Автореферат диссертации - Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбинантного штамма-продуцента

Подождите немного. Документ загружается.



1.3. Создание бактериального штамма-продуцента обеспечивающего

экспрессию химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ в цитоплазме клеток E. coli.

1. 3. 1. Создание экспрессионных векторов, содержащих ген белка ДСД-сп-β-

ГАЛ.

Для создания экспрессионной плазмиды pQEDBDspLacZThEh (далее pGD10)

с геном целевого химерного белка ДСД-сп-β-ГАЛ было осуществлено лигирование

плазмидной конструкции с геном термостабильной бета-галактозидазы

pQELacZThEh гидролизованной эндонуклеазами рестрикции BamHI/BglI и

плазмидного вектора с геном ДСД со спейсером pQEDBDsp, гидролизованной

рестриктазами BglII/BglI. Процессы дальнейшего лигирования, молекулярного

субклонирования в E.coli DH5a и выделения плазмидной ДНК проводились

по

стандартным методикам [

Маниатис Т. и др., 1984].

Идентичность клонированного в составе вектора pGD-10 гена ДСД-сп-β-

ГАЛ размером 2683 п.н. была подтверждена с помощью рестрикционного

скрининга, секвенирования на автоматическом секвенаторе MegaBace1000

(Amersham Bioscience corp., CША) (ЗАО Евроген), а также посредством

полимеразно-цепной реакции, в присутствии прямого (GBD11F) и обратного

праймеров (Revgal):

GBD11F 5’ CCACCGCCATGGATGGGATCCACAAATCAGTATTATCAATTAGCAGATGGTAAA 3’

Revgal: 5’ GAGAAGACGAAAGGGCCTATAACGCCTATTTTTATAGGTTAAAATG 3’

Рис. 5. - Электрофорез ПЦР продуктов в

1% агарозном геле.

1. ПЦР продукт гена белка ДСД-сп-β-

ГАЛ, проба №1 (2683 п.н.); 2.

Отрицательный контроль (pQE6, Taq

полимераза); 3. ПЦР продукт гена белка

ДСД-сп-β-ГАЛ, проба №2 (2683 п.н.); 4.

Отрицательный контроль (pQE6, Taq

полимераза); 5. ПЦР продукт гена белка

ДСД-сп-β-ГАЛ, проба №3 (2683 п.н.); 6.

Отрицательный контроль (pQE6, Taq

полимераза); 7. Маркер мол. веса (фаг

лямбда EcoRI/HindIII).



Параметры амплификации: 95

С – 5 мин; (94

С – 20с, 67

С - 30с, 72

С –

2,5мин.)x30; 72

С – 5мин; 10

С – хранение. Режим амплификации – точный.

Продукты амплификации детектировались в 1% агарозном геле (Рис.5). Таким

образом была получена экспрессионная конструкция с геном целевого химерного

белка (Рис. 6.).

Promoter SD DBD Spacer LacZThEh Terminator

Рис. 6. - Организация генно-инженерной конструкции pGD10.

1.3.2. Создание бактериальных продуцентов гена белка ДСД-сп-β-ГАЛ.

Плазмида pGD10 была трансформирована в клетки E. coli DH5a методом

электропорации. Была проверена возможная экспрессия генов химерного белка

ДСД-сп-β-ГАЛ с помощью ИПТГ. Анализ экспрессии посредством электрофореза

в 12% ПААГ по Лэммли показал присутствие белковых полос ожидаемого

молекулярного веса 102,3 кДа, однако, при этом уровень экспрессии был

достаточно низок (менее 5% от тотального белка

штамма). Известно, что уровень

экспрессии многих белков варьирует в различных штаммах E. coli. Также время

индукции влияет на количество продуцируемого белка. Очевидно, что проверка

возможного повышение уровня экспрессии белка ДСД-сп-β-ГАЛ с помощью

данных подходов просто необходима в рамках данной работы.

