Реферат - Методы исследования пищевых продуктов
Подождите немного. Документ загружается.
Вопрос: Методы определения углеводов. Классификация
методов. Поляриметрический метод.
Методы определения углеводов.
С точки зрения пищевой химии, все углеводы, независимо от того простые они или
сложные, имеют большое значение не только как усваиваемые или неусваиваемые
человеком вещества, но и в отношении их важной роли в пищевых продуктах и в пищевых
технологиях. Углеводы, особенно крахмал и сахароза, обеспечивают основную часть
калорийности рациона и вносят значительный вклад в сенсорную оценку пищевых
продуктов. Углеводы также вносят большой вклад в текстуру продуктов, поскольку они
способны влиять на вязкость, кристаллизацию, гелеобразование, стабильность. Они
влияют на приятные ощущения во рту благодаря сладости, на цвет и аромат пищевых
продуктов благодаря их способности претерпевать химические превращения с
образованием окрашенных и ароматических веществ. При производстве многих пищевых
продуктов углеводы составляют один из главных сырьевых ресурсов для физических,
химических, биохимических и микробиологических процессов, управление которыми
позволяет получать широкую гамму продуктов питания разного назначения с различными
свойствам.
Моно- и олигосахариды. Для определения этих углеводов используют их
восстанавливающую способность. Сначала их извлекают из пищевых продуктов 80%-м
этиловым спиртом. Спиртовые экстракты упаривают под вакуумом, разбавляют горячей
водой и фильтруют. При анализе продуктов, относительно богатых белками и
фенольными соединениями, фильтрат дополнительно обрабатывают нейтральным
раствором ацетата свинца, избыток которого удаляют сульфатом, фосфатом или
оксалатом натрия. Осадок отфильтровывают, а в фильтрате определяют
восстанавливающие (редуцирующие) сахара с использованием гексацианоферрата (III)
калия, фелинговой жидкости или иодометрически. Для определения сахарозы (вместе с
редуцирующими сахарами) ее необходимо предварительно гидролизовать.
Качественный и количественный анализ отдельных сахаров проводят методами газо-
жидкостной, ионообменной или жидкостной хроматографией высокого разрешения.
Количественные определения сахаров проводят также методом ионометрии с
использованием ферментных электродов, обладающих исключительно высокой
селективностью к определенным сахарам.
Усваиваемые полисахариды. Определение крахмала основано, как правило, на
определении полученной при гидролизе глюкозы химическими методами или на
способности полученных растворов вращать плоскость поляризации. Для определения
крахмала необходимо предварительно освободиться от моно- и олигосахаридов
экстракцией 80%-м этанолом. Затем проводят извлечение крахмала из продукта каким-
либо способом (например, растворением сначала в холодной, потом в горячей воде) и
освобождаются от белков путем обработки раствора фосфорно-вольфрамовой кислотой,
ацетатом цинка, гексацианоферратом (III) калия или другими белковыми осадителями.
Определение крахмала проводят, как правило, путем определения глюкозы после
ферментативного или кислотного гидролиза. Для расчета используют соответствующие
коэффициенты. Можно применять метод поляриметрии.
Для определения декстринов их извлекают теплой (40°С) водой и осаждают 96%-м
этанолом, проводят гидролиз и определяют глюкозу. Для расчета используют
соответствующие коэффициенты. Можно использовать метод спектрофотометрии,
измеряя интенсивность окраски иод-крахмального комплекса.
Неусваиваемые углеводы. Общее содержание пищевых волокон (лигнин +
неусваиваемые углеводы) обычно определяют гравиметрическим методом. Анализ
заключается в использовании фракционирования — сначала растворяют крахмал и белки
при помощи ферментов, имитирующих расщепление их в желудочно-кишечном тракте
человека (α-амилаза, пепсин, панкреатин), растворимые пищевые волокна осаждают
спиртом, фильтруют, осадок взвешивают.
Пектин. Определение основано на извлечении пектина (растворимого пектина и
протопектина) из пищевого продукта, осаждении и взвешивании. Для извлечения
растворимого пектина применяют экстракцию холодной водой с последующим
кипячением. Для извлечения протопектина применяют кипячение с соляной кислотой
после извлечения растворимого пектина. Для продуктов, богатых крахмалом, применяют
специальные приемы его отделения. Для осаждения пектина проводят реакцию с
хлоридом кальция. Помимо взвешивания можно определять в осадке содержание кальция
комплексонометрически с трилоном Б и по этим данным рассчитывать содержание
пектина.
