Тихонов В.В. Участие дождевых червей и бактерий в модификации биологических и химических свойств гумусовых веществ

Подождите немного. Документ загружается.

представлены хроматограммы остаточного количества гуминовой кислоты после

ее сорбции клетками бактерий. Средневесовая молекулярная масса гуминовой

кислоты достоверно не изменялась, а ее концентрация падала при росте

олиготрофов и копиотрофов (Рис. 3). Таким образом, рост бактерий зависит от

концентрации гуминовой кислоты в растворе, а микроорганизмы могут менять

концентрацию гуминовой кислоты путем сорбции на поверхности клеток.

Рис. 3. Уменьшение

интенсивности

светопоглощения гуминовой

кислоты из чернозема (1)

после инкубации с

копиотрофными (2) и

олиготрофными бактериями

(3) . Концентрации

гуминовой кислоты из

чернозема: А – 0,1 мг/мл; Б

– 1 мг/мл

Бактерии с различной интенсивностью сорбировали гуминовую кислоту (Рис.4)

Рис. 4. Сорбционные

кривые ГК для клеток 1 –

Serratia marcescens, 2 –

Pseudomonas putida, 3 –

Streptomyces sp., 4 –

Aeromonas hydrophila, 5 –

Bacillus circulans с

гуминовой кислотой из

торфа

Ранее отмечалось, что сорбированные гуминовые кислоты могут

защищать клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae от действия ядов (Демин и

др., 2003; Бирюков, 2006). Была предложена гипотеза «ажурного активного

фильтра» (Демин и др., 2003), который создают сорбированные на поверхности

клеток гуминовые кислоты, предотвращая проникновение молекул

додецилсульфата натрия (ДСН) в клетку. Подобное явление мы наблюдали и у

бактерий (Рис. 5). Рост A. baumannii в присутствии ДСН ингибировался, как в

случае с ГКч, так и без ГКч (Рис. 5 А), если инокулят бактерий вносился в

раствор последним. При внесении ДСН последним на поверхности клеток

успевал образовываться протекторный фильтр из молекул ГКч, и действие яда

ослабевало (Рис. 5 Б).

Рис. 5. Оптическая

плотность после 100

часов роста Acinetobacter

baumannii в присутствии

гуминовой кислоты и

додецилсульфата натрия.

Клетки добавлялись в

раствор последними (А);

ДСН добавлялся в

суспензию клеток с

гуминовой кислотой (Б).

1 – без гуминовой

кислоты, 2 – с гуминовой

кислотой, 3 – контроль.

Участие дождевых червей в модификации свойств гумусовых веществ

Микроорганизмы способны менять структуру молекул гуминовых кислот,

частично их утилизируя. В модельных экспериментах и на промышленных

образцах компостов (Рис. 6) нами показано уменьшение молекулярной массы и

концентрации гумусовых веществ под действием червей. Присутствие червей в

субстрате: низинном торфе, листве, навозе, приводило к уменьшению

молекулярных масс (Табл. 3) и концентраций гумусовых веществ через 6

месяцев работы червей.

Рис. 6.

Хроматограммы

гумусовых веществ в

фосфатных вытяжках

из компостов (1) и

вермикомпостов (2)

Таблица 3. Изменение молекулярных масс гумусовых веществ в ходе вермикомпостирования

Субстраты Молекулярные массы, Да

компост вермикомпост

Торф 19300 6900

Листва 16900 5100

Навоз 42500 39700

При скармливании червям препарата гуминовых кислот (ГКт),

внесенного в песок, средневесовая молекулярная масса гуминовой кислоты

снижалась в 1,5-2 раза: при пассаже через пищеварительный тракт червей A.

caliginosa с 8,5 кДа до 5,7 кДа (рис. 7 А), а E. fetida - с 20 кДа до 10 кДа (Рис. 7

Б).

Рис. 7. Молекулярно-массовое

распределение исходной

гуминовой кислоты (1) и

гуминовой кислоты, прошедшей

через пищеварительный тракт

червей (2). Aporrectodea caliginosa

(А) и Eisenia fetida (Б)

Наблюдаемое уменьшение молекулярной массы гуминовых кислот,

переходящих в фосфатный буфер, при пассаже можно объяснить, наряду с

деструкцией молекул полимера, функцией кальциевых желез червя, которые

генерируют гидрокарбонат кальция (Бызов, 2007) Ионы кальция

взаимодействуя с гуминовыми веществами, снижают их растворимость.

