук Шакир И.В.



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы.

Фермент лактаза (β-галактозидаза), расщепляющий

лактозу молока имеет особое значение в раннем детстве, так как дисахарид

лактоза, содержащийся в молоке является основным источником галактозы,

которая участвует в синтезе галактоцереброзидов, необходимых для нормального

развития ЦНС и сетчатки глаза. Уменьшение количества лактозы и производных её

гидролиза может послужить развитию синдрома мальабсорбции (СМА),

который

выражается, в частности, в недостаточности лактазы и в сопряжённом с этим

состоянием лактозонепереносимости [Ладодо К.С., 2000]. Наиболее эффективным

способом профилактики и лечения СМА, является промышленное создание

безлактозных продуктов, либо приём ферментных препаратов (мезофильная β-

галактозидаза), расщепляющих лактозу.

Получение безлактозных молочных продуктов до сих пор остаётся

достаточно трудоёмким процессом, базирующимся на

длительном осаждении

белка обезжиренного молока, растворении осажденного белка в щелочи или

растворах щелочных солей и последующей распылительной сушке, после которой

экстракцией специально подобранными растворителями удаляют собственно

лактозу.

Получение ферментных препаратов для гидролиза β-галактозидов также

сводится к трудоёмкой химической очистке фермента, приводящей к его

инактивации. Кроме того для использования в

пищевой промышленности и

медицине фермент должен нормироваться посодержанию ряда веществ,

используемых для иммобилизации и элюции. Также, использование мезофильных

ферментов, ограничено в тех случаях, когда производственный процесс

необходимо проводить при повышенной температуре (выше 60

С).

Принципиально новым подходом к получению препаратов β-галактозидаз

с улучшенными характеристиками является биотехнологический приём,

называемый fusion – технологией или технологией слитных (химерных)

конструкций, когда в одной рамке трансляции объединяются генные

последовательности разных белков [Miller, R. C., Kilburn, D. G. et al., 1989; Gurvits,



I. D., Velikodvorskaya G. А. et al., 2007]. Использование подобной технологии

позволило создать фермент, обладающий улучшенными свойствами: повышенной

термостабильностью и способностью к самостоятельному аффинному связыванию

с биологически совместимыми субстратами, такими как декстран [Cavataio F. et

al., 2005].

Положения, выносимые на защиту. 1. Рекомбинантная белковая

конструкция ДСД-сп-β-ГАЛ содержащая декстрансвязывающий домен и

каталитическую последовательность фермента термостабильной β-галактозидазы и

её штамм-

продуцент. 2. Разработка методов очистки рекомбинантных белков,

основанная на сочетании использования термостабильности целевого продукта и

его декстрансвязывающих свойств. 3. Созданный плазмидный вектор с

регуляторными областями и геном химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ. 4. Декстран-

белковый комплекс на основе белка ДСД-сп-β-ГАЛ и декстранового сорбента для

гидролиза бета-галактазидов.

Цель и задачи

исследования. Целью данной работы являлось создание

гибридной (химерной) рекомбинантной белковой конструкции ДСД-сп-β-ГАЛ,

имеющей декстрансвязывающий домен и активность термостабильной бета-

галактозидазы, её штамма-продуцента и исследование физико-химических свойств

данного белка.

В соответствии с поставленной целью в процессе работы предстояло решить

следующие основные задачи:

1. Получение мутантного гена ДСД

из Leuconostoc mesenteroides со спейсером

на С-конце.

2. Создание генной последовательности химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ.

с геном ДСД и геном термостабильной β - галактозидазы из

Thermoanaerobacter ethanolicus, объединёнными через спейсер.

3. Создание бактериального штамма-продуцента обеспечивающего

эффективную экспрессию химерного рекомбинантного белка ДСД-сп-β-

ГАЛ.



4. Изучение физико-химических свойств белковой конструкции ДСД-сп-β-

ГАЛ.

5. Изучение ферментативной активности белка ДСД-сп-β-ГАЛ.

6. Оптимизация условий получения комплекса декстрана и белка ДСД-сп-β-

ГАЛ. для гидролиза бета-галактозидов.

Научная новизна.

