Тихонов В.В. Участие дождевых червей и бактерий в модификации биологических и химических свойств гумусовых веществ

Подождите немного. Документ загружается.

На правах рукописи

Тихонов Владимир Владимирович

УЧАСТИЕ ДОЖДЕВЫХ ЧЕРВЕЙ И БАКТЕРИЙ В

МОДИФИКАЦИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ И ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ГУМУСОВЫХ ВЕЩЕСТВ

Специальности

03.02.03 – микробиология

03.02.13 – почвоведение

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

г. Москва 2011

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения

Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научные руководители: доктор биологических наук, ведущий

научный сотрудник

Б.А. Бызов

кандидат биологических наук, старший

научный сотрудник

В.В. Демин

Официальные

оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

С.Н. Чуков

доктор биологических наук, профессор

А.В. Кураков

Ведущее учреждение: Институт физико-химических и

биологических проблем почвоведения

Российской Академии Наук

Защита диссертации состоится 18 октября 2011 в 15 часов 30 минут в

аудитории М-2 на заседании Диссертационного Совета Д 501.002.13 при

МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, ГСП-1,

Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке факультета

почвоведения МГУ.

Автореферат разослан «____»_________________2011 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Г.М. Зенова

Актуальность

Структура и состояние микробного ценоза почвы могут эффективно

регулироваться беспозвоночными животными (Бызов, 2003; Тиунов, 2007), в

частности, дождевыми червями. Масштабы трансформации среды могут быть

весьма значительны. Черви за сезон способны переработать до 25% гумусово–

аккумулятивного горизонта (Lee, 1985). В процессе прохождения почвы через

кишечный тракт червя происходит разрушение органического вещества,

протекают процессы гумификации (Фроуз

и др., 2011). Червей рассматривают

как «инженеров экосистем», создателей особых физических свойств субстрата

(Persson, Lohm, 1977; Petersen, Luxton, 1982). Известно, что вермикомпосты

более полезны для растений, нежели просто компосты (Norman et al., 2006).

Считается, что черви в первую очередь улучшают физические свойства почв

(Тиунов, 2007), однако исследования биохимических изменений субстратов под

действием червей остаются малоизученной областью.

Гумификация – второй по значимости процесс в биосфере после

фотосинтеза (Перминова, 2008). Взаимодействуя с живыми организмами,

гумусовые вещества в малых количествах подавляют (Ansorg, 1978; Pascual et

al., 2002; Loffredo et al., 2007; Steinberg et al., 2006) или стимулируют (Бирюков,

2006; Vallini et al., 1997; Gryndler, 2005) рост организмов. Они способны

защищать живые клетки от токсического воздействия природных и

антропогенных соединений (Бирюков, 2006; Fafa, Piccolo 2002; Vacca et al.,

2002). С одной стороны, гумусовые вещества (ГВ) регулируют процессы

питания и развития растений (Христева, 1951; Чуков, 2001; Попов, 2004), с

другой, сами могут служить источником питания, в частности, для

микроорганизмов (Кудрина, 1951; Теппер, 1972). Они трансформируются

естественными микробными сообществами (Filip, Berthelin, 2001; Filip, Kubat,

2001). Молекулярная масса гуминовых кислот является одним из параметров, с

которым коррелирует их биологическая активность (Vaughan, Malcolm, 1985;

Nardi et al., 2002). Таким образом, ГВ могут входить в сложную систему

взаимодействия между микроорганизмами и дождевыми червями, выполняя

некоторую регуляторную роль в субстратах.

Цель

Выявление особенностей воздействия дождевых червей и бактерий на

свойства гумусовых веществ.

Задачи

1. Установить оптимумы действия гуминовых кислот на рост бактерий разных

таксономических групп.

2. Измерить уровень сорбции из раствора гуминовых кислот различными

бактериями и оценить их протекторную функцию при действии ядов.

3. Оценить роль червей в изменении свойств и биологической активности

гуминовых кислот.

4. Определить действие модифицированных червями гуминовых кислот на рост

бактерий.

Научная новизна

Бактерии, ассоциированные с пищеварительным трактом дождевых

червей, способны расти на гуминовой кислоте как на единственном источнике

углерода. На 185 штаммах почвенных и кишечных бактерий показано

отсутствие ингибирования их роста гуминовыми кислотами в концентрациях

близких природным (50 мкгС/мл), у 40 % протестированных бактерий

обнаружена стимуляция роста. Отработана методика определения количества

гуминовой кислоты, сорбируемой из раствора бактериями. Количество

сорбируемой гуминовой кислоты варьирует для различных бактерий и

составляет десятые доли проценты от сырой биомассы бактерий. При пассаже

гуминовых кислот через пищеварительный тракт дождевых червей происходит

уменьшение молекулярной массы ГВ. В присутствии червей молекулярная

масса гумусовых веществ в субстратах падает, как в результате разрушения ГВ,

так и в результате осаждения и образования новых высокомолекулярных

фракций. Действие стерильной кишечной жидкости дождевых червей

Aporrectodea caliginosa уменьшает молекулярную массу исходной ГК.

