Санагурський Д.І. Об’єкти біофізики: монографія

Подождите немного. Документ загружается.

Кювета з об’єктом дослідження (рис. 2.18 б), який

знаходиться в агаровому блоці (рис. 2.18 д), жорстко кріпиться на

платформі, яка механічно переміщається в трьох

взаємноперпендикулярних напрямах. Це дає можливість точно

підвести об’єкт до мікроелектрода (рис. 2.18 а), який є

мікропіпеткою зі скла “Пірекс”, заповненого 2,5 М KCI

(П.Г. Костюк, 1960; Р.М. Мещерський, 1960). Витягали

мікроелектроди на установці 143-3. Для роботи використовували

електроди з кінчиком менше ніж 1мКм і опором 20–50 Мом.

Додатковим критерієм хорошої якості мікроелектродів вважають

їхні характеристики конусоїдальності і запис “умовного нуля” з

мінімальними шумами і дрейфом. Заповнювали мікроелектроди

безпосередньо поміщаючи їх у 2,5 н KCI, оскільки і вони містять

внутрішньоелектродні капіляри, що сприяють швидкому

заповненню. Відомі й інші способи заповнення мікроелектродів,

які потребують довшого часу і підготовчих робіт. Електроди

фіксують у спеціальному утримувачі (рис. 2.18 2)

мікроманіпулятора ІПМ (рис. 2.18 3). За допомогою нього вводять

мікроелектрод у зиготу шляхом імпульсного або плавного його

переміщення. Вводили мікроелектроди у полі зору бінокулярного

мікроскопа МБІ-1 при збільшенні в 32 рази.

Досліджуваний об’єкт – зиготу в’юна, закріплену в

агаровому блоці, – поміщали в камеру, заповнену розчином

Гольтфретера. У момент проколу плазматичної мембрани зиготи

кінчиком мікроелектрода простежується різкий стрибок неявного

потенціалу, який добре видно на шкалі рН-метра (рН=340) (рис. 2.18 5).

Рис. 2.19. Схема установки для дослідження електрофізіологічних характеристик мембран зародків в’юна:

1 – експериментальна камера; 2, 4 – мікроелектродні підсилювачі; 3 – підсилювач струму; 5 – підсилювач фіксування

потенціалу; 6 – підсилювач-перетворювач; 7 – потенціометри КСП-4

Цю величину ТМП і дальші зміни її в часі реєстрували на

діаграмній стрічці самописця КСП-2 (рис. 2.18 6). Використані

нами у вимірювальній системі рН-метр і самописець КСП-2,

відповідають вимогам узгодження вхідних і вихідних опорів,

напруг і струмів між елементами в ланці.

Для проведення експерименту використовують

яйцеклітини і зародки в’юна Misgurnus fossilis L., одержані за

методикою Нейфаха (А.А. Нейфах, 1959). У лабораторних умовах

риб утримують при температурі +4–-5

С. Для отримання ікри

самкам дом’язово вводять 500 МО хоріогонічного гонадотропіну.

Овуляція наступє через 36 годин при температурі +19–-20

С.

Зиготи інкубують при температурі +20–-22

С у розчині

Гольтфретера. Стадії розвитку контролюють візуально.

Після однієї години інкубації зиготи при температурі

+21,5

С з’являються перші два бластомери зародка, причому

борозна першого поділу дроблення проходить меридіально.

Згодом вік зародків вимірюють або часом після запліднення, або

номером поділів бластомерів, або числом τ

– умовних одиниць

“детлаф”, що були названі на честь авторів, які їх запропонували

(Т.А. Детлаф, А.А. Детлаф, 1960). Величина τ

– це тривалість

одного мітотичного циклу в період синхронних дроблень 2–

4 бластомерів, яка для в’юна при температурі +21,5

С становить

31 хв. Так, через 1,5 год після запліднення, або через 3 τ

відбувається ІІ поділ: кількість бластомерів – чотири. Борозна

другого поділу теж меридіальна, але проходить перпендикулярно

до борозни першого дроблення. Через 2 год (4 τ

, ІІІ поділ) зародки

мають вісім бластомерів, а через 2,5 год (5 τ

, ІV поділ) –

шіснадцять, причому і ці борозни проходять меридіонально і

перпендикулярно попереднім. Через 3 год (6 τ

, V поділ) зародки

являють собою 32 бластомери, але борозна п’ятого поділу

проходить паралельно екватору жовтка, в результаті чого на

анімальному полюсі утворюється “шапочка”, тобто бластодиск,

клітини якого ще не відділені від жовтка мембранами. Після 3 год

клітини нижнього шару торкаються жовтка безпосередньо своєю

базальною частиною, а верхні оточені з усіх боків плазматичними

мембранами. Вперше з’являються якісні відмінності між

бластомерами (Е.А. Гойда, 1993). На наступній стадії дроблення

(7 τ

, VI поділ) зародок має 64 бластомери, які розміщені двома–

трьома шарами і утворюють “високу шапочку”. Через 4 год після

запліднення (8 τ

, VII поділ) зародки мають 128 бластомерів, через

5 год (10 τ

, IX поділ) – 512 бластомерів, які утворюють морулу.