Роль карбоната кальция в связывании гуминовых кислот определяли,

добавляя комплексон ЭДТА, который разрушает комплексы гумусовых

веществ с ионами Са. Присутствие ЭДТА и изменение времени экстракции не

влияли на величину средневесовой молекулярной массы гумусовых веществ,

выделяемых из компоста. В вермикомпосте, напротив, введение в раствор

ЭДТА и увеличение времени экстракции приводило к увеличению

средневесовой молекулярной массы гумусовых веществ с 37 – 39 кДа до 43 – 45

кДа (Рис.8). Таким образом, черви с одной стороны закрепляют гумусовое

вещество, делая его менее водорастворимым, с другой стороны активно

разрушают его.

Рис. 8. Молекулярная масса

гумусовых веществ в компосте (1)

и вермикомпосте (2) без ЭДТА (А)

с ЭДТА (Б). Штриховка

экстракция 1 час, без штриховки –

экстракция 12 час

Трансформация ГКб при пассаже через кишечник червя может быть следствием

воздействия ферментов кишечной жидкости или результатом деятельности

микроорганизмов, ассоциированных с червем. В модельном эксперименте

биополимер инкубировался с кишечной жидкостью, пятью бактериями,

выделенными из кишечника и бактериями с кишечной жидкостью

одновременно. Выявлено, что все бактерии росли на ГКб и кишечной жидкости

в качестве единственного источника углерода. Все штаммы уменьшали

молекулярную массу ГК в 1,3 – 1,5 раза (Табл. 4). В присутствии кишечной

жидкости молекулярный вес гуминовой кислоты достоверно уменьшался по

сравнению с исходной гуминовой кислотой в 2,6 раз. Кишечная жидкость и

бактерии при одновременном воздействии уменьшали молекулярную массу

исходной гуминовой кислоты, однако действие только кишечной жидкости

приводило к несколько более сильной деструкции гуминовой кислоты.

Известно, что в ряде случаев в присутствии легкодоступного вещества

труднодоступный субстрат не разлагается микроорганизмами. Механизм

подробно описан в работах (Голышин, 1991) и называется катаболитной

репрессией. Бактерии, по-видимому, используют углеводы, белки, в том числе

и ферменты, кишечной жидкости как источник энергии, поэтому действие

кишечной жидкости с бактериями менее интенсивное на ГКб по сравнению

кишечной жидкости без бактерий.

Таблица 4. Трансформация гуминовой кислоты в ходе инкубации при 25

С в течение 117

часов.

Вариант опыта Средневесовой

молекулярный вес, кДа

Гуминовая кислота 31 ± 3,1

Гуминовая кислота + кишечная

жидкость

12 ± 1,2

Гуминовая кислота + Aeromonas encheleia 21 ± 2,1

Гуминовая кислота + Bacillus thuringiensis 22 ± 2,2

Гуминовая кислота + штамм 3 22 ± 2,2

Гуминовая кислота + Acinetobacter sp. 23 ± 2,3

Гуминовая кислота + Aeromonas sp. 22 ± 2,2

Гуминовая кислота + кишечная

жидкость

+ Aeromonas encheleia

14 ± 1,4

Гуминовая кислота + кишечная

жидкость

+ Bacillus thuringiensis

18 ± 1,8

Гуминовая кислота + кишечная

жидкость

+ штамм 3

17 ± 1,7

Гуминовая кислота + кишечная

жидкость

+ Acinetobacter sp.

14 ± 1,4

Гуминовая кислота + кишечная

жидкость

+ Aeromonas sp.

17 ± 1,7

Взаимодействие стерильной кишечной жидкости червей с ГКб вызывает

увеличение содержания низкомолекулярных фракций (0,5 – 3 кДа) и

увеличение содержания высокомолекулярных фракций более 65 кДа ГКб (Рис.

9). Cвободные ферменты, присутствующие в кишечной жидкости, могут

активно модифицировать фракционный состав ГКб. С одной стороны, они

гидролизуют и окисляют молекулы ГК, с другой, по-видимому, способствуют

образованию новых высокомолекулярных продуктов.

Рис.9.

Хроматограмма

гуминовой

кислоты. Исходная

ГК (1), ГК,

проинкубированная

с кишечной

жидкостью червя

(2)

Действие модифицированных гумусовых веществ на рост микроорганизмов

Модифицированные червями гуминовые кислоты могут обладать другими

свойствами, нежели нативные, возможно, вследствие изменения молекулярных

масс. Ранее на эукариотных организмах было показано, что высокая

биостимулирующая способность была наибольшей во фракциях с

молекулярной массой меньше 10 кДа (Мато, 1972; Воган, 1985; Стрелков,

1991).

