Журнал - Проблемы криобиологии 2010 №2

Подождите немного. Документ загружается.

117

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №2

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №2

длительного времени при гипотермии, а также при

криоконсервировании.

Сперматозоиды в процессе подготовки, охлажде-

ния, замораживания, оттаивания и осеменения под-

вергаются значительным колебаниям ионной силы

и осмотического давления внеклеточного окружения,

и их выживаемость в итоге зависит от того, как они

способны переносить резко изменяющиеся условия

на этапах низкотемпературного консервирования.

Осмотичность предложенных для криоконсервиро-

вания спермы птиц сред варьирует от 290 до

450 мОсмоль [2, 6, 13, 17, 32, 35–40]. Известно [31,

47], что оплодотворяющая способность спермиев

сохраняется in vitro в условиях гипотермии в защит-

ных средах с осмотичностью от 250 до 400 мОсмоль

( ∆ 0,455–0,736°С) в течение длительного времени,

начинает снижаться после 24 ч хранения. Поэтому

при разработке состава среды и оптимального соот-

ношения компонентов не следует выходить за преде-

лы этого диапазона, поскольку осмотичность являет-

ся одной из самых важных её физико-химических

характеристик. При криоконсервировании спермы

петуха оптимальное значение осмотичности криоза-

щитных сред находится в области гипертонии по

отношению к семенной плазме спермы и равно 395–

400 мОсмоль при рН 6,7 ± 0,5, оптимальное значение

ионной силы среды равно 0,200 ± 0,025 моль/л [13].

Криопротекторы. Вещества, которые обеспе-

чивают защиту сперматозоидов от действия низких

температур (–196°C), следует применять только при

криоконсервировании спермы, но не при гипотерми-

ческом хранении. Большинство используемых крио-

протекторов чужеродны и неиндифферентны по отно-

шению к клеткам. Повреждающее действие, которое

оказывают криопротекторы еще до замораживания,

существенно ограничивает их используемую кон-

центрацию и продуцирует криоповреждения на после-

дующих этапах криоконсервирования, следовательно,

снижает их криозащитную активность [14, 28]. Рас-

считано, что необходимая концентрация криопротек-

тора для эффективной криозащиты на коллигативной

основе должна быть не менее 2,9 М, при заморажи-

вании методом витрификации со скоростями охлаж-

дения, легко реализуемыми на практике, – не менее

5 М [13, 28]. Сперматозоиды не выдерживают таких

концентраций и гибнут прежде всего от осмотичес-

кого стресса. Реально применяемые концентрации

криопротекторов при криоконсервировании спермы

птиц не превышают 0,5–1,0 М [6, 13, 30]. Даже эти кон-

центрации криопротекторов не являются безопас-

ными, могут вызывать структурные и функциональ-

ные повреждения сперматозоидов (от 10 до 30 %) еще

на этапе инкубации до замораживания в зависимости

от ее продолжительности и температуры [14, 28].

content was manifold higher in avian sperm than in

sperm of other animals. Such high content of glutami-

ne in avian sperm is attributed to its participation in

many metabolic processes including energetic cycle.

Potassium acetate and citrate, magnesium and zinc

chlorides, which proved their efficiency, are also wi-

dely used components of media. Addition of the salts

indicated to media is sufficient for maintenance of

avian spermatozoa viability in vitro both for a long-

term hypothermic storage and upon cryopreservation.

Spermatozoa in the process of preparing, cool-

ing, freezing, thawing and inseminating are subjected

to significant fluctuations of extracellular environ-

ment ion force and osmotic pressure, and eventually

their survival depends on how well they are able to

endure drastically changing conditions at the stages

of low temperature preservation. Osmoticity of the

media suggested for cryopreservation of avian

sperm varies from 290 to 450 mOsmol [2, 6, 13, 17,

32, 35–40]. Fecundating ability of spermatozoa is

known [31, 47] to remain unchanged under hypo-

thermic conditions in vitro in protective media with

the osmocity from 250 to 400 mOsmol (∆0.455–

0.736°C) for a long time, then it starts decreasing

after 24-hour storage. That is why when media

compositions and optimal ratios of components being

elaborated, one should not fall outside the limits of

this diapason, since osmocity is one of the most im-

portant physico-chemical parameters of media. For

cryopreservation of the fowl sperm the optimal

values of cryoprotective media osmocity lie in the

range of 395–400 mOsmol, which is hypertonic

related to sperm plasma, at pH 6.7 ± 0.5, the optimal

value of ion force is 0.200 ± 0.025 mol/l [13].

Cryoprotectants. Substances protecting sperma-

tozoa against low temperature (–196°C) should be

applied for cryopreservation of sperm, but not for

hypothermic storage. Most of cryoprotectants in use

are alien and unindifferent for cells. Damaging im-

pact exerted by cryoprotectants already prior to

cryopreservation considerably limits their concen-

trations. It results in cryoinjuries at the following

stages of cryopreservation and, consequently redu-

ces their cryoprotective activity [14, 28]. The requi-

red concentration of a cryoprotectant was calcula-

ted to be not less than 2.9 M for efficient cryoprotec-

tion on the colligative basis, and not less than 5 M

upon vitrification at cooling rates easily achieved in

practice [13, 28]. Spermatozoa do not withstand such

concentrations and die first of all because of osmotic

stress. Cryoprotectants concentrations applied in

reality for cryopreservation of avian sperm do not

exceed 0.5–1.0 M [6, 13, 30]. Even these concen-

trations are not innocuous and can cause structural

118

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №2

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №2

На криозащитную активность для спермы птиц

испытаны десятки низкомолекулярных веществ,

относящихся к различным классам химических со-

единений – одноатомные и многоатомные спирты,

амиды, сульфоксиды, этаноламины, аминокислоты,

но широкое применение в птицеводстве получили не

более 5 соединений [2, 6, 10, 13, 22, 30, 32, 35–40, 44].

Разработаны и успешно применяются методы

замораживания-оттаивания спермы птиц (петухов,

гусей и уток) с алифатическими амидами в качестве

основного криопротектора, обеспечивающие вывод

молодняка на уровне 60–80% от числа заложенных

яиц [6, 8–13, 30, 43]. Но при этом после оттаивания

спермы приходится увеличивать количество клеток

в спермодозе и кратность осеменения. Следует от-

метить, что до сих пор не удается получить высокие

и стабильные результаты при криоконсервировании

спермы индюков [46, 47]. Уникальные физико-хими-

ческие свойства дизамещенных амидов (N,N -диме-

тилформамида, N,N-диметилацетамида), а именно:

способность к сильным гидрофильным и одновре-

менно к гидрофобным взаимодействиям, а также

высокая проницаемость внутрь клеток обуслов-

ливают их криозащитную активность [8, 13]. В боль-

шинстве стран с развитым птицеводством для крио-

консервирования спермы птиц продолжают приме-

нять традиционные криопротекторы: глицерин,

ДМСО, этиленгликоль, несмотря на существенные

недостатки каждого из них [30, 32, 35–39]. С ДМСО

и этиленгликолем не удается получать стабильно вы-

сокие результаты, оплодотворяемость яиц спермой,

замороженной с этими криопротекторами, не превы-

шает 50–60%. Глицерин оказывает на сперматозои-

ды птиц контрацептивное действие. Содержание

глицерина в криозащитной среде, даже в концентрации

1–3%, значительно снижает оплодотворяющую спо-

собность спермиев птиц [30]. Для сохранения высо-

кой оплодотворяющей способности сперматозоидов

его содержание в среде должно быть в 10–20 раз

ниже, чем применяемое при криоконсервировании

(10–15%). К тому же проницаемость глицерина через

мембрану сперматозоидов самая низкая по сравне-

нию с другими криопротекторами. Поэтому техноло-

гия замораживания-оттаивания спермы птиц с глице-

рином сложная: применяют многоступенчатое вве-

дение в суспензию клеток во избежание осмоти-

ческого стресса, а главное – обязательное его удале-

ние перед осеменением.