1.3.3. Оптимизация условий экспрессии белка ДСД-сп-β-ГАЛ

1.3.3.1. Оптимизация времени индукции.

Для оптимизации индукции целевого белка в клетках штамма продуцента мы

варьировали время индукции (с 2 часов при 37

С до 15 часов при комнатной

температуре). В результате проведенных экспериментов оказалось, что увеличение

времени индукции до 15 ч вызывает повышение уровня экспрессии (Рис.7.).

Очевидно, что изменение времени индукции является одним из решающих

факторов влияющим на уровень экспрессии целевого белка.



1.3.3.2. Оптимизация количества индуктора.

По данным литературы известно, что хромосомная ДНК клеток Th.

Ethanolicus и L. mesenteroides имеет много сходного с клетками E. coli, по

количеству GC пар азотистых оснований. Для клеток E. coli характерным является

наличие примерно 60% GC.

Таким образом, полученный нами химерный белок имеет оптимальные для

E. coli кодоны и трансляция гена данного белка в этих клетках предельно

эффективна. Поэтому, кроме времени индукции на этот процесс может

значительно повлиять в основном лишь конечная концентрация индуктора. Как и в

§ 1.1. было показано значительное улучшение продукции белка при увеличении

количества индуктора ИПТГ

с минимальных конечных значений 0,1мМ до

максимальных – 0,5мМ.

1.3.3.3. Оптимизация ионного состава ростовой среды.

Анализ экспериментальных данных из § 1.1., показывает то, что

эффективность гетерологичной экспрессии гена белка ДСД-сп-β-ГАЛ, также

должна быть выше в присутствии ионов двухвалентных металлов (Ca

и Mn

), как

уже было отмечено ранее это, вероятно, связано с тем, что данные ионы находятся

в составе простетических групп фермента, определяя правильный фолдинг

(пространственную укладку) конечного белкового продукта.

Рис. 7. - Электрофорез в 10% ПААГ в

присутствии SDS.

1. Штамм DH5a – до индукции, 2. Штамм

DH5a [pGD10] – до индукции, 3. Штамм

DH5a – индукция,

4. Штамм DH5a [pGD10] – индукция, 5.

Штамм DH5a до индукции; термолиз (75

С,

45 мин), 6. Штамм DH5a [pGD10] – до

индукции; термолиз (75

С, 45 мин), 7.

Штамм DH5a [pGD10] – индукция;

термолиз (75

С, 45 мин), 8. Штамм DH5a –

индукция; термолиз (75

С, 45 мин), 9.

Маркер мол. веса (Taq полимераза,

94,5кДа).



В соответствие с полученными данными в состав ростовой среды LB, на

время индукции включали 10мМ СаCl

, 10mM MnCl

и 0,5 мМ ИПТГ, а также

увеличили время индукции с 3 до 15 ч., при этом была получена экспрессия

рекомбинантного белка на оптимальном уровне 10% от тотального белка клетки.

Таким образом, был создан штамм-продуцент белка ДСД-сп-β-ГАЛ и были

оптимизированы условия его экспрессии.

2. Изучение физико-химических свойств белковой конструкции ДСД-сп

-β-

ГАЛ.

2.1. Анализ растворимости и термостабильности белка ДСД-сп-β-ГАЛ в

лизатах клеток E. coli штамма DH5a.

Для анализа физико-химических свойств белка ДСД-сп-β-ГАЛ была изучена

его растворимость в клетках E. coli штамма DH5a (Рис. 8.). Суть метода

заключается в изучении распределения целевого белкового продукта между

осадком и супернатантом, после термолизиса и последующего осаждения.

Изучение растворимости белка ДСД-сп-β-ГАЛ в клетках E.coli

штамма DH5a

показало, что химерный белок синтезируется на 70% в растворимой форме (Рис.8,

трек№4).