На базе концепции слитных генно-инженерных

конструкций впервые был спланирован и сконструирован рекомбинантный

плазмидный вектор pGD-10, позволяющий осуществлять индуцированный

биосинтез гибридного белка ДСД-сп-β-ГАЛ, обладающего одновременно

декстрансвязывающими свойствами и активностью фермента термостабильной β-

галактозидазы.

Впервые были получены бактериальные продуценты конструкции ДСД-сп-β-

ГАЛ E.coli[pGD-10], обеспечивающие экспрессию целевого белка на

уровне 10%

от тотального белка клеток.

Впервые была предложена высокоэффективная схема выделения, очистки и

иммобилизации рекомбинантного белка ДСД-сп-β-ГАЛ на декстрановом сорбенте,

основанная на уникальных свойствах декстрансвязывающего домена и

позволяющая получать препараты белков со степенью чистоты более 90%.

Практическое значение работы.

Разработанная схема получения штамма-

продуцента химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ, а также способ очистки и

иммобилизации данного белка на декстрановых сорбентах могут найти применение

в медицине, в качестве компонентной базы при создании комплексных препаратов

для профилактики синдрома мальабсорбции. Также комплекс данной белковой

конструкции с декстраном может быть использован в

пищевой промышленности

при реализации схем получения безлактозных продуктов.

Апробация работы.

Апробация диссертации состоялась 14 октября 2009г.

на заседании кафедры ЭиПБ МГУИЭ. Основные результаты исследований были

представлены на XII Всероссийской молодежной школы-конференции по

актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток, 7–14

сентября 2009, С 17., на VI Молодёжной науч. конф. «Биотехнология в



растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва, 5 апреля 2006 г. По

материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, отражающих основное

содержание работы.

Структура и объём работы.

Диссертация изложена на 125 страницах;

содержит 28 рисунков и 5 таблиц; состоит из введения, обзора литературы,

экспериментальной части, результатов и их обсуждений, выводов, списка

цитируемой литературы, включающего 110 наименований и приложений.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Создание бактериальных штаммов продуцентов белка ДСД-сп- β-ГАЛ

1.1. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего

клонирование гена и экспрессию белка LacZThEh

Одним из наиболее значимых ферментов в группе гликозилгидролаз

является термостабильная β - галактозидаза из Thermoanaerobacter ethanolicus,

кодируемая геном LacZThEh (β-ГАЛ). Данный фермент способен продолжительно

действовать при высоких температурах (65-80

С) и в широком диапазоне рН 5,0-7,5

[

Volkov I. Yu. et al., 2005]. Поэтому ген этого белка был выбран в качестве одного

из объектов наших исследований. Биоинформационные последовательности β -

галактозидазы аннотированы в банке данных UniProt под номером Y08557. Т.к.

плазмида pQELacZThEh (pR624, любезно предоставлена сотрудниками.

лаборатории МДиГК ВНИИСБ Сергиенко О.В. и Анисимовой С.В.) с геном β -

галактозидазы Thermoanaerobacter ethanolicus ранее уже была получена на базе

коммерческого вектора серии pQE, то нашей задачей, на данном этапе, явилось

создание продуцента способного обеспечить эффективность клонирования и

экспрессии гена данного белка в клетках E. coli.

Плазмида pQELacZThEh была трансформирована в клетки E. coli DH5α

методом электропорации. Была изучена экспрессия генов белка β - галактозидазы

штамма E. coli DH5α (pQELacZThEh), что являлось одним из важнейших условий

предстоящей генно-инженерной работы. Индукция экспрессии гена проводилась

по стандартному протоколу фирмы Quagene. Однако изучение экспрессии с

помощью электрофореза в 12% ПААГ по Лэммли показало отсутствие белковых



полос ожидаемого молекулярного веса. На основе анализа данных литературы, был

сделан вывод о том, что эффективность гетерологичной экспрессии гена белка

LacZThEh в E. coli оказалась более успешной при включении в состав среды LB, на

время индукции 10мМ СаCl

, 10mM MnCl

, увеличении доли индуктора ИПТГ с 0,1

до 0,5 мМ, а также при изменении времени индукции с 3 ч (при 37

С) до 15 ч (при

комнатной температуре). В результате проделанной работы, нам удалось получить

эффективный продуцент позволяющий выделить в препаративных количествах

методом щелочного лизиса плазмидную ДНК, с геном термостабильной β -

галактозидазы, а также обеспечивающий экспрессию белка LacZThEh (β-ГАЛ) на

уровне 10 -15% от тотального белка штамма.