Для снижения цитотоксического действия крио-

протекторов на этапе подготовки спермы к замора-

живанию лучше вводить их только в растворе сред.

Прибавление веществ в чистом виде нежелательно,

так как экзотермический эффект их смешивания с

водой, составляющей основную часть суспензий

клеток, может приводить к локальным перегревам,

повышать температуру инкубации и вызывать пов-

and functional injuries of spermatozoa (from 10 to

30%) already at the incubation stage prior to freez-

ing depending on the incubation duration and tempe-

rature [14, 28].

Dozens of low-molecular substances belonging

to different chemical groups – monoatomic and

polyatomic alcohols, amides, sulfoxides, ethanol ami-

nes, amino acids were tested for cryoprotective acti-

vity on avian sperm, but not more than 5 compounds

became widely used in poultry industry [2, 6, 10, 13,

22, 30, 32, 35–40, 44].

Methods for freeze-thawing of avian (fowl,

goose, duck) sperm with aliphatic amides as a basic

cryoprotectant were developed. They are applied

successfully and provide hatching of offspring on the

level of 60–80% related to the number of the eggs

laid [6, 8–13, 30, 43]. However, the cell number in

a sperm dose and number of insemination events

within a week have to be increased after thawing

sperm. It should be noted that high and stable yield

of cryopreservation of the turkey sperm is still bey-

ond attainment [46, 47]. Unique physico-chemical

properties of disubstituted amides (N,N-dimethyl

formamide, N,N-dimethyl acetamide), namely capa-

city for strong both hydrophilic and hydrophobic

interactions as well as high permeability into cells

precondition their cryoprotective activity [8, 13]. In

most countries with advanced poultry industry they

continue to apply traditional cryoprotectants for cryo-

preservation of avian sperm: glycerol, Me

SO, ethy-

lene glycol despite significant disadvantages of each

of them [30, 32, 35–39]. Neither Me

SO nor ethyle-

ne glycol gives steadily good results, the rate of fer-

tilisation of ovicells with sperm frozen with these

cryoprotectants does not exceed 50–60%. Glycerol

exerts an contraceptive effect on avian spermatozoa.

Glycerol even at the concentration of 1–3% in a

cryoprotective medium reduces avian spermatozoa

fecundating ability [30]. To maintain spermatozoa

fecundating ability high enough glycerol content in

medium must be 10–20 times as little as that applied

for cryopreservation (10–15%). Besides, glycerol

permeability through spermatozoon membrane is the

lowest as compared to other cryoprotectants. That

is why the technology of avian sperm freeze-thaw-

ing with glycerol is complicated, multi-step introduc-

tion is used lest osmotic stress occur, and it is impe-

rative that it should be removed before insemination.

It is better to add cryoprotectants only in media

solutions to decrease their cytotoxic impacts. It is

undesirable to add pure substances, as exothermic

effect from their mixing with water, which is the

major portion of cell suspensions, can lead to local

overheating, increase incubation temperature and

cell injuries. It is necessary to make the duration of

the contact of cryoprotectants with cells at all of the

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №2

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №2

119

реждение клеток. Необходимо сократить до миниму-

ма продолжительность контакта криопротекторов с

клетками на всех этапах цикла криоконсервирования,

включающего подготовку спермы к замораживанию,

время от начала кристаллизации внеклеточной среды

и до исчезновения жидкой фазы, интервал с момента

оттаивания и до введения в репродуктивный тракт

самок. Прибавление и инкубацию сперматозоидов с

криопротекторами (кроме глицерина) до заморажи-

вания следует проводить при околонулевых темпера-

турах.

Существует еще один способ снижения цитоток-

сичности криопротекторов, применяемый для замо-

раживания биологических объектов методом витри-

фикации, а именно: использование смеси разных

крипротекторов, эффективность которого доказана

[1, 30]. При этом снижается концентрация отдельных

криопротекторов в суспензии клеток, следовательно,

уменьшается их повреждающее действие. При

подборе смеси рекомендуется использовать сочета-

ние веществ с различной структурой и физико-хими-

ческими свойствами. Идеальными для этого яв-

ляются дизамещенные амиды и диолы, так как они

относятся к высокогидрофильным веществам, обра-

зуют сильные водородные связи с молекулами воды,

превосходящими по энергии связь вода-вода. Но при

этом амиды являются акцепторами протонов, дио-

лы – донорами, вязкость водных растворов амидов

в несколько раз ниже, чем в растворах диолов. В силу

этого амиды и диолы по-разному влияют на процесс

кристаллизации внеклеточного раствора и предотв-

ращают внутриклеточную кристаллизацию, губи-

тельную для акросом сперматозоидов. Амиды и дио-

лы относятся к проникающим криопротекторам, но

скорость и механизм их диффузии через мембрану

клеток отличаются. Дифильность дизамещенных

амидов обеспечивает сверхбыструю проницае-

мость в клетку. Их транспорт через мембрану осу-

ществляется преимущественно через липидный би-

слой, и только около 20% проникает через белковые

водные каналы (белок полосы 3 и акваглицеропо-

рины). В то время как для диолов доминирующим пу-

тем диффузии в клетку является гидрофильный – по

белковым водным каналам [5]. Используя смесь

амидов и диолов в составе криозащитных сред, мож-

но существенно сократить время насыщения спер-

матозоидов криопротекторами до замораживания и

не удалять их из суспензии перед осеменением.

Непроникающие криопротекторы, как правило

водорастворимые полимеры, самостоятельно для

криоконсервирования спермы птиц не применяются,

используются только в композиции с проникающими.

Добавление в криозащитную среду полимера (в

частности ПВП с м. м. 12000) оказывает положи-

тельное действие, но только в смеси с криопротек-

торами, водные растворы которых имеют очень

cryopreservation stages, including preparation of

sperm for freezing, the time between extracellular

medium nucleation and liquid phase disappearance

and period from the thawing moment to injection of

sperm into female germ tracks, as short as possible.

Addition of cryoprotectants (except glycerol) and

incubation of spermatozoa with them prior to free-

zing should be carried out at subzero temperatures.

There is another way of reducing cryoprotectants

cytotoxicity applied for freezing bioobjects by vitri-

fication, namely using mixtures of different cryopro-

tectants. The efficiency of this method was proved

[1, 30]. Herewith concentration of each cryopro-

tectant in cell suspension is decreased, therefore

their damaging impacts are weakened. It is recom-

mended to use combinations of substances with

different structures and physico-chemical properties.