Модифицированные червями гумусовые вещества изменяют скорость роста

бактерий на различных субстратах. В компостах и вермикомпостах

присутствуют низкомолекулярные биологически активные соединения,

которые в концентрациях 0,15 – 0,2 мкгС/мл также могут влиять на рост

отдельных штаммов.

Практическая значимость

Работа расширяет возможности применения гуминовых препаратов.

Гуминовые кислоты могут быть использованы при стимуляции роста бактерий

с полезными для биотехнологии свойствами, например, деструкторов нефти и

нефтепродуктов. Результаты исследований по сорбции гуминовых кислот

бактериями могут быть применены при разработке регламентов и технологий

по очистке водоемов от органических примесей. Материалы работы могут быть

использованы в лекционных курсах и практических занятиях по биологии,

экологии и почвенной зоологии, а также по зоомикробным взаимодействиям и

химии гуминовых веществ как задачи для практических занятий.

Апробация работы

Результаты исследований были представлены на V съезде

Всероссийского общества почвоведов им. В.В. Докучаева (Ростов-на-Дону,

2008), на XV – XVIII Международных научных конференциях студентов,

аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2008 – 2011), на XV

Всероссийском совещании по почвенной зоологии (Москва, 2008), на V

Всероссийской конференции «Гуминовые вещества в биосфере» (Санкт-

Петербург, 2010), на II Международной конференции «Вермикомпостирование

и вермикультивирование как основа экологического земледелия в ХХI веке –

проблемы, перспективы, достижения» (Минск, 2010), на Всероссийской

научной конференции XIV «Докучаевские молодежные чтения» (Санкт-

Петербург, 2011) и на заседаниях кафедры биологии почв факультета

почвоведения МГУ.

Публикации

По результатам исследования опубликовано 12 работ, из них 2

экспериментальные статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК,

10 статей и тезисов в материалах международных и российских конференций.

Объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и

методов исследовании, результатов экспериментов, выводов и списка

литературы. Материалы диссертации изложены на ___ страницах текста,

содержат__ рисунков и ___ таблиц. Список литературы включает__источник, в

том числе___на иностранном языке.

Автор выражает благодарность Добровольской Т.Г., Завгородней Ю.А.,

Лопатиной А.В., Якушеву А.В., Федию В.С. и Орлову Д.С. за помощь в

проведении анализов и обсуждении результатов.

Объекты и методы

Почвы, компосты и вермикомпосты

В работе использовали: дерново-подзолистую почву (Лесная опытная дача

МСХА имени К. А. Тимирязева, смешанный лес, 0 – 20 см); чернозем

выщелоченный (Воронежская обл., 200-летняя залежь, 0 – 20 см);

шестимесячные компосты из конского навоза с соломой и компосты из навоза

крупного рогатого скота; вермикомпосты после 3 месяцев инкубации с

червями.

Черви

В опытах использовались компостные черви Eisenia fetida andrei (Bouche,

1972) породы «Русский Московский гибрид», предоставленные ООО

«РОСТАГРОЭКОЛОГИЯ» (пос. Пирогово), и почвенные черви Aporrectodea

caliginosa (Sav.), выделенные из окультуренной дерново-подзолистой почвы.

Гуминовые кислоты

В экспериментах использовали гуминовую кислоту из бурого угля (ГКу),

выделенную из коммерческого образца гумата (ТУ 211-06-18-94, сырье –

сильно выветренный бурый уголь Канско-Ачинского угольного бассейна); 2)

гуминовую кислоту из выщелоченного чернозема (ГКч); 3) гумат калия из

низинного торфа (коммерческий препарат фирмы «Флексом»); 4) гуминовую

кислоту из торфа фирмы «Merck» (ГКт); 5) гуминовую кислоту из

белоподзолистой почвы (ГКб). Все ГК очищали от органо-минеральных

примесей (Орлов, 1981). Модифицированные гуминовые кислоты (ГКм)

получали путем инкубации ГКт в нестерильных условиях. ГКт смешивали с

песком и инкубировали в присутствии червей, либо без них в течение 2

месяцев. Затем производили экстракцию ГКм 0,1 н Na-фосфатным буфером

(pH=7) либо из копролитов, либо из среды, где инкубировались черви. Перед

экспериментами все гуминовые препараты стерилизовались фильтрацией через

мембранный фильтр 0,22 мкм (Millipore).