Поскольку одной из функциональных составляющих полученного белка

является аутентичная аминокислотная последовательность термостабильного



Pис. 8. - Анализ растворимости белка

ДСД-сп-β-ГАЛ, экспрессия в E. coli

DH5a в 10% ПААГ с SDS.

1. Штамм E. coli DH5a – индукция, без

термолизиса, 2. Штамм DH5a [pGD10]

– до индукции, без термолизиса, 3.

Штамм DH5a [pGD10] –индукция, без

термолизиса, 4. Штамм DH5a [pGD10]

– супернатант, индукция, термолизис

(75

С, 45 мин), 5. Штамм DH5a

[pGD10] – супернатант, до индукции,

термолизис (75

С, 45 мин), 6. Штамм

DH5a [pGD10] – осадок, до индукции,

термолизис (75

С, 45 мин), 7. Штамм

DH5a [pGD10] –осадок, индукция,

термолизис (75

С, 45 мин), 8. Маркер

мол. веса (Taq полимераза, 94,5кДа).



фермента бета-галактозидазы, поэтому функция термостабильности является

доминантной и переходит на химерный белок в целом. Для доказательства этого

предположения клеточные осадки подвергали ультразвуковой дезинтеграции и

термолизу в течение 45 мин. при 75

С с последующим осаждением в поле

центробежных сил, после чего собирали супернатант (растворимая фракция белка).

Т.к. растворимость белка при термолизе составила порядка 70 %, это говорило о

его выраженной термостабильности (рис 7; 8).

2. 2. Изучение ферментативной активности белка ДСД-сп-β-ГАЛ в лизатах

клеток E. coli штамма DH5a.

Благодаря термостабильности полученного белка для изучения его свойств

не требовалось прибегать к сложным системам очистки. Осадок клеток был

заморожен, затем ресуспендирован в рабочем буфере «В» (10 мM Tris-HCl, pH7.4;

MgCl

10 мM; ZnCl

1 мM ; EDTA 1 мM; β-меркаптоэтанол 1 мM; 0.1% Tween 20;

0.1% (v/v) Triton X100) с лизоцимом в концентрации 1мг/мл, после чего был

повторно заморожен при –70

C, что способствовало более полному и мягкому

разрушению клеточных структур для освобождения целевого продукта. После

данных манипуляций лизат клеток был прогрет в течение 45 мин. при 75

С и после

осаждения при центрифугировании в супернатанте присутствовал целевой белок в

достаточном количестве для изучения его ферментативной активности. Из

литературных источников известно, что наиболее высокую удельную активность

после лактозы фермент β-галактозидаза проявляет на бесцветном химическом

субстрате ОНФГ, который в её присутствии гидролизуется до галактозы и

окрашенного в желтый цвет

о-нитрофенила, количество которого можно измерить

на спектрофотометре по поглощению при 420 нм. Экстраполируя эти данные на

полученный химерный белок ДСД-сп-β-ГАЛ было решено изучить субстратную

специфичность и его ферментативную активность на хромогенном гомологе

лактозы - ОНФГ. При этом аликвоты супернатанта с нашим белком

инкубировались в присутствии ОНФГ (4 мг/мл)

в течение 15 мин. , 30 мин., 1 ч., 2

ч. при 25, 55 и 75

С, при широком диапазоне рН (4,5 – 9,0). В ходе развития

желтого окрашивания реакция прерывается добавлением инактиватора 1M Na

В каждой пробирке с соответствующим разведением белка измеряем оптическую



плотность при λ= 420 нм. Измеряемая величина складывается из поглощения о-

нитрофенола (420нм) и рассеяния света клетками (600нм) [100]. Используя эти

данные, можно вычислить истинное поглощение о-нитрофенола, или – в условных

единицах – активность фермента в 1мл раствора (α), по следующей формуле:



600

420

*1000

DVt





 (1)