Після цієї стадії поділу відбувається десинхронізація каріокінезу в

різних клітинах, а на стадії 12 τ

(XI поділ) формується рання

бластула – “шапочка” бластомерів здіймається над жовтком,

зовнішні бластомери утворюють епібласт. На цій стадії

починається асинхронний поділ ядер, падає мітотичний індекс.

Починається інтенсивний синтез РНК і морфогенетична функція

ядер.

Саме на цій стадії, через 6 год після запліднення,

закінчується реєстрування трансмембранного потенціалу зародків,

оскільки в цей час починається десинхронізація коливань ТМП,

яка збігається з десинхронізацією поділів ядер, а ТМП має

постійний рівень – 60 мВ.

Реєструють рівень мембранного потенціалу безперервно

протягом 6–7 год розвитку зародків. Здійснюють реєстрування за

допомогою підсилювачів, які мусять мати високоомний вхід – 20–

40 МоМ (П. Костюк, О. Крышталь, 1981; И. Магура, 1981;

Р. Первис, 1983). Записувати електричні сигнали, отримані на

виході підсилювача, можна на різних носіях інформації.

2.5. Âèçíà÷åííÿ àêòèâíîñò³

, K

-àêòèâîâàíî¿,

-çàëåæíî¿ ÀÒÔ-àçè

â ãîìîãåíàò³ êë³òèí çàðîäê³â

â’þíà

Активність Na

, K

-активованої, Mg

залежної аденозинтрифосфатази, яка разом з гідролізом АТФ

біохімічно пов’язана з механізмами генерування різниці

потенціалів збудливих мембран, у гомогенаті клітин зародків в’юна

визначають за стандартною методикою (М.И. Прохорова, 1982), за

різницею активностей без оуабаїну та при його додаванні.

Внаслідок гідролізу АТФ при дії АТФ-ази нагромаджується

неорганічний фосфат (Р

). Він перетворюється молібденовокислим

амонієм у комплексну сполуку, що відновлюється аскорбіновою

кислотою до молібденової сині. Інтенсивність забарвлення

пропорційна до вмісту Р

У ході визначення використовують такі реактиви:

інкубаційне середовище – розчин Гольтфретера (табл. 2.1);

3 мМ розчин АТФ-Na

на 50 мМ буфері трис-HCl (рН 7,4);

10 % трихлороцтову кислоту;

2 % аскорбінову кислоту;

ацетатний буфер (рН 4,5) – 1 М CH

COONa + CH

COOH;

2 % (NH

)

MoO

в 0,05 н H

і 0,001 н CuSO

;

стандартний розчин KH

(20 мкг Р

в 1 мл).

Таблиця 2.1

Хімічний склад фізіологічного розчину для холоднокровних

– розчину Гольтфретера (В.П. Божкова, 1971)

Складники

Маса солей

на 100 мл маточного

розчину, мг

Об’єм маточного

розчину на літр

готового розчину, мл

CaCl

11,09 3

NaCl 9,84 60

KCl 7,45 2

MgCl

·6H

O 20,32 0,5

NaHCo

8,40 2

(EDTA) 29,21 5

Зародки в’юна на різних стадіях розвитку гомогенізують і з

одержаного гомогенату центрифугуванням відділяють мітохондрії

та ядра. Одержані проби розводять водою так, щоб в 0,1 мл проби

вміст білка не перевищував 100–250 мкг (кількість білка

визначають за методом Лоурі). У пробірки вносять по 0,1 мл одної

і тої ж проби, доливають по 1 мл інкубаційного середовища і 0,1 мл

АТФ-Na

. Потім в одну з контрольних пробірок додають 0,1 мл

0,1 мМ розчину оуабаїну. В досліджувані проби додають розчини

солей важких металів в концентраціях від 10

-4

до 10

-5

М. Проби

інкубують при температурі +20

С протягом 20 хв, після чого для

припинення гідролізу й осадження білка в них додають 10 %

трихлороцтову кислоту (1:1). Осаджений білок відділяють

центрифугуванням при 2 000 об/хв протягом 10 хв. До надосадової

рідини, що містить Р

, який був відщеплений від АТФ під дією

АТФ-ази, доливають 1,5 мл ацетатного буфера – для нейтралізації

трихлороцтової кислоти до рН 3,9–4,0, 0,2 мл 2 % молібдату

амонію і 0,2 мл 2 % свіжо виготовленої аскорбінової кислоти.