Микроорганизмы

В работе по изучению действия ГКу на рост были использованы чистые

культуры бактерий, любезно предоставленные Т.Ю. Нечитайло (Department of

Environmental Microbiology, HZI –Helmholtz Centre for Infection Research, 38124

Braunschweig, Germany). Культуры были ранее выделены из дерново-

подзолистой почвы из очищенных от пищевого субстрата пищеварительных

трактов дождевого червя A. caliginosa (Москва, Ботанический сад МГУ).

Идентификацию бактерий производили с помощью ПЦР-амплификации генов

16S рРНК с последующим секвенированием ампликонов и анализом данных,

как описано ранее (Хомяков, 2007). Всего исследовали 170 штаммов бактерий

(81 штамм из почвы и 89 из пищеварительных трактов червей).

В работе по изучению действия ГКч на рост микроорганизмов были

использованы штаммы бактерий, выделенные из выщелоченного чернозема.

Бактерии выделялись на средах для олиго- и копиотрофных микроорганизмов

(Семенов, 1991).

Действие ГКч также тестировали на широком круге грамотрицательных

бактерий, выделенных из дерново-подзолистой почвы и на бактериях Bacillus

cereus и Bacillus lentus-firmus, любезно предоставленных Т.Г. Добровольской

(кафедра биологии почв, МГУ).

Бактерия Acinetobacter baumannii выделена из нефтеразрушающего

российского препарата «Дестройл» (ООО ПО "СИББИОФАРМ") на среду R2A.

Бактерии из компостов, вермикомпостов и пищеварительной жидкости A.

caliginosa выделяли на модифицированную среду Сабуро (Difco

Sabouraud

Agar, Modified, США) и идентифицировали путем секвенирования фрагментов

бактериальной 16S рДНК с последующим филогенетическим анализом.

Рост бактерий исследовали на 96-луночном микропланшетном фотометре

(Tecan Sunrise) при 620 нм, изменение обилия фиксировали по изменению

мутности раствора (Перт, 1978). Для описания роста микроорганизмов

использовали параметры логистического уравнения вида:











max

где t – время, час, D - оптическая плотность в данный момент времени, D

–

оптическая плотность в начальный момент, R

max

– максимальная удельная

скорость роста, час

-1

, D

max

– максимальная оптическая плотность в ячейке.

Воздействие гуминовой кислоты на клетки определяли по изменению R

max

. В ряде случаев рассчитывали среднюю оптическую плотность за весь

период измерения.

Молекулярные массы гумусовых веществ определяли методом

эксклюзионной хроматографии высокого давления на хроматографе Agilent

1100 (Agilent Technologies, США) с диодно-матричным детектором и системой

обработки данных ChemStation, LCChem. Параметры хроматографического

процесса: колонка TSK-2000SW 7,5 × 60 (Tosoh Bioscience, Япония), объем

пробы 100 мкл, элюент 0,1 М Na-фосфатный буфер (рН=7) + 1 г/л

додецилсульфата натрия, скорость потока элюента 0,75 мл/мин, длины волн

сканирования 280 и 465 нм.

Калибровку колонки проводили с использованием

смеси глобулярных белков с молекулярными массами 12500−65000 Да

(Pharmacia, Швеция). Средневесовые и среднечисловые молекулярные массы

ГВ рассчитывались стандартным методом (Рабек, 1983).

Определение растворимых соединений азота и углерода в экскретах червей

проводили в жидких пробах на анализаторе VARIO liquiTOC trace (Elementar,

Германия). Углерод и азот в твердых образцах определяли на элементном

анализаторе VARIO EL III (Elementar, Германия).

Кишечную жидкость A. caliginosa получали, как описано ранее (Хомяков и

др., 2007).

Результаты и обсуждение

Гуминовые кислоты как источник углерода и биологически активные вещества

Многие почвенные бактерии и бактерии, выделенные из

пищеварительного тракта червей, были способны расти на среде с гуминовой

кислотой из бурого угля в качестве единственного источника углерода. На

гуминовой кислоте росли 56 (63%) почвенных и 59 (73%) кишечных штаммов,

причем кишечные бактерии росли быстрее (Табл.1). Коэффициент r

max

характеризующий максимальную удельную скорость роста, в

экспоненциальной фазе роста, для кишечных бактерий равен 0,033±0,003, а для

почвенных 0,021±0,002. Установлено, что возможность использовать

гуминовую кислоту - это штаммоспецифичный признак (Табл.1). Для бактерий

кишечника червей это показано впервые.

