Шмелева В.Г. Определение белков и аминокислот в микробной биомассе
Подождите немного. Документ загружается.
В микробной клетке различают общий белок, или сырой протеин, - количество белка, найденное по
общему азоту и истинный белок, определяемый в щелочном экстракте после предварительного разрушения
клеточной стенки.
Лабораторная работа 5.1 Определение содержания белка (сырого протеина) в биомассе дрожжей
по общему азоту
Наиболее простым химическим методом определения белка является количественное определение
общего азота после минерализации навески биомассы. При расчете содержания белка в биомассе по найденному
количеству общего азота исходят из среднего содержания азота в аминокислотах (белках), равное 16%.
1 Цель работы состоит в определении содержания белка (сырого протеина) в исследуемой биомассе
дрожжей.
В основе данного метода лежит сжигание навески исследуемой биомассы в концентрированной серной
кислоте по методу Кьельдаля. Органические вещества при этом распадаются, окисляясь до углекислого газа и воды.
Продукты распада частично улетучиваются, а весь азот, выделяющийся в форме аммиака, связывается серной
кислотой с образованием сернокислого аммония. Соли аммония образуют с реактивом Несслера желтое
окрашивание, интенсивность которого определяют при длине волны 440 нм.
2 Приборы и материалы
Электроплитка с песчаной баней
Н
2
SО
4
концентрированная
10%-ный раствор перекиси водорода
40%-ный раствор NаОН
Реактив Несслера
Стандартный раствор (NH
4
)
2
SO
4
с концентрацией 0,0472 мг/мл
3 Описание работы
Навеску абсолютно сухого материала (биомассы) 50 - 100 мг помещают в колбу Кьельдаля и
заливают 10 мл (V
1
) концентрированной серной кислоты. Колбу закрывают специальной стеклянной пробкой или
воронкой и помещают на песчаную баню для сжигания. Параллельно ставят контрольную колбу с 10 мл
концентрированной серной кислоты. Минерализацию проводят до полного обесцвечивания содержимого колбы. Для
ускорения процесса в каждую колбу по ходу сжигания несколько раз добавляют 3 - 5 капель 10%-ной перекиси
водорода (только в охлажденную колбу!) После минерализации колбы охлаждают на воздухе до комнатной
температуры, отбирают по 6 мл (V
2
) содержимого опытных и контрольной колб и переносят в мерные колбы на 100
мл (V
3
). Затем постепенно добавляют 20 - 25 мл дистиллированной воды и осторожно нейтрализуют избыток Н
2
SО
4
40%-ным раствором NаОН (25 - 30 мл) до значения рН 7,5 - 8,0 по универсальной индикаторной бумаге. После
нейтрализации раствор в колбах доводят до метки дистиллированной водой.
Из каждой колбы отбирают 0,5 мл раствора, добавляют 1,5 мл дистиллированной воды и 0,4 мл реактива
Несслера. Опыт ставят в двух повторностях. Пробы инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре и
колориметрируют при длине волны 440 нм в кюветах с толщиной поглощающего слоя 5 мм.
Содержание общего азота в растворе определяют по калибровочному графику.
Построение калибровочного графика
Для построения калибровочного графика готовят стандартный раствор сульфата аммония с концентрацией 0,0472
мг/мл. Пробы готовят по схеме таблицы 7.
11
Таблица 7- Схема приготовления проб для построения калибровочной кривой при
определении общего азота
Пробы
Стандартный
раствор
(NH
4
)
2
SO
4
,мл
Дистиллиро-
ванная вода,
мл
Концентрация азота в пробе,
мг/мл
Реактив
Несслера
мл
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
-
0,001
0,002
0,003
0,004
0,005
0,006
0,007
0,008
0,009
0,010
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
0,4
4 Оформление результатов работы
Содержание общего азота в растворе определяют по калибровочному графику. Содержание общего
азота в сожженной навеске рассчитывают по формуле:
C х n х V
1
х
V
3
C
N
= ----------------------- х 100%, где
V
2
х m
С - содержание азота, найденное по калибровочному графику, мг/мл;
m - навеска исследуемого материала, мг;
V
1
- объем зольного раствора после сжигания - 10 мл;
V
2
- объем зольного раствора, взятый для определения -6 мл;
V
3
- объем зольного раствора после разбавления и нейтрализации - 100 мл;
n - степень разведения пробы перед добавлением реактива Несслера - 4
Количество белка (сырого протеина) в материале определяют, умножив содержание общего азота на
коэффициент 6,25.