1.2. Создание бактериального штамма-продуцента, обеспечивающего

экспрессию белка DBD(Gly-Ser)5

1.2.1. Получение и клонирование гена ДСД из Leuconostoc mesenteroides

ДСД (DBD – dextran binding domain) или декстрансвязывающий домен

относится к группе карбогидратсвязывающих модулей (КСМ) это часть комплекса

гидролитических внеклеточных ферментов ряда бактерий. В данном случае особый

интерес представляет каталитический домен декстрансахаразы из Leuconostoc

mesenteroides. Этот белковый домен интересен своей способностью специфически

связываться с различными формами декстрана. Известно, что бактерии рода

Leuconostoc (Leuconostoc lactis, Leuconostoc dextranicum и Leuconostoc

mesenteroides) используются

в пищевой промышленности в качестве заквасочных

культур при производстве молочнокислых продуктов и квашеной капусты, поэтому

в качестве источников микроорганизмов рода Leuconostoc могут служить

различные пищевые продукты молочнокислого брожения.

Образцы квашеной капусты и простокваши суспендировались в жидкой

селективной питательной среде (сахароза 100г/л; дрожжевой экстракт 2,5 г/л;

HPO

5 г/л; (NH

)

0,2 г/л; MgSO

x7H

O 0,2 г/л; NaCl 1,0 г/л.) в которую

засевались порции соответствующего образца. Далее, после 18 ч. инкубации (26

С,

150 об/мин), аликвоты из выращиваемого объёма переносились на 2%

агаризованную питательную среду того же состава и инкубировались в течение 48

ч. при 26

С [Dimic G. R., 2006]. Целевые колонии, образованные бактериями рода



Leuconostoc имели вид слизистых опалесцирующих капель. После скрининга,

изолированные клоны выращивались в жидкой селективной среде, для

последующего выделения хромосомной ДНК методом. Ген декстрансвязывающего

домена был получен благодаря ПЦР, с помощью прямого и обратного праймеров

(искусственно введённые сайты рестриктаз подчёркнуты), фланкирующих генную

последовательность ДСД, при этом в качестве ДНК матрицы использовалась

хромосомная ДНК Leuconostoc mesenteroides, выделенная методом фенол-

хлороформной экстракции. В работе использовались олигонуклеотиды,

синтезированные в ЗАО «Синтол» и ЗАО «Евроген»:

GBD11F CCACCGCCATGGATGGGATCCACAAATCAGTATTATCAATTAGCAGATGGTAAA

NcoI BamHI

RevGBD AGACTAAGATCT

GGCTGACACAGCATTTCCATTATTATCAAA

BglII

Для клонирования продукт амплификации встраивался в коммерческий

вектор pQE6 (Quageen, USA), методом лигирования полученных рестрикционных

фрагментов по сайтам рестрикции NcoI, BglII/BamHI. Затем полученная

плазмидная ДНК (pQEDBD) (Рис. 1.) выделялась из трансформантов методом

щелочного лизиса, после чего нуклеотидная последовательность целевого гена

была подтверждена с помощью рестрикционного анализа и секвенирования на

автоматическом секвенаторе.

Promoter SD Mat. Peptide Terminator

Рис. 1. - Организация генно-инженерной конструкции с геном ДСД (DBD) в плазмиде

pQEDBD.



1.2.2. Получение экспрессионной плазмиды pQEDBDsp с геном ДСД из

Leuconostoc mesenteroides со спейсером на С-конце.

1.2.2.1. Получение гена ДСД из Leuconostoc mesenteroides со спейсером на С-

конце и создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка DBD(Gly-

Ser)5.