Таблица 1. Бактерии, способные (+) и неспособные (-) к росту на гуминовой кислоте как на

единственном источнике углерода. Дано количество протестированных штаммов

Почвенные бактерии + - Бактерии, ассоциированные

с пищеварительными трактами

червей

+ -

Aminobacter aminovorans 3 0 Acinetobacter spp. 4 0

Agromyces spp. 2 0 Aeromonas spp. 12 4

Arthrobacter spp. 2 2 Bacillus spp. 2 0

Bacillus spp. 16 8 Buttiauxella spp. 3 2

Kocuria palustris 3 5 Chryseobacterium spp. 2 0

Nocardioides spp. 2 3 Delftia acidovorans 1 4

Pseudomonas spp. 9 1 Microbacterium sp. 3 2

Rhodococcus spp. 1 0 Ochrobactrum grignonense 1 0

Sphingopyxis spp. 1 1 Paenibacillus sp. 1 0

Streptomyces spp. 1 3 Pseudomonas spp. 9 3

Microbacterium sp. 0 1 Shewanella sp. 0 1

Oxalobacter sp. 0 1 Rhodococcus sp. 0 1

Неопределенные штаммы 16 8 Неопределенные штаммы 21 5

При добавлении гуминовой кислоты в питательную среду, содержащую

источник углерода в виде глюкозы, 40% протестированных бактерий росло

быстрее, и конечное обилие их также возрастало по сравнению с вариантом без

гуминовой кислоты. Причем бактерии из кишечника росли быстрее, и конечное

обилие их было больше, почвенных вероятно из-за того, что кишечные

бактерии являются r-стратегами (Рис. 1)

Рис.1. Рост

кишечных (А) и

почвенных (Б)

бактерий в

присутствии

гуминовой кислоты

(0,1 мг/мл) в среде

Чапека с

концентрацией

глюкозы 1 мг/мл.

1 – с гуминовой

кислотой, 2 – без

гуминовой кислоты

Стимулирующий эффект от ГКу был одинаковым для почвенных и

кишечных бактерий. Стимулирующее действие гуминовой кислоты также

проявляется на штаммовом уровне. Псевдомонады из пищеварительных

трактов червей достигали большего обилия, чем псевдомонады из почвы при

росте на среде с ГКу. Протестировано 170 штаммов, не выявлено ни одного

случая подавления роста бактерий гуминовой кислотой в концентрации 0,1 мг/

мл (Табл. 2).

Таблица 2. Рост бактерий, выделенных из почвы и пищеварительных трактов червей

Aporrectodea caliginosa, на среде Чапека с добавлением гуминовой кислоты из бурого угля

(0,1 мг/мл). Дано количество штаммов, испытывающих стимулирующее действие (+) и

отсутствие действия (0)

Почвенные бактерии + 0

Бактерии, ассоциированные

с пищеварительными трактами

червей

+ 0

Agromyces spp.

1 1

Acinetobacter spp. 0 4

Aminobacter vorans

3 0

Aeromonas spp. 6 10

Arthrobacter spp.

0 3

Bacillus spp. 0 2

Bacillus spp.

8 8

Buttiauxella spp. 1 4

Kocuria palustris

4 1

Chryseobacterium spp. 2 0

Microbacterium sp.

0 1

Delftia acidovorans 3 1

Nocardioides spp.

1 4

Microbacterium spp. 1 3

Oxalobacter sp.

1 0

Ochrobactrum grignonense 0 1

Pseudomonas spp.

5 5

Paenibacillus sp. 0 1

Rhodococcus sp.

0 1

Pseudomonas spp. 9 3

Sphingopyxis spp.

1 1

Rhodococcus sp. 0 1

Streptomyces spp.

2 2

Shewanella sp. 0 1

Не идентифицированные

10 16

Sphingobacterium spp. 1 1

Streptomyces sp. 0 1

Не идентифицированные 7 19

На 14 штаммах показано, что оптимальные концентрации для гуминовой

кислоты из чернозема, стимулирующие рост бактерий, выделенных из

различных почв, лежали в диапазоне 0,1- 1 мг/мл (Рис. 2).

Рис. 2. Рост бактерий

из чернозема на

жидкой среде Чапека в

зависимости от

концентрации

гуминовой кислоты: 1–

5 – грамотрицательные

штаммы; 6 –

копиотрофные

бактерии; 7 -

олиготрофные

бактерии; 8 – Bacillus

lentus-firmus; 9 –

Bacillus cereus

Сорбция гуминовых кислот клетками бактерий

Сорбция гуминовых кислот на бактерии – важный аспект взаимодействия

клеток с органическим веществом и их активности в почве. На Рис. 3