Автореферат диссертации - Разработка способа получения гибридной лактазы с помощью рекомбинантного штамма-продуцента

Подождите немного. Документ загружается.



Тип графической зависимости активности химерного фермента от его

температурного оптимума сходен с таковым у положительного контроля, однако

при этом, также наблюдается незначительное смещение линии графика

относительно контрольного фермента (LacZThEh).

При этом температурный оптимум полученной нами белковой конструкции

незначительно уступал контролю и варьировался в пределах 60 – 75

С (рис.12б.). В

соответствие с полученными данными, рекомбинантный белок ДСД-сп-β-ГАЛ, по

своей стабильности во времени, имел незначительные преимущества перед

контрольным образцом, сохраняя высокие показатели активности после 5-ти

часовой инкубации (при оптимальных для него условиях: 65-70

С; рН 7,4), однако

по прошествии этого периода, практически дублировал данные полученные для

контроля (рис.12в.).

5. Оптимизация условий получения комплекса декстрана и рекомбинантного

белка ДСД-сп-

-ГАЛ.

Завершающим этапом данной работы явилось создание модельной

колоночной системы для ферментации бета-галактозидов, на базе комплекса

декстрана и рекомбинантного белка ДСД-сп-

-ГАЛ.

Использование в составе химерной конструкции ДСД позволяет не только

эффективно выделить и очистить белок от примесей штамма продуцента, но и

иммобилизовать его на декстране посредством аффинного взаимодействия

декстрансвязывающего домена. Принимая в расчёт данные, полученные в



Pис. 13. - Анализ лактазной активности комплекса

декстрана и белка ДСД-сп-

-ГАЛ, посредством

тонкослойной хроматографии.

1. К1 (–) отрицательный контроль 1% лактоза, 2. К2

(–) отрицательный контроль 6% лактоза, 3. К1 (+)

положительный контроль смесь галактозы и

глюкозы 1%, 4. К2 (+) положительный контроль

смесь галактозы и глюкозы 6%, 5. Опытный образец

(лактоза (1%) + декстран-белковый комплекс), 6.

Опытный образец (лактоза (6%) + декстран-белковый

комплекс),



исследованиях, проведённых на предыдущих этапах, для исследований была

выбрана колонка (100x10мм), которая заполнялась сорбентом (декстран Sefhadex

G75) и уравновешивалась Buf.B. На колонку наносили 2 мл раствора белка

(1мг/мл), оставляя белок в контакте с сорбентом в течение 4,0 часов (37

С). Затем,

колонка отмывалась тремя объёмами рабочего буфера, который полностью

удалялся с последующим подсушиванием комплекса в колонке, после чего через

колонку с декстран-ферментным комплексом последовательно пропускались

растворы 1 и 6% лактозы, (t=60-65

С). Собранные элюаты с продуктами

расщепления лактозы оценивались посредством тонкослойной хроматографии

(ПТСХ-АФ-А-УФ "Merck") (рис.13). На следующем этапе через

расконсервированную колонку, при тех же условиях, были пропущены растворы

ОНФГ (0,4мг/мл) и Xgal (1мг/мл). После прохождения через декстран-белковый

комплекс, в ходе гидролиза хромогенных субстратов, образовывающийся в случае

ОНФГ - 2-

нитрофенол, окрашивал элюат и декстран в колонке в насыщенный

жёлтый цвет, в то время как накапливающийся в результате гидролиза Xgal - 5,5'-

дибром-4,4'-дихлор-индиго, придавал декстрану и элюату голубой оттенок.

Пропускание через колонку 50 объёмов раствора лактозы и ОНФГ при скорости

элюции 10 см

/ч и температуре 65

С не приводило к значительному снижению

эффективности ферментативного гидролиза бета-галактозидов, при этом значения

расчётной удельной активности в опытах приближались к первоначальному

уровню и в пересчёте на массу фермента в декстран-белковом комплексе

соответствовали 3-5 ед/мкг, это следовало из того расчета, что адсорбционная

ёмкость, исследованная ранее составляла 6,2 мг белка на 1г

сорбента, т.е., учитывая

реальный коэффициент гидратации сорбента (15-20 мл/г) - 0,2 – 0,4 мкг белка на 1

мкл водного декстрана. Также в процессе проведённых нами исследований была

рассчитана константа Михаэлиса-Ментен фермента в декстран-белковом

комплексе, составившая 9,5х10

-4

. Было установлено, что свободный химерный

белок за период десятичасовой инкубации при 65-70

С, рН 7,4 и оптимальном

ионном составе терял 50% своей активности, в то время как эта же белковая

конструкция, но иммобилизованная на декстране утрачивала лишь 5-10% своей

удельной активности. Таким образом, суммируя полученные данные тонкослойной

хроматографии и хромогенного проточного гидролиза можно говорить о том, что



полученный нами рекомбинантный химерный белок ДСД-сп-

-ГАЛ способен

оставаться в стабильном комплексе с декстраном и в течение длительного времени

осуществлять гидролиз различных бета-галактозидов.

По результатам настоящей работы нами были поданы две заявки на патент.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1) Разработан способ получения гибридного белка ДСД-сп-β-

ГАЛ,

отличающегося наличием аутентичной последовательности

декстрансвязывающего домена, объединённой через глицин-сериновый

спейсер с последовательностью термостабильной бета-галактозидазы

2) Сконструирована экспрессионная плазмида pGD-10, кодирующая химерный

белок ДСД-сп-β-ГАЛ.

3) Создан штамм E.coli [pGD-10] - продуцент белка ДСД-сп-β-ГАЛ.

Оптимизированы условия индукции и синтеза химерной белковой

конструкции, вследствие чего был достигнут уровень

экспрессии целевого

белка 10% от общего белка E. сoli.

4) Определены физико-химические показатели и удельная ферментативная

бета-галактозидазная активность гибридного белка ДСД-сп-β-ГАЛ.

5) Получен комплекс декстрана и белка ДСД-сп-β-ГАЛ, который может быть

использован в качестве компонентной базы для ферментативного гидролиза

различных бета-галактозидов в

пищевой промышленности и медицине.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ

1) Гришин Д.В. Характеристика термостабильных гистоноподобных белков из

разных биологических источников. В сб. тезисов: VI Молодёжной научной

конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и

ветеринарии», М., Россия, 5 апреля 2006, С 7-9.



2) Гришин Д.В. Разработка новой химерной белковой конструкции для

гидролиза бета-галактозидов // Антибиотики и химиотерапия. - 2009. - Т 54. -

С. 3-7.

3) Гришин Д.В., Никитин А.В. Перспективы профилактики и лечения синдрома

мальабсорбции // Антибиотики и химиотерапия. – 2009. - №3-4, С 49-51.

4) Гришин Д.В., Никитин А.В. Создание химерной белковой конструкции для

твердофазного гидролиза бета

-галактозидов и изучение её физико-химических

свойств // Естественные и технические науки. – 2009. - № 5, С 131-133.

5) Гришин Д.В., Никитин А.В., Бирюков В.В. Создание новой рекомбинантной

белковой конструкции для ферментативного гидролиза бета-галактозидов . В

сб. тезисов: XII Всероссийской молодежной школы-конференции по

актуальным проблемам химии и биологии, МЭС ТИБОХ, Владивосток, 7–14

сентября 2009,

С 17.