Гемицеллюлозы. Они гидролизуются труднее, чем пектин, их определяют после
удаления пектинов. Определение гемицеллюлоз основано на определении
восстанавливающих сахаров, полученных при кислотном или щелочном гидролизе. Для
расчета используются соответствующие коэффициенты.
Клетчатка. Метод определения клетчатки основан на проведении гидролиза
легкорастворимых углеводов при соответствующих условиях и получении
негидролизуемого остатка, который взвешивают.
Поляриметрический метод.
Поляриметрия - оптический неспектральный метод анализа, основанный на
вращении плоскополяризованного монохроматического луча света оптически
активными веществами. Метод предназначен для определения только оптически
активных веществ, способных вращать плоскость поляризации света.
В видимом свете колебания электромагнитной волны происходят в различных
направлениях. Плоскополяризованным называется свет, колебания которого
происходят в одной плоскости. При упорядоченных колебаниях в определенном
направлении свет поляризован линейно и обычно сохраняет первичное положение
плоскости поляризации. Получить плоскополяризованный свет можно с применением
кристаллов, способных пропускать свет одного определенного колебания. При
прохождении поляризованного света через оптически активное вещество происходит
поворот плоскости поляризации на некоторый угол, называемый углом вращения
плоскости поляризации (α). Этот угол зависит от природы оптически активного
вещества и растворителя, концентрации и толщины слоя раствора. Такая зависимость
описывается законом Био:
α=α
уд
∗1∗с
,
где α
уд
- удельное вращение плоскости поляризации света; 1 - толщина слоя
раствора (длина поляриметрической трубки), дм; с - концентрация вещества в
растворе, г/см
3
.
Каждое оптически активное вещество характеризуется определенным удельным
вращением плоскости поляризации света, происходящем при прохождении через
слой раствора толщиной 1 дм с концентрацией оптически активного вещества 1 г/см
3
.
Удельное вращение зависит от природы вещества, длины волны света,
температуры и обозначается, например,
[α]
уд
20
, где D - длина волны света желтой
линии натрия, 589 нм; температура раствора 20 °С. При выполнении анализа длина
волны света должна быть постоянна, термостатирование раствора обязательно.
По закону Био можно рассчитать концентрацию вещества в растворе, измерив угол
вращения плоскости поляризации света и зная удельное вращение вещества.
В поляриметрии возможны качественный анализ (идентификация вещества по
удельному или молярному вращению) и количественный анализ (определение
концентрации растворенного вещества). Угол вращения плоскости поляризации света
при прохождении его через анализируемый раствор измеряют на поляриметре.
Устройство поляриметра. Основными частями прибора являются источник
поляризованного света - поляризатор и блок измерения — анализатор (рис. 19).
Работа прибора основана на принципе уравнивания яркости разделенного на две
части поля зрения. Световой поток от лампы 1 проходит через дихроматный
светофильтр 2, где происходит монохроматизация света (λ = 590 нм), и конденсор 3,
попадает в поляризатор 4 - призму Николя, которая делит луч на две составляющие.
Рис. 19. Оптическая схема поляриметра-сахариметра: 1 - источник света; 2 — светофильтр; 3
- конденсор; 4 - поляризатор; 5 — поляриметрическая трубка; 6 — клин левого вращения; 7 -
контрклин и малый кварцевый клин; 8 - анализатор; 9 - окуляр
Поляризатор установлен так, что плоскости поляризации обоих лучей составляют
одинаковые углы с плоскостью поляризации аналогичной призмы — анализатора 8, т.
е. плоскости поляризатора и анализатора параллельны. При этом в окуляре 9 на-
блюдается равномерное яркое освещение двух полей (рис. 20, а).
Рис. 20. Изменение освещенности поля окуляра при измерениях.
При установлении поляриметрической кюветы 5 с раствором оптически активного
вещества равенство освещенности двух полей нарушается (рис. 20, б), поскольку
изменяется угол вращения плоскости поляризации одного из лучей при прохождении
через раствор.