Проби перемішують і залишають при кімнатній температурі на

20 хв до появи забарвлення. Після закінчення цього терміну

визначають величину оптичної густини на спектрофотометрі при

довжині хвилі 700 нм. За калібрувальною кривою та величиною

екстинції визначають вміст неорганічного фосфору в зразку. АТФ-

азну активність (у мкмолях Р

/мг білка·год) розраховують за

формулою:

A = 6P

/аМ,

де Р

– вміст фосфору в пробі, знайдений за кривою; а – вміст білка

в пробі; М – молекулярна маса фосфору.

2.6. Åëåêòðîííî-ì³êðîñêîï³÷íå

äîñë³äæåííÿ êë³òèí çàðîäê³â

â’þíà

Зародки в’юна у стадії двох і шістнадцяти

бластомерів та на 6-ій годині розвитку фіксують 1,5 % розчином

глютарового альдегіду в 0,2 М какодилатному буфері (рН 7,2) при

температурі +4

С, протягом години. Зразки промивають

какодилатним буфером і додатково фіксують 2 % розчином

чотирьохокису осмію в тому ж буфері протягом години (t

= +4

С).

Потім препарати відмивають від фіксаторів і обезводнюють у

зростаючих концентраціях етилового спирту (50 %, 70 %, 90 % і

100 %). Додатково обезводнюють у двох змінах окису пропілену і

поміщають в епоксидну смолу епон-812 (Б. Уикли, 1975).

Зрізи готують на ультрамікротомі УМТП-6 за допомогою

алмазного ножа, контрастують 2 % розчином уранілацетату

протягом 15 хв і додатково цитратом свинцю за Рейнольдсом

(E.S. Reynolds, 1963).

Зрізи переглядають і фотографують за допомогою

електронного трансмісійного мікроскопа ПЕМ-100.

2.7. Çì³íè ÒÌÏ â ïðîöåñ³

ðàííüîãî ðîçâèòêó â’þíà,

ïîâ’ÿçàí³ ç òðèâàë³ñòþ

êë³òèííèõ öèêë³â

Дані про періодичні коливання ТМП під

час поділів бластомерів у різних тварин (В.П. Божкова и др., 1971,

1974; D.J. Woodward, 1965;. И.Ш. Квавилашвили и др., 1971)

дзасвідчують чіткий взаємозв’язок змін електричних

характеристик мембрани з мітотичною активністю клітин

ембріонів. Цей феномен носить універсальний характер, але

природу його не можна звести тільки до процесів перерозподілу

йонів на мембрані бластомерів (К.А. Кафиани, А.Г. Маленков,

1976), оскільки коливання їхніх концентрацій визначають не

тільки за пасивною дифузією, але й за активним транспортуванням

через мембрани. На жаль, до сьогоднішнього дня не одержано

результатів про коливання [К

] і [Nа

] протягом мітотичних

циклів бластомерів. Немає також переконливих даних щодо

частоти коливань ТМП у зародків в’юна й інших тварин при зміні

темпу синхронних дроблень бластомерів. Тому нами було

проведено визначення безперервної динаміки ТМП при

нормальному ранньому розвитку зародків в’юна, його прискоренні

або затримці, пов’язаній з температурою, а також при модифікації

цитостатиком - колхіцином.

Зміни ТМП зародків в’юна, що розвиваються нормально,

носять коливальний характер при поступовому наростанні його

абсолютних величин (рис. 2.20). Період кожного коливання

становить 30–32 хв і відповідає величині τ, що виражає тривалість

клітинних ділень або мітозів під час синхронного дроблення

бластомерів при температурі +21 °С (Г.М. Игнатьева, А.А. Косто-

марова, 1966) Завдяки застосованій нами методиці, вдалося

одержати безперервну криву динаміки ТМП зародків в’юна

протягом сім–вісім годин їхнього розвитку від моменту

запліднення. Водночас виявлено, що впродовж перших п’яти

годин розвитку ТМП міняється фазно, то збільшуючись, то

зменшуючись з періодом в 31,5 хв, і стрибкоподібно наростаючи

від величини – -8 ÷ 12 мВ (стадія 2–4 бластомерів) до –66 ÷ –68 мВ

(стадія ранньої бластули). Після п’яти годин від початку

запліднення починає виявлятися деяка десинхронізація і

подовження періоду ТМП, а після шести годин – зниження

абсолютних величин ТМП на 40–50 %. Протягом дальших 30–40 хв

ТМП характеризується значною варіабельністю, а потім

повертається до величин –55÷–60 мВ, і утримується на цьому рівні,

але без виражених періодичних коливань.

Рис. 2.20. Зміна ТПМ протягом періоду синхронних дроблень бластомерів і формування морули

при нормальному розвитку зародків в’юна