где D

420

– измеренные значения для реакционной смеси, D

600

отражает плотность

клеточной суспензии перед определением, 1000 – из расчёта того, что при полной

индукции получается около 1000 ед. активности, t – время реакции в мин. и υ –

объём культуры, взятой для определения, в мл. Эта величина пропорциональна

увеличению количества о-нитрофенола в 1 мин. на одну бактериальную клетку

[

Craven G.R. et al., 1965]. Таким образом, была изучена удельная β-

галактозидазная активность белка ДСД-сп-β-ГАЛ в динамике, которая составила 5

ед.ак./мкл, при этом было доказано, что максимальная его активность сохранялась

в широком диапазоне рН, даже в ходе 2-х часовой инкубации при 75

С.

2.3. Хроматографическое выделение белка ДСД-сп-β-ГАЛ и изучение его

декстрансвязывающих свойств.

Данное исследование являлось чрезвычайно важным этапом работы, т.к. оно

позволило не только получить рекомбинантный белок ДСД-сп-β-ГАЛ в

препаративных количествах, но и изучить его декстрансвязывающие свойства. Для

планирования стратегии хроматографической очистки белка на ионообменниках

был необходим расчёт изоэлектрической точки и изучение аминокислотного

состава нашего белка. Изоэлектрическая точка

белковой конструкции была

определена посредством программы для обработки биоинформационных

последовательностей DNASIS v 2.5 Hitachi Software Endgineering Co., Ltd. и

находилась в пределах 5,54. Кроме того, данный пакет программ позволил

осуществить трансляцию нуклеотидной последовательности, что дало возможность

изучить аминокислотный состав полученного белка: положительнозаряженные

аминокислоты – Arg (R) – 4%; His (H) – 3,4%; Lys (K) – 6,8%;

отрицательнозаряженные аминокислоты – Asp (D) – 7,4%; Cys (C) – 1,0%; Glu (E) –

6,8%; Tyr (Y) – 5,9%.



2.3.1. Катионообменная хроматография

Выбор катионообменной хроматографии обусловлен достаточно высоким

содержанием в целевом белке положительнозаряженных аминокислотных

остатков. Ионообмен проводили на катионообменной смоле СМ-Toyopearl (Tosoh

Bioscience LLC). Элюированный градиентом соли (0 М - 1,0 М NaCl в рабочем

буфере) белок обессоливали посредством гельфильтрации на полистирольном

сорбенте HW50-Toyopearl (Tosoh Bioscience LLC) после чего он был осаждён

высаливанием с помощью 3M (NH

)

с последующим досаждением в поле

центробежных сил (10 мин., при 4000 об/мин). После измерения массы

полученного белкового осадка его растворяли в конечном буфере Buf.B (рН7,4), до

конечной концентрации 1 мг/мл.

2.3.2. Изучение декстрансвязывающих свойств целевого белка.

Рис.9 – Изменение оптической плотности (OD) от времени контакта сорбента с

раствором белка.

Сорбционную активность исследуемого белка по отношению к декстрану

проводили в статических условиях, для чего сорбент (декстран Sefhadex G75) в

количестве 0,5 г смешивали с 5 мл раствора белка в Buf.B, полученного после

катионообменной хроматографии (1,0 мг/мл). Сорбент оставляли в контакте с

раствором на 0,5-6,0 часа (37

С) при перемешивании. Затем, суспензию помещали

в микроколонку (100x10мм), продолжая инкубацию. При этом периодически

элюировали самотёком по 1 мл раствора через нижний штуцер микроколонки,

проводя определение содержания в пробах остаточного белка методом Бредфорд с



использованием калибровочных кривых [Bradford M.M., 1976]. OD растворов

изучали методом колориметрии по изменению оптической плотности при длине

волны 595 нм. На рис. 9. показана зависимость оптической плотности от времени

контакта образца сорбента с раствором белка, на графике видно, что оптическая

плотность исследуемых образцов (элюатов) со временем уменьшается, что говорит

о способности химерного белка, за счёт наличия в нём декстрансвязывающего

домена сорбироваться на декстране.