5 Контрольные вопросы
1.Приведите значения сырого протеина в биомассе дрожжей и бактерий
2. Чем определяется значение пересчетного коэффициента 6,25?
Лабораторная работа 5.2 Определение истинного белка в биомассе
1 Цель работы состоит в определении количества истинного белка после предварительного
разрушения клеточной стенки и экстракции белка в раствор.
Распространенной схемой определения содержания истинного белка в биомассе является ее
предварительная обработка тем или иным методом с последующей экстракцией и определением белка в экстракте
двумя методами.
Сначала проводят предварительное определение содержания белка в экстракте биуретовым методом
( лабораторная работа 4.1) или микробиуретовым методом (лабораторная работа 4.2), а затем определяют
содержание белка по методу Лоури (лабораторная работа 4.3) или по методу Бредфорда (лабораторная работа 4.5)
Предварительная обработка служит для частичного разрушения клеточных стенок и облегчения выхода
белка в экстрагент. Она может заключаться в механической дезинтеграции клеток или обработке их агентами,
разрушающими клеточную стенку (толуол, 2-меркаптоэтанол и др.). Хорошие результаты дает обработка биомассы
методом Термхитаровой-Шульги. Такая обработка позволяет удалять мешающие определению белка по методу
Лоури вещества (соли, нуклеиновые кислоты, глицин, аминосахара и др.) путем кипячения биомассы в 0,5 М
трихлоруксусной кислоте (ТХУ).
2 Приборы и материалы
12
Ступка с пестиком
Водяная баня
Толуол.
Кварцевый песок.
0,5 М раствор ТХУ.
1 М раствор NаОН.
Реактивы для определения белка в растворе выбранным методом
3 Описание работы
На первом этапе проводят промывку исследуемой биомассы от компонентов питательной среды
3.1 Промывка биомассы
2 г влажной биомассы суспендируют в 100 мл дистиллированной воды и центрифугируют 15-20 мин
при 8000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, биомассу используют для дальнейших исследований,
предварительно определив ее влажность. На следующем этапе проводят разрушение клеточной стенки одним из
нижеприведённых методов.
3.2 Разрушение клеточной стенки
3.2.1 Обработка толуолом
500 мг промытой биомассы помещают в пробирку с притертой пробкой, добавляют 5 мл
дистиллированной воды и 0,5 мл толуола, тщательно перемешивают и ставят в термостат (30
0
С) на 1 час.
3.2.2 Механическая дезинтеграция
500 мг промытой биомассы замораживают, затем оттаивают и помещают в фарфоровую ступку, туда
же добавляют 500 мг кварцевого песка и 5 мл дистиллированной воды. Смесь растирают в ступке в течение 15-20
мин.
3.2.3 Обработка биомассы по методу Термхитаровой-Шульги
500 мг промытой биомассы помещают в стеклянную пробирку и заливают 10 мл 0,5 М ТХУ. Пробирки
инкубируют на кипящей водяной бане в течение 20 мин.
3.3 Экстракция белка из биомассы и определение его в экстракте
После обработки биомассы тем или иным способом проводят экстракцию белка в жидкую фазу. Для
этого поученную на этапе 3.2 смесь центрифугируют 15-20 мин при 8000 об/мин, сливают супернатант, а из осадка
экстрагируют белки 1 М NаОН. Для этого осадок суспендируют в 10 мл 1 М NаОН и инкубируют при комнатной
температуре в течение 30 мин при перемешивании. После центрифугирования в том же режиме в супернатанте
определяют количество белка в растворе двумя методами лабораторной работы 4.
4 Оформление результатов работы
Определяют содержание белка в растворе двумя методами по соответствующим калибровочным
графикам. Проводят сопоставление количества белка в растворе. Полученные результаты пересчитывают на
содержание белка в 1 г. сухой биомассы.