Для измерения угла отклонения плоскости поляризации луча необходимо уравнять
освещенность обоих полей. Для этого в поляриметре применяют клиновой
компенсатор, состоящий из большого кварцевого клина левого вращения 6 (рис. 19),
контрклина и малого кварцевого клина правого вращения 7. Вращением большого
клина относительно малого подбирают толщину кварцевой пластинки, необходимую
для компенсации угла поворота плоскости поляризации луча. Плоскость поляризации
лучей в призме Николя перпендикулярна плоскости поляризации анализатора. При
этом освещенность обоих полей зрения уравнивается (рис. 20, в). Такое положение
называют настройкой прибора «на темноту». Одновременно с большим клином
перемещается шкала измерения угла
Международная сахарная шкала. Шкала поляриметра-сахариметра
проградуирована в градусах международной сахарной шкалы, °S. По этой шкале 100
°S соответствуют углу вращения плоскости поляризации света водным раствором,
содержащим 26,0000 г сахарозы, взвешенной с применением латунных разновесов на
аналитических весах, в 100 см
3
раствора (при 20 °С) в поляриметрической трубке
длиной 2 дм. При этом применяется белый свет и дихроматный светофильтр. Один
градус сахарной шкалы соответствует содержанию 0,26 г сахарозы в 100,0 см
3
раствора.
Пользуясь международной сахарной шкалой, можно непосредственно определять
массовую долю сахарозы (%) в анализируемом продукте. Для этого взвешивают
26,0000 г продукта и растворяют его в дистиллированной воде в мерной колбе вме -
стимостью 100 см
3
. Приготовленный раствор поляриметрируют в трубке длиной 2 дм.
Показания шкалы прибора соответствуют массовой доле сахарозы в пробе.
Для лактозы и глюкозы (гексозы) стандартная масса навески продукта составляет
33,0000 г; одно деление шкалы соответствует содержанию гексозы 0,33 г.
Правила работы на поляриметре. Перед началом измерений прибор
устанавливают на нуль. Для этого (при отсутствии в ячейке кюветы) вращением
рукоятки, расположенной в нижней части измерительного блока, добиваются полной
однородности полуосвещенности обеих половин поля зрения (настройка на
«темноту»). При этом нулевые деления нижней (подвижной) и верхней (нониус) шкал
должны совпадать (рис. 21, а).
Рис. 21. Шкала поляриметра-сахариметра с нониусом: а - отсчет по шкале 0 °S; б - отсчет по
шкале 14,80 °S
В ячейку прибора помещают поляриметрическую трубку (кювету) с анализируемым
раствором сахарозы. Однородность освещения половинок поля нарушается. Вращают
рукоятку измерительного блока против часовой стрелки и выравнивают освещенность обеих
половинок поля.
При помощи нониуса и подвижной шкалы вычисляют угол вращения с точностью до 0,05
°S. По шкале отмечают угол вращения, например, 14 °S (рис. 21, б), по нониусу - десятые и
сотые доли угла, например, 0,80 °S; угол вращения плоскости поляризации составляет 14,80
°S.
Правильность показаний поляриметра проверяют также с применением контрольной
кварцевой трубки, снабженной легко-вывинчивающимися кварцевыми пластинками с углом
вращения
— 40°S и + 100°S. Для этого помещают трубку в ячейку прибора, добиваются полной
однородности полуосвещенности обеих половин поля зрения. В этом положении шкала
прибора показывает 60,0 °S (алгебраическая сумма углов вращения обеих пластинок — 40
+ 100 = 60°S). Если из трубки вывинтить кварцевую пластинку с углом вращения — 40°S,
то шкала прибора должна показывать +100 °S; если поместить трубку без контрольной
пластинки + 100 °S, то прибор должен показать точно — 40 °S.
Правила пользования поляриметрическими кюветами. Кюветы выполнены в виде
трубок различной длины из полимерного стекла или стали, закрывающихся с обеих сторон
поляриметрическими стеклами, и прижимаются к торцам трубки пластмассовыми
колпачками.
Перед наполнением поляриметрическую трубку промывают дистиллированной водой и
ополаскивают анализируемым раствором. Трубку заполняют раствором до образования
выпуклого мениска и закрывают сверху стеклом, надвигая его на торец трубки со стороны,
как бы срезая выступающую жидкость. Стекло должно быть сухим. После плотного
закручивания колпачка в трубке не должно быть воздушных пузырьков, иначе заполнение
необходимо повторить.