Рис. 10 – Изотерма адсорбции исследуемого белка.

Оптимальное время адсорбции белка составляет около 4-6 час. Дальнейшее

контактирование сорбента с раствором белка не дает существенных изменений

оптической плотности.

Адсорбционную емкость сорбентов определяли по формуле:

А=

СкСн





(2)

где С

– начальная концентрация белка в растворе, мг/л;

– конечная концентрация белка в растворе, мг/л;

m - навеска сорбента, г;

V - объем раствора белка, л.

Изотерма адсорбции образца белка, рассчитанная исходя из

экспериментальных данных показана на рис.10.



Степень связывания белка из раствора определяли по формуле:

σ =

%100



Сн

СкСн

(3)

Проведенные исследования показали, что степень связывания белка

декстраном составила σ ≈ 62%, что говорило о эффективности аффинного

связывания рекомбинантного белка ДСД-сп-

-ГАЛ с декстраном.

3. Изучение степени очистки белка ДСД-сп-

-ГАЛ посредством аффинной

хроматографии на декстране.

На колонку (100x10мм) с сорбентом (декстран Sefhadex G75)

уравновешенную Buf.B наносили 2 мл лизата клеток с белком. Сорбент оставляли в

контакте с лизатом на 4,0 часа (37

С). Затем, колонку отмывали от клеточного

дебриса тремя объёмами рабочего буфера, аффинно связавшийся на сорбенте белок

элюировали с колонки градиентом NaCl 0-3М.

При скорости элюирования 20 см

/ч проводили сбор фракций (λ = 250 нм).

Для выявления целевой фракции наносили по 12 мкл каждой на 12% ПААГ в

присутствии SDS с окраской по Кумасси. Далее, после объединения фракций с

максимальным количеством белка освобождались от NaCl при помощи

гельфильтрации. На следующем этапе белок концентрировали высаливанием до

концентрации 1мг/мл. На конечном этапе производилось сравнительное

исследование степени очистки белка в 10% ПААГ, после катионообменной и

аффинной хроматографии (рис.11).



Pис. 11. - Сравнение методов очистки

белка, в 12% ПААГ с SDS.

1. Штамм E. coli DH5a – индукция (2мкл),

2. Штамм DH5a [pGD10] – индукция,

после хроматографии на CM-Toyopearl, 3.

Штамм DH5a [pGD10] – индукция, после

аффинной хроматографии на декстране, 4.

Штамм E. coli DH5a – до индукции (4мкл).



Сравнительное исследование показало высокую константу связывания

химерного белка с декстраном в широком диапазоне ионной силы (0-3М NaCl), а

также преимущества tag-аффинной хроматографии на декстране над

катионообменной, т.к. степень очистки в первом случае составила 90%, что на 20-

25% выше, чем после катионообмена.

4. Сравнение зависимости ферментативной активности белков ДСД-сп-β-ГАЛ

и LacZThEh от времени, pH и температуры.

На данном этапе исследования, относительно положительного контроля, в

качестве которого выступала термостабильная бета-галактозидаза

Thermoanaerobacter ethanolicus (LacZThEh), были получены графические

зависимости активности очищенного рекомбинантного фермента ДСД-сп-β-ГАЛ от

таких физических характеристик как температура, время и рН среды (рис.12). При

этом, за 100% активности была принята активность бета-галактозидазы LacZThEh,

рассчитанная при 15 мин

. инкубации её с субстратом ОНФГ.

В опыте были определены зависимости активности ферментов от величины

pH, времени и температуры. При этом было установлено, что максимальная

активность фермента ДСД-сп-β-ГАЛ смещена относительно контроля в щелочную

область (LacZThEh ) и наблюдается в диапазоне pH 7,0 – 8,0. При этом 70% и более

активности сохранялось при рН 6,8- 8,2 (рис.12а.).