Disubstituted amides and diols are ideal for these

purpose, as they are referred to highly hydrophilic

substan-ces, form strong hydrogen bonds with water

mole-cules energetically exceeding water-water

bonds. At the same time amides are acceptors of

protons, diols are donors; amide aqueous solution

viscosity is several times as little as diol solution vis-

cosity. By virtue of this amides and diols affect

crystallisation of extracellular solution in different

manner and prevent intracellular crystallisation lethal

for spermatozoa acrosomes. Amides and diols be-

long to penetrating cryoprotectants, but rates and

mechanisms of their diffusion through cell membra-

nes differ. Diphility of disubstituted amides provides

their super-rapid penetration into cells. Their trans-

membrane transport is realised predominantly

through lipid bilayer, and only about 20% penetrate

through protein water channels (protein of band 3

and aquaglyceroporins), while for diols the domina-

ting way of diffusion is a hydrophilic one, through

protein water channels [5]. Using mixtures of ami-

des and diols in cryoprotective media, one can signi-

ficantly reduce the time of saturation of spermatozoa

with cryoprotectants prior to freezing without re-

moving them from suspension before insemination.

Non-penetrating cryoprotectants, which, as a

rule, are water-soluble polymers, are not used for

cryopreservation of avian sperm alone, but only in

combination with penetrating ones. Adding a polymer

to a cryoprotective medium (in particular PVP with

the molecular weight of 12,000) exerts a positive

effect, but only in combinations with cryoprotec-

tants, which aqueous solutions have very low visco-

sity at subzero temperatures. Usage of polymers

allows considerable increasing in extracellular me-

dium viscosity as temperature declines, therefore

active influencing “water-ice” phase transition. It is

known [13] that water-soluble polymers are good

modifiers of crystal formation. Nevertheless their

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №2

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №2

120

низкую вязкость при температурах около 0°С. Ис-

пользование полимеров позволяет существенно

повысить вязкость внеклеточной среды при снижении

температуры, следовательно, активно влиять на

фазовый переход "вода-лед". Известно [13], что

водорастворимые полимеры являются хорошими

модификаторами кристаллообразования льда. Но

положительный эффект полимеров наблюдается

только при очень низких концентрациях (0,1–0,3%),

что обусловлено, возможно, их дестабилизирующим

влиянием на мембраны сперматозоидов при более

высоком содержании в среде.

Таким образом, применяемые в настоящее время

защитные среды, разработанные на основе вышеопи-

санных принципов их создания, позволяют сохранять

сперму птиц in vitro при положительных темпера-

турах и в глубокозамороженном состоянии без

утраты основной функции сперматозоидов – оплодо-

творяющей способности. Но поиск эффективных

криозащитных сред продолжается, так как до сих пор

не удается успешно криоконсервировать сперму

некоторых видов птиц, например индюков.

positive effects are only observed at very low con-

centrations, which is likely to be attributed to their

destabilising influence on spermatozoid membranes

at higher concentrations in media.

Thus applied at present cryoprotective media

developed on the ground of the principles above-

described allow in vitro storage of avian sperm at

positive temperatures and in deeply-frozen state

without loss in the main function of spermatozoa:

fecundating ability. But search for efficient cryopro-

tective media continues, since successful cryopre-

servation of sperm for some avian species (e.g.

turkey) still posses a challenge.

Литература

Бизикина О.В., Линник Т.П. Криоконсервирование спер-

мы петухов. III. Цитотоксичность и криопротекторная

активность смеси N,N-диметилформамида с диолами //

Пробл. криобиологии.– 2002.– №1.– С. 39–44.

Борончук Г.В. Специфика изменений физиолого-биохи-

мических реакций в процессе криоконсервации спермы

различных видов животных и разработка методов

повышения ее криорезистентности: Автореф. дис. ... д-ра

биол.наук.– Кишинев, 1998.– 36 с.

Броерский А.В. Криоконсервация спермы с/х птицы.

(Обзор иностранной литературы) // С.-х. биология.–

1989.– №2.– С. 33–39.

Епифанова О.И., Терских В.В., Полуновский В.А.

Покоящиеся клетки. Свойства и функции в организме.–

М.: Наука, 1983.– 176 с.

Коваленко Г.В., Коваленко И.Ф., Линник Т.П. Проницае-

мость мембран эритроцитов крысы и кролика для крио-

протекторов ряда амидов и диолов // Пробл. криобио-

логии.– 2007.– Т. 17, №4.– С. 365–373.

Курбатов А.Д., Платов Е.М., Корбан Н.В. Криоконсер-

вация спермы с/х животных.– Л.: Агропромиздат, 1988.–

256 с.

Линник Т.П., Терещенко А.В., Артеменко А.Б. Влияние

белковых добавок к криозащитной среде на сохранность

спермиев петухов при криоконсервировании // Пробл.

криобиологии.– 1996.– №2.– С. 35–39.

Линник Т.П. Амиды алифатических кислот – эффектив-

ные криопротекторы. I. Физико-химические свойства

соединений ряда амидов // Пробл. криобиологии.– 1998.–

№3.– С. 21–28.

Линник Т.П. Амиды алифатических кислот – эффектив-

ные криопротекторы. II. Криозащитные свойства сое-

динений ряда амидов // Пробл. криобиологии.– 1999.–

№2.– С. 22–32.

Линник Т.П., Грищенко В.И., Артеменко А.В., Терещен-

ко А.В. Влияние осмотичности криозащитной среды на

сохранность спермиев петухов при криоконсервиро-

вании // Проблемы криобиологии.– 2000.– №2.– С. 86–93.

Литература

Bizikina O.V., Linnik T.P. Fowl sperm cryopreservation. III

Cytotoxicity and cryoprotective activity of N,N-dimethyl

formamide with diol mixtures // Problems of Cryobiology.–

2002.– N1.– P. 39–44.

Boronchuk G.V. Specifics of changes in physiology-

biochemical reactions in the process of cryopreservation of

different animals species' sperm and elaboration of methods

for enhancing its cryoresistance: Author's abstract of the

thesis of Doctor of Biological Sciences.– Kishinyov, 1998.–

36 p.

Broyersky A.V. Cryopreservation of poultry sperm (Review

of foreign literature) // Selskokhozyaystvennaya Biologiya.–

1989.– N2.– P. 33–39.

Yepifanova O.I., Terskikh V.V., Polunovsky V.A. Quescent

cells. Properties and functions in the organism.– Moscow:

Nauka, 1983.– 176 p.

Kovalenko G.V., Kovalenko I.F., Linnik T.P. Membrane

permeability of rat's and rabbit's erythrocytes for cryopro-

tectants of amide and diol series // Problems of Cryobiology.–

2007.– Vol. 17, N4.– P. 365–373.

Kurbatov A.D., Platov Ye. M., Korban N.V. Cryopreservation

of farmery animals' sperm.– Leningrad: Agropromizdat, 1988.–

256 p.

Linnik T.P., Tereschenko A.V., Artemenko A.B. Effect of

protein additives in cryoprotective medium on the integrity of

rooster spermatozoa at cryopreservation // Problems of

Cryobiology.– 1996.– N2. - P. 35-39.

Linnik T.P. Amides of aliphatic acids are effective cryopro-

tectants. I. Physical-chemical properties of the compounds

out of the amide series // Problems of Cryobiology.– 1998.–

N3.– P. 21–28.

Linnik T.P. Amides of aliphatic acids are efficient cryopro-

tectants. II. Cryoprotective properties of compounds of amide

series compounds // Problems of Cryobiology.– 1999.– N2.–

P. 22–32.

Linnik T.P., Grischenko V.I., Artemenko A.B. et al. Effect of

osmoticity of cryoprotective medium on survival of cock sperm

during cryopreservation // Problems of Cryobiology.– 2000.–

N2.– P. 86–93.

Linnik T.P., Bizikina O.V. Fowl sperm cryopreservation. I.

Cytotoxicity of diols and amides // Problems of Cryobiology.–

2001.– N2.– P. 72–79.