Вопрос: Электрофоретическое определение фракций
белков. Примеры.
Принцип методов электрофоретического разделения заключается в
способности молекул пептидов и аминокислот, находясь в заряженной форме в виде
катионов (+) или анионов (-), передвигаться в электрическом поле с определенной
скоростью. Кроме того, молекулы с близкими зарядами, но разными размерами,
отличаются отношением заряда к массе. Все эти различия и обуславливают высокую
разрешающую способность электрофоретических методов. Скорость миграции белков в
электрическом поле (V) зависит от напряжения электрического поля(г), заряда белков (z) и
сопротивления трения (О-Сопротивление трения определяется размерами, формой
белка, значениями рН и концентрацией буфера. Указанные величины связаны между
собой соотношением:
V = е • z / f.
Впервые метод электрофореза был разработан Тизелиусом с применением бумаги в
качестве носителя и специальных оптических устройств, регистрирующих передвижение
границы раздела раствора белка и растворителя по показателям преломления
(фронтальный электрофорез). В настоящее время распространены методы зонального
электрофореза, предусматривающие использование крахмальных и полиакриламидных
гелей (ПААГ). Наиболее распространенным методом фракционирования белков является
диск-электрофорез (от англ, discontinuous - прерывистый) в ПААГ, при котором
используется пара буферных растворов с различными значениями рН в присутствии ДДС
Na и гели различной пористости (концентрирующие и разделяющие) (Laemmli, 1970). Для
обнаружения белков гели обрабатывают красителями: амидовым черным 10В, кумасси
синим R-250. Интенсивность окраски, а по ней количественное содержание белковых
фракций, определяют сканированием на денситометре.
Для электрофоретического разделения белков и пептидов успешно применяется
двумерный электрофорез в ПААГ. В соответствии с этим методом смесь компонентов
разделяют сначала в столбиках геля электрофорезом в горизонтальном направлении,
затем в гелевых пластинах - в вертикальном (рис. 2.23). При разделении белков,
например гороха, этим методом удалось получить более 150 различных компонентов.
Рис. 2.23. Двумерный электрофорез
Очень высокую разрешающую способность имеет метод изоэлектрического
фокусирования белков, в основе которого лежит фронтальный электрофорез,
проводимый на колонке одновременно в градиенте рН и напряжения. Колонку
предварительно заполняют носителями с синтетическими смесями
полиаминополикарбоновых кислот (амфолитами), затем сверху в нее подают раствор
сильной кислоты, снизу - сильнощелочной раствор для того, чтобы установить градиент
рН с крайними значениями, соответствующими рН кислого и щелочного растворов.
Амфолиты прекращают движение по колонке, когда их суммарный заряд становится
равным нулю, и тем самым стабилизируют исходный градиент рН. В подготовленную
колонку вносят образец исследуемой смеси, компоненты которой распределяются по
зонам со значениями рН, характерными их изоэлектрическим точкам.
В химии пищевого белка применяют и другие разновидности:
э
лектрофоретического
разделения(иммуноэлектрофорез, изотахофорез), а так же мет од пептидны х к ар т
и ультрацент ри фугиров ание. Метод пептидных карт (отпечатков пальцев)
относится к методам двумерного разделения и наиболее часто используется для анализа
пептидов. Пептиды получают избирательным гидролизом белков, затем на бумаге их
разделяют в горизонтальном направлении электрофорезом, в вертикальном -
распределительной хроматографией. Пептиды окрашивают нингидрином, элюируют и
определяют аминокислотный состав.
Список используемой литературы:
1. Скурихин И.М., Нечаев А.П. Все о пище с точки зрения химика. М.: Высшая
школа, 1991.
2. Общая технология пищевых производств. Под ред. Н.И. Назарова. М.: Легкая и
пищевая промышленность, 1981.
3. Ковальская Л.П., Мелькина Г.М., и др. Технология пищевых производств. М.:
Агропромиздат, 1988.
4. Нечаев А.П., Шуб И.С. и др. Технология пищевых производств. М.: КолосС,
2005.
5. Нечаев А.П., Траубенберг Светлана Евгеньевна, Кочеткова Алла Алексеевна,
Нечаев А.П. Пищевая химия, 2003.