Лабораторная работа 6 Изучение фракционного состава белков микроорганизмов
Сведения об общем содержании белков и их аминокислотном составе не дают полного представления о
питательной ценности исследуемого продукта, в частности, биомассы микроорганизмов. Анализ аминокислотного
состава дает ценные сведения лишь относительно потенциальной пищевой пригодности белка, так как набор
аминокислот, полученный после кислотного гидролиза, не всегда соответствует набору физиологически доступных
аминокислот. Кроме аминокислотного состава необходимо учитывать доступность белков действию
протеолитических ферментов (пепсин, трипсин), которому они подвергаются в процессе пищеварения животных.
Белковый состав клетки неоднороден. Наряду с растворенными в цитоплазме белками типа
альбуминов, глобулинов, нуклеопротеидов, выполняющих ферментативную, регуляторную и транспортную
функции, клетка содержит тесно связанные со структурными элементами клетки липопротеиды, гликопротеиды
клеточных стенок и мембран.
В связи с вышеизложенным, важным показателем, определяющим биологическую ценность белка,
является его фракционный состав. Фракционирование основано на различной растворимости клеточных белков в
солевых (I и II фракции) и щелочных растворах (III и IV фракции). Две первые фракции содержат растворимые
белки, полностью гидролизуемые пищеварительными ферментами в течение 1 или 3 часов соответственно.
Щелочные фракции содержат структурные белки, плохо поддающиеся гидролизу пищеварительными ферментами.
13
1 Цель работы состоит в определении фракционного состава белков дрожжей, выявление процентного
содержания белков разной растворимости по отношению к суммарному белку клетки.
2 Приборы и материалы
магнитная мешалка любой марки
6%-ный раствор NaCl.
0,1 М раствор NaOH.
1 М раствор NaOH.
3 Описание работы
Микроорганизмы после выращивания на жидкой питательной среде отделяют от культуральной
жидкости центрифугированием при 5000 - 7000 об/мин в течение 10 - 15 мин. Для удаления остатков нативного
раствора осадок дважды промывают дистиллированной водой (соотношение 1:10) и осадок отделяют
центрифугированием при 5000 - 7000 об/мин в течение 10 - 15 мин. Из полученной влажной биомассы берется
навеска 1 - 2 г. Одновременно ставится анализ на определение влажности биомассы.
На 1-ом этапе определяют содержание водорастворимых белков. Для этого навеску биомассы (1 - 2 г)
помещают в химический стакан объемом не менее 150 мл, приливают 50 мл дистиллированной воды. Процесс
экстракции проводят при постоянном перемешивании на магнитной мешалке в течение 30 мин. По окончании
экстракции биомассу отделяют центрифугированием (5000 об/мин, 10 - 15 мин). Супернатант содержит
водорастворимые белки биомассы (I фракция). Его количественно переносят в колбочку. Далее из осадка биомассы
проводят последовательное экстрагирование остальных фракций белков: 6% раствором NaCl (II фракция), 0,1 М
раствором NaOH (III фракция), 1 М NaOH (IV фракция) при температуре 55
0
С. Процесс экстракции проводят так
же, как экстрагирование водой.
В каждой фракции определяют содержание белка по методу Лоури.
4 Оформление результатов работы
Результаты оформляют в виде таблицы 8.
Таблица 8- Фракционный состав биомассы (название микроорганизма)
N
фракции
Экстрагент Объем
экстракта,
мл
V
Содержание
белка во
фракции,
мг/мл
С
Содержание белка
во
фракции,
мг
V х С
% от суммы
белка
во всех
фракциях
% от
истинного белка
1 Вода
2 6% NaCl
3 0,1 NaOH
4 1M NaOH
За 100% принимают содержание истинного белка, определенное в биомассе в работе 5.2. Далее
необходимо определить сумму белка во всех фракциях и рассчитать какую долю (или процент) составляют
экстрагированные белки на грамм сухой биомассы. Найденную величину экстрагированного белка необходимо
сопоставить с процентным содержанием истинного белка в биомассе дрожжей ( лабораторная работа 5.2)
5 Контрольные вопросы
1.Сколько сырого протеина содержится в дрожжах?
2.Каково содержание истинного белка в биомассе дрожжей?
3.Какова доля солерастворимой фракции белков в истинном белке?
14