Linnik T.P., Bizikina O.V. Fowl sperm cryopreservation. II.

Amide and diol cryoprotective activity // Problems of

Cryobiology.– 2001.– N4.– P. 43–51.

Linnik T.P. Physical and chemical factors of cryodamage

and cryoprotection of fowl spermatozoa in cycle of low

temperature preservation: Author’s abstract of the thesis of

Doctor of Biological Sciences.– Kharkiv, 2003.– 36 p.

10.

11.

12.

13.

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №2

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №2

121

Линник Т.П., Бизикина О.В. Криоконсервирование

спермы петухов. I. Цитотоксичность диолов и амидов //

Пробл. криобиологии.– 2001.– №2.– С. 72–79.

Линник Т.П., Бизикина О.В. Криоконсервирование спер-

мы петухов. II. Криозащитная активность диолов и ами-

дов // Пробл. криобиологии.– 2001.– №4.– С. 43–51.

Ліннік Т.П. Фізико-хімічні фактори кріопошкоджень і

кріозахисту сперматозоїдів півнів у циклі низькотемпера-

турного консервування: Автореф. дис. … докт. біол.

наук.– Харків, 2003.– 36 с.

Линник Т.П., Бизикина О.В. Цитотоксичность и криопро-

текторная aктивность диолов, амидов и их смесей при

криоконсервировании спермы петухов // Биофизика

живой клетки.– 2003.– Т. 7.– С. 42–49.

Максудов Г.Ю., Артюшкова В.А. Физиологическая кон-

сервация спермы позвоночных.– Пущино: ОНТИ ПНЦ АН

СССР, 1989.– 73 с.

Мелехов Е.И. О возможном принципе регуляции повреж-

дений и защитной реакции клетки // Журнал общей биоло-

гии.– 1983.– Т. ХLIV, №3.– С. 386–397.

Милованов В.К. Биология воспроизводства и искус-

ственного осеменения животных.– М.: Сельхозиздат,

1962.– 696 с.

Наук В.А. Структура и функция спермиев с/х животных

при криоконсервировании.– Кишинев: Штиинца, 1991.–

199 с.

Наук В.А., Борончук Г.В., Ротт Н.Н. Длительное сох-

ранение спермы сельскохозяйственных и диких живот-

ных // Консервация генетических ресурсов.– Пущино,

1991.– С. 35–81.

Осташко Ф.И. Глубокое замораживание и длительное

хранение спермы производителей.– Киев: Урожай.–

1978.– 225 с.

Райцина С.С. Сперматогенез и структурные основы его

регуляции.– М.: Наука, 1985.– 206 с.

Сахацкий Н.И., Терещенко А.В., Артеменко А.Б. и др.

Разработка защитной среды для консервации спермы

петухов // Научно-техн. бюл. УкрНИИП, Харьков.– 1988.–

Вып. 24.– С. 29–32.

Терещенко А.В. Сохранность сперматозоидов петухов

в зависимости от условий криоконсервирования: Авто-

реф. дис. ... канд.биол.наук.– Харьков,1988.– 16 с.

Шергин Н.П. Биохимия сперматозоидов сельскохозяйст-

венных животных.– М.: Колос, 1967.– 232 с.

Ashizawa K., Okauchi K. Stimulation of sperm motility and

oxygen consumption of fowl spermatozoa by a low molecular

weight fraction of seminal plasma // J. Reprod. Fertil.– 1984.–

Vol. 71, N3.– P. 593–598.

Bakst M.R. Anatomical basis of sperm-storage in the avian

oviduct // Scanning Microsc.– 1987.– Vol. 1, N4.– P. 1257–

1266.

Bellagamba F., Cerolini S., Cavalchini L.G. Cryopreservation

of poultry semen: a review // World's Poultry Sc. J.– 1993.–

Vol. 49, N2.– P. 157–166.

Fahy G. M., Lilley T. H., Lindsell H. et al. Cryoprotectant

toxicity and cryoprotectant toxicity redaction: in search of

molecular mechanisms // Cryobiology.– 1990.– Vol. 27, N3.–

P. 247–268.

Fujihara N., Koga O. Factor(s) influencing the survival of

cock spermatozoa in vitro // Can. J. Anim. Sc.– 1982.–

Vol. 62.– P. 951–953.

Hammersedtt, R.H., Graham, J.K. Cryopreservation of poul-

try pserm: The enigma of glycerol // Cryobiology.– 1992.–

Vol. 29, N1.– P. 26–38.

Latif A., Ijaz A., Aleem M., Mahmud A. Effect of osmotic

pressure and pH on the short-term storage and fertility of

broiler breeder sperm // Pakistan Vet. J.– 2005.– Vol. 25, N4.–

P. 179–182.

Lake P.E. The history and future of the cryopreservation of

avian germ plasm // Poultry Sc.– 1986.– Vol. 65, N1.– P. 1–15.

Linnik T.P., Bizikina O.V. Cytotoxicity and cryoprotective

activity of diols, amides and their mixtures upon cryopreserva-

tion of fowl sperm // Biofizika Zhivoy Kletki.– 2003.– Vol. 7.–

P. 42–49.

Maksudov G.Yu. Artyushkova V.A. Physiological preservation

of vertebrates' sperm.– Pusschino: Pushchino Scientific

Centre of Academy of Sciences of USSR, 1989.– 73 p.

Melekhov Ye.I. A possible principle for regulation of cell injuries

and protective reactions // Zhurnal Obschey Biologii.– 1983.–

Vol. XLIV, N3.– P. 386–397.

Milovanov V.K. Biology of reproduction and artificial inse-

mination of animals.– Moscow: Selkhozizdat, 1962.– 696 p.

Nauk V.A. Structure and functions of farmery animals sperma-

tozoa upon cryopreservation.– Kishinyov: Shtiintsa, 1991.–

199 p.

Nauk V.A., Boronchuk G.V., Rott N.N. Long-term storage of

farmery and wild animals' sperm // Preservation of Genetic

Resources.– Pushchino, 1991.– P. 35–81.

Ostashko F.I. Deep freezing and long-term storage of

breeders' sperm.– Kiev: Urozhay, 1978.– 225 p.

Raytsina S.S. Spermatogenesis and structural principles of

its regulation.– Moscow: Nauka, 1985.– 206 p.

Sakhatsky N.I., Tereschenko A.V., Artementko A.B. et al.

Elaboration of a protective medium for preservation of

roosters' sperm // Scientific and Technical Bulletin of Ukrainian

Scientific Research Institute for Ecological Problems, Khar-

kov.– 1988.– Issue 24.– P. 29–32.

Tereschenko A.V. Fowl spermatozoa integrity depending on

cryopreservation conditions: Author's abstract of the thesis

of Candidate of Biological Sciences.– Kharkov, 1988.– 16 p.

Shergin N.P. Biochemistry of farmery animals' spermatozoa.–

Moscow: Kolos, 1967.– 232 p.

Ashizawa K., Okauchi K. Stimulation of sperm motility and

oxygen consumption of fowl spermatozoa by a low molecular

weight fraction of seminal plasma // J. Reprod. Fertil.– 1984.–

Vol. 71, N3.– P. 593–598.

Bakst M.R. Anatomical basis of sperm-storage in the avian

oviduct // Scanning Microsc.– 1987.– Vol. 1, N4.– P. 1257–1266.

Bellagamba F., Cerolini S., Cavalchini L.G. Cryopreservation

of poultry semen: a review // World's Poultry Sc. J.– 1993.–

Vol. 49, N2.– P. 157–166.