Вслед за работами М.В. Бирюкова с соавторами (Бирюков, 2006) мы

исследовали действие гуминовых кислот с разными молекулярными массами и

в разных концентрациях на рост дрожжей Saccharomyces cerevisiae. При

уменьшении путем модификации молекулярной массы ГКт ее стимулирующий

эффект на рост дрожжей повышается. Гуминовая кислота с наименьшей

молекулярной массой (5,5 кДа) наиболее сильно стимулировала рост при всех

исследуемых концентрациях. (Рис. 10) .

Рис. 10. Рост

дрожжей

Saccharomyces

cerevisiae на средах с

гуминовой кислотой.

А – контроль; Б -

исходная гуминовая

кислота, 20 кДа;

модифицированные

гуминовые кислоты:

В - 9 кДа; Г – 7,5 кДа;

Д -5,5 кДа

Концентрации

гуминовых кислот: 1

– 0,16 мг/мл, 2 – 0,12

мг/мл, 3 – 0,08 мг/мл,

4 – 0,04 мг/мл, 5 –

0,02 мг/мл

Исследовали рост бактерии A. baumannii при действии исходной гуминовой

кислоты, экскретов червей и гуминовой кислоты из копролитов червей.

Исходная гуминовая кислота подавляла рост бактерий, экскреты червей

стимулировали, а гуминовые кислоты из копролитов не отличались от контроля

(Рис. 11).

Рис.11. Действие экскретов

червей (1), гуминовых

кислот из копролитов (2), из

конечного субстрата после 2

месяцев инкубирования с

червями Eisenia fetida (3), из

исходного субстрата (5) на

рост бактерии Acinetobacter

baumannii, 4 – контроль

(рост бактерии на среде без

добавок)

До сих пор остается неясным, как черви изменяют микробное сообщество

при вермикомпостировании. Проверяли действие исходной и

модифицированных червями гуминовых кислот на рост комплекса бактерий из

компоста и вермикомпоста в жидких средах. Для компоста менялось как

обилие колониеобразующих единиц, так и состав бактерий. Есть тенденция к

уменьшению обилия при действии модифицированных гуминовых кислот на

бактерии из компоста. При этом гуминовая кислота, выделенная из копролитов

червей, подавляла рост бактерий (Рис.12).

Рис. 12. Рост бактерий (1 –

Pseudomonas sp., 2 –

Bacteroides sp., 3 –

Pseudomonas viridiflava, 4 –

неопределенные культуры),

выделенных из компоста на

средах с гуминовыми

кислотами: А – контроль

(фосфатный буфер); Б –

исходная гуминовая кислота,

20 кДа; В – гуминовая

кислота, выделенная из

конечного модельного

субстрата после 2 месяцев

инкубирования с червями

Eisenia fetida, 9 кДа; Г –

гуминовая кислота из

копролитов, 11 кДа; Д –

поверхностные экскреты

червя Eisenia fetida

Модифицированные гуминовые кислоты увеличивали обилие бактерий,

выделенных из вермикомпоста, а нативная гуминовая кислота не влияла на их

обилие. Изменялось также доминирующие виды (Рис. 13).

Рис. 13. Рост бактерий

(1 – Serratia marcescens,

2 – Pseudomonas putida,

3 – Aeromonas media, 4

– Aeromonas hydrophila,

5 – Bacillus circulans),

выделенных из

вермикомпоста на

средах с гуминовыми

кислотами.

А – контроль, Б –

исходная гуминовая

кислота, 20 кДа, В –

гуминовая кислота, 9

кДа, Г – гуминовая

кислота, 7,5 кДа, Д –

гуминовая кислота, 5,5

кДа

Численность бактерий из компоста при действии на них гуминовой

кислоты с более низкими молекулярными массами падает, а из вермикомпостов

растет. Таким образом, гуминовая кислота, модифицированная червем,

подавляет рост бактерий компоста и не подавляет бактерии вермикомпоста.

Очевидно, черви, пропуская субстрат через пищеварительный тракт и (или)

действуя поверхностными экскретами, разрушают и стабилизируют гуминовую

кислоту и тем самым индуцируют сукцессии в компостах и вермикомпостах.