Декстрансвязывающий домен, используемый в наших исследованиях должен

быть пространственно удалён от бета-галактозидазы, что требует наличия ряда

отличий от ДСД, аннотированного во Всемирном генбанке. Прежде всего, отличие

заключается в необходимости присутствия на С-конце аминокислотной

последовательности белка глицин-серинового спейсера (Gly-Ser)5, который

необходим для пространственного разделения различных функциональных

доменов. Создание гена DBD(Gly-Ser)5

или иначе ДСД-сп, кодирующего белок

ДСД и глицин-сериновый спейсер (сп), осуществлялось в два этапа методом

«праймеропосредованной прогулки», при этом происходило постепенное

наращивание С-концевой спейсерной последовательности для чего были

спланированы следующие корректирующие праймеры:

GBD11F CCACCGCCATGGATGGGATCCACAAATCAGTATTATCAATTAGCAGATGGTAAA

NcoI BamHI

Rev

DBD

-1: 5’-GGAGCCAGAACCCGGGGATCTTGCTGACAC-3’

Rev

DBD

-2: 5’-AACTAAGCTTAGATCTGGCGCCAGAACCGGAACCAGAGCCGGAGCCAGAACC-3’

HindIII BglII

На первом этапе «праймеропосредованной прогулки» использовались

праймеры GBD11F и Rev

DBD

-1, на втором - GBD11F и Rev

DBD

-2, последний

спланирован внахлёст с Rev

DBD

-1. В качестве матрицы для проведения ПЦР

использовали плазмидную ДНК pQEDBD в концентрации 0,3 мг/мл.

Promoter SD Mat. Peptide Spacer Terminator

Рис. 2. - Организация генно-инженерной конструкции pQEDBDsp.



Далее, по сайтам рестрикции NcoI и HindIII скорректированный ген ДСД, был

интегрирован в бактериальный вектор pQE6 (Quageen, USA), в процессе чего была

сконструирована экспрессионная плазмида pQEDBDsp (Рис. 2.). В результате

манипуляций был получен плазмидный вектор содержащий скорректированный

ген ДСД с С-концевым спейсером.Идентичность клонированного в составе вектора

pQEDBDsp гена ДСД-сп (размер гена ≈ 500 п.н.) была

подтверждена с помощью

ПЦР (рис. 3), посредством использовавшихся ранее прямого (GBD11F) и обратного

праймеров (Revgal), при тех же параметрах ПЦР.

1.2.3. Создание бактериальных продуцентов белка DBD(Gly-Ser)5.

Плазмида pQEDBD(Gly-Ser)5 (или pQEDBDsp) была трансформирована в

клетки E. coli DH5a методом электропорации. Была проверена возможная

экспрессия генов химерного белка в штамме E. coli DH5a. с помощью ИПТГ.

Анализ экспрессии на основании электрофореза в 17% ПААГ по Лэммли показал

присутствие белковых полос ожидаемого молекулярного веса 16 кДа с уровенем

экспрессии 25-30% от тотального белка клетки (Рис. 4.).

Рис. 3. - Электрофорез ПЦР продуктов в 1%

агарозном геле.

1.Отрицательный контроль (MQ, Taq полимераза 5

ед.ак); 2.Отрицательный контроль (pQE6, Taq

полимераза 5ед.ак); 3. ПЦР продукт гена белка ДСД-

сп, проба №1 (500 п.н.); 4. ПЦР продукт гена белка

ДСД-сп, проба №2 (500 п.н.); 5. ПЦР продукт гена

белка ДСД-сп, проба №3 (500 п.н.); 6. ПЦР продукт

гена белка ДСД-сп, проба №4 (500 п.н.); 7. ПЦР

продукт гена белка ДСД-сп, проба №5 (500 п.н.); 8.

Маркер мол. веса (100 b.p.).

Рис. 4. - Анализ экспрессии белкa ДСД-сп в клетках

E. coli DH5a. (электрофорез в 12% ПААГ по Леммли).

1) Маркер молекулярного веса, лизоцим 14 кДа, 2) E.

coli DH5a. [pQEDBDsp], образец№1, индукция - 16,0 кДа,

3) E. coli DH5a. [pQEDBDsp], образец№2, индукция - 16,0

кДа, 4) E. coli DH5a. [pQEDBDsp] , образец№1, до

индукции, 5) E. coli DH5a [pQEDBDsp], образец№2, до

индукции.