Fahy G. M., Lilley T. H., Lindsell H. et al. Cryoprotectant

toxicity and cryoprotectant toxicity redaction: in search of

molecular mechanisms // Cryobiology.– 1990.– Vol. 27, N3.–

P. 247–268.

Fujihara N., Koga O. Factor(s) influencing the survival of

cock spermatozoa in vitro // Can. J. Anim. Sc.– 1982.–

Vol. 62.– P. 951–953.

Hammersedtt, R.H., Graham, J.K. Cryopreservation of poul-

try pserm: The enigma of glycerol // Cryobiology.– 1992.–

Vol. 29, N1.– P. 26–38.

Latif A., Ijaz A., Aleem M., Mahmud A. Effect of osmotic

pressure and pH on the short-term storage and fertility of

broiler breeder sperm // Pakistan Vet. J.– 2005.– Vol. 25, N4.–

P. 179–182.

Lake P.E. The history and future of the cryopreservation of

avian germ plasm // Poultry Sc.– 1986.– Vol. 65, N1.– P. 1–15.

Lamirande E., Jiang H., Zini A.et al. Reactive oxygen and

sperm physiology // Rev. Reprod.– 1997.– Vol. 2, N1.– P. 48–

54.

Leibo S.P., Bradley L. Comparative cryobiology of mamma-

lian spermatozoa // The male gamete: from basic science to

clinical applications / Ed. by C. Gagnon.– St. Louis: Cache

River Press, 1999.– P. 502–516.

Sexton T. J. A new poultry semen extender. 1. Effect of

extension on fertility of chicken semen // Poultry Sc.– 1977.–

Vol. 56, N6.– P. 1443–1446.

Sexton T. J. A new poultry semen extender. 3. Effect of

storage conditions on the fertilizing capacity of chicken semen

stored at 5°C // Poultry Sc.– 1978.– Vol. 57, N1.– P. 285– 289.

11.

12.

13.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

14.

15.

16.

17.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

24.

25.

26.

27.

28.

29.

30.

31.

32.

33.

34.

35.

36.

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №2

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №2

122

Lamirande E., Jiang H., Zini A.et al. Reactive oxygen and

sperm physiology // Rev. Reprod.– 1997.– Vol. 2, N1.– P. 48–

54.

Leibo S.P., Bradley L. Comparative cryobiology of mamma-

lian spermatozoa // The male gamete: from basic science to

clinical applications / Ed. by C. Gagnon.– St. Louis: Cache

River Press, 1999.– P. 502–516.

Sexton T. J. A new poultry semen extender. 1. Effect of

extension on fertility of chicken semen // Poultry Sc.– 1977.–

Vol. 56, N6.– P. 1443–1446.

Sexton T. J. A new poultry semen extender. 3. Effect of

storage conditions on the fertilizing capacity of chicken semen

stored at 5°C // Poultry Sc.– 1978.– Vol. 57, N1.– P. 285– 289.

Sexton T.J. A new poultry semen extender.5. Relationship of

diluent components to cytotoxic effects of dimethylsulfoxide

on turkey spermatozoa // Poultry Sc.– 1980.– Vol. 59, N5.–

P. 1142–1144.

Sexton T. J., Fewlass T.A. A new poultry semen extender. 2.

Effects of the diluent components on the fertilizing capacity

of chicken semen stored at 5°C // Poultry Sc.– 1978.– Vol. 57,

N1.– P. 277–284.

Sexton T. J., Jacobs L.A., McDaniel G.R. A new poultry

semen extender. 4. Effects of antibacterial in the control of

bacterial contamination in chicken semen // Poultry Sc.–

1980.– Vol. 59, N1.– P. 274–281.

Schramm G.P. Ein neues Medium zur Verdünnung und

Flüssigkonservierung von Hahnensperma // Monatsh.

Veterinärmed.– 1982.– Vol. 37, N3.– S. 900–902.

Storey B.T., Noiles E.E., Thompson K.A. Comparison of

glycerol, other polyols, trehalose, and raffinose to provide a

defined cryoprotectant medium for mouse sperm cryopreser-

vation // Cryobiology.– 1998.– Vol. 37, N1.– P. 46–58.

Sztein J.M., Noble K., Farley J.S., Mobraaten, L.E. Compa-

rison of permeating and nonpermeating cryoprotectants for

mouse sperm cryopreservation // Cryobiology.– 2001.– Vol.

41, N1.– P. 28–39.

Tselutin K., Narubina L., Mavrodina T., Tur B. Cryopreser-

vation of poultry semen // Brit. Poultry Sc.– 1995.– Vol. 36,

N1.– P. 805–811.

Watanabe M., Terada T. Fertility of frozen fowl semen stored

for long term (9years) // Journal of the Faculty of Applied

Biological Science Hiroshima University Fukuyama, Japan.–

1980.– Vol. 19, N2.– P. 155–159.

Watson P.F. Recent developments and concepts in the

cryopreservation of spermatozoa and the assessment of

their post-thawing // Reprod. Fertil. Dev.– 1995.– Vol. 7, N2.–

P. 871–891.

Watson P.F., Holt W.V. Cryobanking the genetic resource:

Wildlife conservation for the future?.– London, New York,

2001.– 423 p.

Wishart G.J. The cryopreservation of germplasm in domestic

and non-domestic birds // Cryobanking the genetic resource:

Wildlife conservation for the future? / Ed. by P.F. Watson,

W.V. Holt.– London, New York, 2001.– P. 181–200.

Woelders H., Matthijs A., Engel B. Effects of trehalose and

sucrose, osmolality of the freezing medium, and cooling rate

on viability and intactness of bull sperm after freezing and

thawing // Cryobiology.– 1997.– Vol. 35, N1.– P. 93–105.

Поступила 06.04.2010

Рецензент Л.Ф. Розанов

Sexton T.J. A new poultry semen extender.5. Relationship of

diluent components to cytotoxic effects of dimethylsulfoxide

on turkey spermatozoa // Poultry Sc.– 1980.– Vol. 59, N5.–

P. 1142–1144.

Sexton T. J., Fewlass T.A. A new poultry semen extender. 2.

Effects of the diluent components on the fertilizing capacity

of chicken semen stored at 5°C // Poultry Sc.– 1978.– Vol. 57,

N1.– P. 277–284.

Sexton T. J., Jacobs L.A., McDaniel G.R. A new poultry

semen extender. 4. Effects of antibacterial in the control of

bacterial contamination in chicken semen // Poultry Sc.–

1980.– Vol. 59, N1.– P. 274–281.

Schramm G.P. Ein neues Medium zur Verdünnung und

Flüssigkonservierung von Hahnensperma // Monatsh.

Veterinärmed.– 1982.– Vol. 37, N3.– S. 900–902.

Storey B.T., Noiles E.E., Thompson K.A. Comparison of

glycerol, other polyols, trehalose, and raffinose to provide a

defined cryoprotectant medium for mouse sperm cryopreser-

vation // Cryobiology.– 1998.– Vol. 37, N1.– P. 46–58.

Sztein J.M., Noble K., Farley J.S., Mobraaten, L.E. Compa-

rison of permeating and nonpermeating cryoprotectants for

mouse sperm cryopreservation // Cryobiology.– 2001.– Vol.

41, N1.– P. 28–39.

Tselutin K., Narubina L., Mavrodina T., Tur B. Cryopreser-

vation of poultry semen // Brit. Poultry Sc.– 1995.– Vol. 36,

N1.– P. 805–811.