На гуминовой кислоте, прошедшей через пищеварительный тракт червя,

бактерии развивались быстрее, и конечное обилие их было больше (Рис. 14).

Рис. 14. Рост (А) и конечное

обилие (Б) бактерий из

компоста на гуминовых

кислотах в качестве

единственного источника

углерода и азота. 1 – исходная

гуминовая кислота, 20 кДа; 2

– гуминовая кислота,

выделенная из конечного

модельного субстрата после 2

месяцев инкубирования с червями E. fetida, 9 кДа; 3 – гуминовая кислота из копролитов, 11

кДа

Больше всего бактерии снизили молекулярные массы исходной

гуминовой кислоты, меньше – модифицированных гуминовых кислот (Табл. 5).

Наибольшее снижение концентрации отмечено для модифицированных кислот

- в 2 раза. Рост микроорганизмов на средах с гуминовыми кислотами после их

биодеградации при пассаже через кишечник червя был более интенсивным.

Дополнительным источником доступных форм углерода и азота могли являться

поверхностные и кишечные экскреты червей, представленные комплексом

полисахаридов и пептидов. Отношение С/N составляло в экскретах червей 9,

ГКм 11,2 в ГКт 18. В работе также продемонстрирована возможность роста

комплекса бактерий из компоста на экскретах червя E. fetida.

Таблица 5. Изменение концентраций и среднечисловых молекулярных масс гуминовых

кислот (ГК) при росте на них, как на единственном источнике углерода и азота, комплекса

бактерий из перепревшего конского навоза

Субстрат Среднечисловая

молекулярная

масса исходного

субстрата, кДа

Среднечисловая

молекулярная

масса субстрата

после роста

бактерий, кДа

Изменение

молекулярной

массы, %

Изменение

концентраций,

ГКи 20 13 35 26

ГКк 11 8.6 25 51

ГКм 9 7.8 13 53

Биологическая активность компостов и вермикомпостов, низкомолекулярные

регуляторы роста

Встречаются работы с указанием на то, что вытяжки из компостов и

вермикомпостов обладают физиологически активными свойствами и, как

правило, это связывают не с гуминовыми кислотами, а низкомолекулярными

гормонами роста (Musculo, 2007). При добавлении небольшого количества

вытяжек (менее 200 мкгС/л) из компостов и вермикомпостов в питательную

среду рост бактерии A. baumannii ингибировался (Рис. 15). Так как

концентрации гуминовых кислот в этих растворах были малы, мы

предположили, что данное явление вызывают не гуминовые кислоты в

растворе, а низкомолекулярные физиологически активные соединения.

Рис. 15. Обилие Acinetobacter

baumannii через 100 часов

роста на среде Чапека с

водными (А) и фосфатными

(Б) вытяжками из компоста (2)

и вермикомпоста (3) при

различных разведениях

субстрат/растворитель (по

массе): 1 - контроль, 2 –

1/10000, 3 – 1 /1000, 4 –

1/500, 5 – 1/100, 6 – 1/50, 7 –

1/10. При разведении 1/10000

концентрации углерода в

фосфатных вытяжках

варьировали в пределах 150 –

200 мкг/л

Для того, чтобы зарегистрировать эффект от гуминовой кислоты и от

низкомолекулярных физиологически активных соединений, мы исследовали

рост бактерии Pseudomonas putida в полноценной жидкой среде в присутствии

гуминовых кислот из компоста и вермикомпоста и на фосфатных вытяжках из

этих субстратов. При действии низких концентрациях, происходило угнетение

роста только в варианте с вытяжкой из вермикомпоста. Большие концентрации

вызывали стимуляцию роста. Гуминовые кислоты устраняют ингибирующий

эффект низкомолекулярных соединений с концентраций больше 5 мкг/мл в

средах из вермикомпоста (Рис. 16).

Рис. 16. Обилие

Pseudomonas putida через 35

часов роста (контроль-Д),на

гуминовой кислоте из

компоста (А), фосфатной

вытяжке из компоста (Б),

гуминовой кислотой из

вермикомпоста (В),

фосфатной вытяжке из

вермикомпоста (Г) при

различных концентрациях

гуминовой кислоты: 1 – 0,5

мкг/мл, 2 – 1 мкг/мл, 3 – 2

мкг/мл, 4 – 5 мкг/мл, 5 – 10

мкг/мл, 6 – 20 мкг/мл

Как мы убедились, в компостах помимо гуминовых кислот есть и другие

мощные регуляторы. Возможный вклад этих низкомолекулярных веществ в