Watanabe M., Terada T. Fertility of frozen fowl semen stored

for long term (9years) // Journal of the Faculty of Applied

Biological Science Hiroshima University Fukuyama, Japan.–

1980.– Vol. 19, N2.– P. 155–159.

Watson P.F. Recent developments and concepts in the

cryopreservation of spermatozoa and the assessment of

their post-thawing // Reprod. Fertil. Dev.– 1995.– Vol. 7, N2.–

P. 871–891.

Watson P.F., Holt W.V. Cryobanking the genetic resource:

Wildlife conservation for the future?.– London, New York,

2001.– 423 p.

Wishart G.J. The cryopreservation of germplasm in domestic

and non-domestic birds // Cryobanking the genetic resource:

Wildlife conservation for the future? / Ed. by P.F. Watson,

W.V. Holt.– London, New York, 2001.– P. 181–200.

Woelders H., Matthijs A., Engel B. Effects of trehalose and

sucrose, osmolality of the freezing medium, and cooling rate

on viability and intactness of bull sperm after freezing and

thawing // Cryobiology.– 1997.– Vol. 35, N1.– P. 93–105.

Accepted in 06.04.2010

33.

34.

35.

36.

37.

38.

39.

40.

41.

42.

43.

44.

45.

46.

47.

48.

37.

38.

39.

40.

41.

42.

43.

44.

45.

46.

47.

48.

123

* Автор, которому необходимо направлять корреспонденцию:

ул. Переяславская, 23, г. Харьков, Украина 61015; тел.: (+38

057) 373-41-35, факс: (+38 057) 373-30-84, электронная почта:

cryo@online.kharkov.ua

* To whom correspondence should be addressed: 23,

Pereyaslavskaya str., Kharkov, Ukraine 61015; tel.:+380 57 373

4135, fax: +380 57 373 3084, e-mail: cryo@online.kharkov.ua

Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the Na-

tional Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, Ukraine

Институт проблем криобиологии и криомедицины

НАН Украины, г. Харьков

УДК 577.112:576.8

А.К. ГУЛЕВСКИЙ, Л.И. РЕЛИНА*

Белки-нуклеаторы бактериального происхождения.

Сообщение II. Структура белков и их гены

UDC 577.112:576.8

A.K. GULEVSKY, L.I. RELINA*

Ice-Nucleating Proteins of Bacterial Origin.

Report II. Structure of Proteins and Their Genes

В обзоре проанализированы современные данные о нуклеаторах белковой природы бактерий и кодирующих их генах.

Рассмотрены основные гипотезы и модели пространственной организации белков-нуклеаторов. Приведены сведения о природе

и роли небелковых компонентов бактериальных нуклеаторов.

Ключевые слова: нуклеирующая активность, белки-нуклеаторы, гены белков-нуклеаторов, бактерии, кристаллизация.

В обзорі проаналізовано сучасні дані щодо нуклеаторів білкової природи бактерій та генах, які їх кодують. Розглянуто

основні гіпотези та моделі просторової організації білків-нуклеаторів. Наведено відомості про природу і роль небілкових

компонентів бактеріальних нуклеаторів.

Ключові слова: нуклеююча активність, білки-нуклеатори, гени білків-нуклеаторів, бактерії, кристалізація.

The modern data on bacterial proteinaceous nucleators and their encoding genes are analized in the review. The main hypotheses

and models of nucleating protein three-dimensional structure are discussed. The information on the nature and role of non-proteinaceous

components of bacterial nucleators is presented.

Key words: nucleating activity, nucleating proteins, nucleating protein genes, bacteria, crystallization.

Freeze-resistant organisms have gotten adaptive

mechanisms aimed at staying alive upon ice crystal

formation in the evolutionary process. Ice nucleation

activity is one of the means to protection of the orga-

nism from freezing. Ice-nucleating bacteria are able

to nucleate ice formation in water at temperatures

above –10°С [23]. Bacterial nucleation is attributed to

lipoglycoprotein complexes that serve as a template

for ice crystal formation [10].

Genes encoding proteinaceous components of

nucleating structures were cloned and sequenced. Ice-

nucleating protein (INP) genes from Pseudomonas

syringae are referred as inaZ [32], Pseudomonas

fluorescens as inaW [3], Erwinia uredovora as inaU

[31], Erwinia ananas as inaA [1], Pseudomonas

borealis as inaPb [43] and from Erwinia herbicola

as inaE [10]. Plasmids containing these genes turn

Escherichia coli into an ice-nucleating bacterium [10,

32]. The inaE, inaA and inaW genes demonstrated

80, 76 and 75% homology to the inaZ gene, respectively

[1, 39, 40]. The inaPb gene was also revealed to be

conspicuously similar to the other INP genes [43].

Genomic DNA from Pseudomonas antarctica did not

hybridize with the inaZ gene [28]. Presumably INP

from P. antarctica has a unique primary structure

which can account for the difference between the cell-

free ice-nucleating material from this bacterium and

nucleators from other bacterial species [28].

Устойчивые к замерзанию организмы в процес-

се эволюции выработали адаптационные механиз-

мы, направленные на обеспечение выживания при

образовании кристаллов льда. Лёдонуклеирующая

активность является одним из средств защиты

организма при замерзании. Бактерии, обладающие

лёдонуклеирующей активностью, способны ини-

циировать процесс ледообразования в воде при

температурах выше –10°С [23]. Бактериальная ну-

клеация обусловлена наличием липогликопротеид-

ных комплексов, которые служат матрицей для об-

разования кристалла льда [10].

Гены белковых компонентов нуклеирующих

структур были клонированы и секвенированы. Гены

белков-нуклеаторов (БН) Pseudomonas syringae

принято обозначать inaZ [32], Pseudomonas

fluorescens – inaW [3], Erwinia uredovora – inaU

[31], Erwinia ananas – inaA [1], Pseudomonas

borealis – inaPb [43] и Erwinia herbicola – inaE

[10]. Плазмиды, содержащие эти гены, превра-

щают Escherichia coli в лёдонуклеирующую бак-

терию [10, 32]. Гены inaE, inaA и inaW обнару-

живают 80, 76 и 75% гомологии с inaZ соответ-

ственно [1, 39, 40]. У гена inaPb также выявлено

явное родство с другими генами БН [43]. ДНК

Pseudomonas antarctica не гибридизуется с inaZ

[28]. Предположительно ее БН имеет уникальную

первичную структуру, которая может быть причи-

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №2

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №2

124

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №2

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №2

ной отличий внеклеточного нуклеирующего мате-

риала из этого вида бактерий от нуклеаторов из

других видов бактерий [28].

Для продуктов этих генов характерны молеку-

лярная масса 120–180 кДа и сходная первичная

структура [12, 25]. Хотя, исходя из первичной по-

следовательности гена inaZ, его продукт должен

состоять из 1200 аминокислотных остатков и иметь

молекулярную массу 120 кДа, в полиакриламидном

геле (ПААГе) он мигрирует как белок с молекуляр-

ной массой 155 кДа [42]. Это возможно обусловлено

посттрансляционной модификацией полипептида

[20, 37], что вызывает особый интерес, так как

небелковые компоненты нуклеирующих структур

играют ключевую роль для проявления нуклеи-

рующей активности. Другие авторы считают, что

такое отличие молекулярных масс объясняется

уникальным поведением данного полипептида в

ПААГе [42]. Большая удельная доля серина, трео-

нина и глицина в первичной последовательности мо-

жет быть причиной аномально низкого сродства к

додецилсульфату натрия. Кроме того, возможно,

что форма этого белка значительно отличается от

глобулярной и, следовательно, он не полностью

денатурирован в условиях электрофореза. Продукт

другого гена inaW имеет молекулярную массу

180 кДа [3]. Ген inaU кодирует белок, состоящий

из 1034 аминокислотных остатков. Этот белок

содержит фрагмент из 832 аминокислотных остат-

ков с 52 повторами из высокогомологичных мотивов

по 16 аминокислотных остатков (R-домен), который

фланкирован N- и С-концевыми последова-

тельностями (N- и С-домены соответственно) [25,

31]. Анализ последовательности продукта гена

inaPb показал, что он должен состоять из двух

плоских доменов, расположенных напротив друг

друга [43]. Один из доменов относительно

гидрофобен и, вероятно, служит матрицей для

формирования решетки кристалла льда, а другой -

может функционировать как комплементарная

поверхность при белково-белковых взаимодейст-

виях для образования агрегатов.

Посттрансляционная модификация полипеп-

тидов заключается в ковалентном присоединении

липидных и углеводных компонентов. Прежде

всего, этот вывод основывается на аналогии с

"якорными" системами эукариотических клеток,

где гидрофобные жирные кислоты фосфатидилино-

зитола встроены в клеточную мембрану, при этом

инозитол связан с остатком глюкозамина, который,

в свою очередь, связывается с маннаном, а по-

следний прикрепляется к полипептиду через этано-

ламиновый остаток [4, 22]. Тем не менее нуклеи-

рующие структуры могут иметь иной состав, по-

скольку бактериальные "якорные" системы не

идентичны эукариотическим. Например, этанол-

Products of these genes have molecular masses of

120–180 kDa and a similar primary structure [12, 25].

Although the inaZ gene specifies a structure containing

1,200 amino acid residues and a molecular mass of

120 kDa, the isolated protein had an apparent mass on

polyacrylamide gel (PAGE) electrophoresis of about

155 kDa [42]. This can be due to posttranslational ad-

dition of other components [20, 37], which is of consi-

derable importance, since non-proteinaceous compo-

nents of nucleating structures appear to be critical in

ice nucleation activity. Other authors suggest that this

discrepancy in the molecular masses is accounted by

a unique behaviour of this polypeptide in PAGE [42].

The large amounts of serine, threonine and glycine in

the sequence may lead to an anomalously low affinity

for SDS. Finally, this protein may be highly non-globular

and not fully denaturated under the conditions of

electrophoresis. The product of another gene, inaW,

has a molecular mass of 180 kDa [3]. The inaU gene

encodes a protein of 1,034 amino acid residues. This

protein has an 832-amino acid residue segment

consisting of 52 repeats of closely related 16-amino

acid motifs (R-domain), flanked by N- and С-terminal

sequences (N- and С-domains, respectively) [25, 31].

Sequence analysis of the protein encoded by the inaPb

gene suggests that there are two opposite flat surfaces,

one relatively hydrophobic that likely serves as an ice

template, and the other that could function as a comp-

lementary face to facilitate inter-protein interactions

for aggregate formation [43].

Posttranslational modification of polypeptides invol-

ves covalent attachment of lipid and carbohydrate

components. Foremost, this conclusion is grounded on

analogy to the anchoring system in eukaryotic cells, in

which the hydrophobic fatty acids of phosphatidyl-

inositol are imbedded in the cell membrane and the

inositol is bound to a glucosamine residue, which in

turn is linked to a complex mannan that in turn is linked

to the protein via an ethanolamine residue [4, 22].

Nevertheless, nucleating structures can have a different

composition, since the bacterial anchoring system is

not identical to those on eukaryotic cells. For example,

ethanolamine is not a metabolite as such in bacteria,

although it can be formed from phosphatidylserine, and

glucosamine cannot play the same role in bacterial cells

as it does in eukaryotic ones [37]. The pathways of

formation of the anchored structure also differ. In ice-

nucleating bacteria the anchoring elements appear to

be added sequentially to the protein, whereas in

eukaryotic cells the anchoring system is built on

phosphatidylinositol in the membrane and the protein

is attached last. Phosphatidylinositol was proved to be

a necessary component of class A nucleating agents.

Phospholipase СІІ, a lipase which specifically hydro-

lyzes phosphatidylinositol to produce diacylglycerol and

inositol trisphosphate [41], reduces the nucleation

125

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №2

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №2

амин не является метаболитом у бактерий, хотя

он может производиться из фосфатидилсерина;

глюкозамин также не может играть такую же роль

в бактериальных клетках, что и у эукариот [37].

Пути формирования "якорных" систем также отли-

чаются. У нуклеирующих лед бактерий элементы

"якорной" системы, по-видимому, последовательно

присоединяются к белку, тогда как у эукариот

"якорная" система строится на фосфатидилино-

зитоле в мембране, а белок прикрепляется по-

следним. Практически доказано, что фосфатидил-

инозитол является необходимым компонентом

нуклеирующих агентов класса А. После обработки

их фосфолипазой СІІ, которая специфично гидроли-

зирует фосфатидилинозитол с образованием диа-

цилглицерола и инозитолтрифосфата [41], исчезает

нуклеирующая активность [37]. Экспериментально

установлено, что при добавлении в среду радиоак-

тивного предшественника фосфатидилинозитола

Н-инозитола, он включается в БН с молекулярной

массой 210 кДа у P. syringae [37]. Кроме того,

установлено, что добавление ионов Mn

, необходи-

мого кофактора фосфатидилинозитолсинтазы, сти-

мулирует образование нуклеирующих структур

класса А у P. syringae в 7 раз. При этом на актив-

ность структур класса С ионы Mn

не влияли [20].

Можно считать доказанным присутствие ман-

нана в составе структур класса А. После обработки

их N- и О-гликаназами, предпочтительной ми-

шенью которых являются гликопротеиды, содержа-

щие маннозу, исчезает нуклеирующая активность

структур класса А [20]. Фосфолипаза СІІ также

преимущественно разрушает маннансодержащие

комплексы. Аналогичные результаты получены и

при использовании α- и β-маннозидаз [19]. Приме-

нение радиоактивно меченной

Н-маннозы под-

твердило заключение о важности маннана для

формирования нуклеирующих структур [37]. На

примере P. syringae было продемонстрировано, что

Н из маннозы ковалентно связан с белками с

молекулярной массой 200 и 210 кДа, которые, как

было доказано методом иммуноблоттинга, принад-

лежат к БН.

Вопрос присутствия глюкозамина в составе нук-

леирующих структур и его роли в их функциони-

ровании остается открытым. Добавление глюкоз-

амина в культуральную среду несколько увеличи-

вает нуклеирующую активность, однако методом

радиоавтографии с использованием

Н-глюкоза-

мина получен отрицательный результат, так как не

было обнаружено включения этого вещества в по-

лосы, соответствующие БН [37].

В белковой составляющей нуклеирующих аген-

тов выделяют 3 домена:

1. Уникальный N-концевой домен (составляет

~15% от всей последовательности) является отно-

activity [37]. When a radiolabelled precursor of

phosphatidylinositol, [

Н]inositol was added to the

medium, it was incorporated in INP of 210 kDa in

P. syringae [37]. Besides, the addition of Mn

, a

required cofactor for the activity of phosphatidylinositol

synthase, was found to greatly (sevenfold) stimulate

the formation of class A nucleating structures in P.

syringae. At the same time the formation of class C

activity was unaffected [20].

The presence of mannan in class A structures is

considered to be confirmed. N- and О-glycanase, both

of which preferentially attack mannose-rich proteins,

destruct class A activity [20]. Phospholipase СІІ also

preferentially attacks mannan-containing complexes.

Analogous results were also obtained after α- and β-

mannosidase treatment [19]. Usage of radiolabelled

[

Н]mannose confirmed the conclusion about the im-

portance of mannan in nucleating structure formation

[37]. As exemplified by the study of INP from P. syrin-

gae

Н from mannose was covalently bound to proteins

of 200 and 210 kDa and these labelled proteins belong

to INPs, which was detected by immunoblotting.

The issue about the presence of glucosamine in

nucleating structures and its role in their functioning

remains open. The addition of glucosamine only slightly

improves the ice nucleation activity, however radio-

authography with [

Н]glucosamine gave a negative

result, showing no incorporation of the precursor into

the bands corresponding INP [37].

3 domains are distinguished in the proteinaceous

component of nucleating agents:

1. A unique N-terminal domain (~15% of total se-

quence) is relatively hydrophobic and contains the

membrane anchor with mannan-phosphatidylinositol for

the attachment of INP to the membrane. Despite all

the known INPs are either located on the outer

membrane or secreted into the culture medium, none

of them has a signal sequence of 15 to 70 amino acid

residues at the N-terminus, which pulls molecules

through the membrane and is typical for other proteins

transported through membranes to places of perfor-

ming their functions [14]. Michigami et al. reported

that after INP first assembled around the inner mem-

brane, the assembly enters a vesicle just forming on

the surface of the outer membrane and thus leaves

the cell to be shed with its INP [24]. This process is

ATP-dependent [17].

2. A unique C-terminal domain (~4% of total

sequence) is very hydrophilic, as it is rich in basic re-

sidues. The carboxyl end is likely to extend into the

medium. There is no evidence that this primary terminal

structure is modified [19].

3. A central repeating R-domain (~80% of total

sequence) is also hydrophilic and characterised by

contiguous repeats of a consensus octapeptide Ala-

Gly-Tyr-Gly-Ser-Thr-Leu-Thr. The product of the

126

problems

of cryobiology

Vol. 20, 2010, №2

проблемы

криобиологии

Т. 20, 2010, №2

сительно гидрофобным и содержит "якорь", с

помощью которого БН прикрепляется к мембране.

К "якорю" присоединены маннан и фосфоинозитол.

Несмотря на то, что все известные БН либо лока-

лизуются с внешней стороны мембраны, либо

выделяются в культуральную среду, ни один из них

не обладает сигнальной последовательностью в

области N-концевого домена, длина которой обыч-

но варьирует от 15 до 70 аминокислотных остатков,

а ее функция заключается в транспорте молекулы

через мембрану, что присуще другим белкам,

проходящим через мембраны к "месту выполнения

своих обязанностей" [14]. Michigami et al. устано-

вили, что после сборки БН с внутренней стороны

мембраны комплекс входит в везикулу, формирую-

щуюся в это время с внешней стороны, и таким

образом покидает клетку [24]. Этот процесс яв-

ляется АТФ-зависимым [17].

2. Уникальный С-концевой домен (составляет

~4% от всей последовательности) сильно гидрофи-

лен, так как богат основными остатками аминокис-

лот. По-видимому, С-концевой домен выступает во

внешнее пространство, и он не модифицирован [19].

3. Центральный R-домен (составляет ~80% от

всей последовательности) также гидрофилен и

характеризуется наличием непрерывных октапеп-

тидных повторов Ala-Gly-Tyr-Gly-Ser-Thr-Leu-Thr.

Продукт гена P. syringae содержит 122 октапептид-

ных повтора [10]. Делеционный анализ показал, что

большая часть повторов не является необходимой

для функционирования белка. Без полного исчезно-

вения нуклеирующей активности может быть

удалено до 68 повторов, хотя все делеции приводили

к снижению нуклеирующей активности. Это

указывает на то, что повторяющиеся пептидные

звенья индивидуально влияют на процесс нуклеа-

ции, действуя как отдельные единицы матрицы для

связывания молекул воды.

Очевидный кандидат на сайты связывания с

сахарами (маннозой, глюкозамином или N-ацетил-

глюкозамином, и, возможно, галактозой и галактоз-

амином) это область повторов. Существует рас-

хождение в молекулярных массах между кодируе-

мым последовательностью ДНК белковым продук-

том (120 кДа) и наблюдаемой при электрофорезе в

ПААГе массой БН (170 кДа) из P. syringae. Прини-

мая во внимание остатки одного серина и двух

треонинов в каждом из 132 октапептидных повторов

центрального домена, имеется 396 потенциальных

сайтов связывания с ОН-группами, так что сайтов

для присоединения как углеводов-мономеров, так

и олигосахаридов вполне достаточно для объясне-

ния избыточной массы белка. Инозитол в качестве

компонента фосфатидилинозитола прикрепляется

через мананновый комплекс, содержащий α- и β-

связанные остатки маннозы (и, возможно, остаток

P. syringae gene comprises 122 octapeptide repeats

[10]. Deletion analysis showed that most regions of

the repeating structure were not essential for function.

Up to 68 octapeptides could be deleted without

abolishing ice nucleation, but all the deletion mutants

showed reduced activity. This indicates that the

repeated peptides contribute individually to the

nucleation process, as expected if they act as individual

units of a water-binding array.

The repetitive portion is the likely site for the addition

of sugars, such as mannose, glucosamine or N-

acetylglucoseamine, and very possibly galactose and

galactosamine. The molecular mass discrepancy from

the DNA sequence to that on PAGE for P. syringae

is 120 kDa versus the observed 170 kDa. Given one

serine and two threonine residues for the 132 apparent

repeating octapeptides of the central domain, there are

about 396 potential OH-binding sites, so there are

enough binding sites for single sugars as well as for

oligosaccharides to add the additional mass. There is

attachment of inositol of phosphatidylinositol via a

mannan complex containing both α- and β-linked man-

nose residues (and possibly a glucosamine residue) to

the highly conserved asparagine residues in positions

14, 15 and 43 on the N-terminal end [19]. Green et al.

[9] showed that deletions from the amino terminus of

the first 46 codons (or longer deletions), all of which

deleted strictly conserved asparagine residues, abo-

lished most of the class A and class B activities (down

by about 1,000-fold). At the same time some class C

activity was left in the mutants with the same deletions.

On the other hand, the mutants containing deletions in

the carbonyl-terminal region still had measurable class

A and class B activities, although they were noticeably

decreased as compared to the class C activity, which

practically remained on the level typical for the wild

type values. It should be pointed out that deletions and

duplications disrupting the periodicity in the repetitive

region significantly affected nucleating agents active

at warm temperatures (class A). In contrast, when

the periodicity was left intact, mutations in this region

had only slight effects on nucleation activity. Herewith

even large deletions in the non-repetitive amino-

terminal domain did not abolish nucleation activity, but

caused it to be limited to cooler threshold temperatures

(class C activity). In contrast, deletions in the non-

repetitive C-terminal domain were shown to conside-

rably reduce ice nucleation activity at all temperatures.

This attests to the necessity both of the amino- and

carboxyl-terminal ends for maximum ice nucleation

activity at the warmest temperatures.

Kozloff et al. [19] outlined a tentative path for the

posttranslational modification of the product of the inaZ

gene that suggests step-by-step conversion of the class

C structures to class B and then to the most efficient

class A structures (Fig. 1).