Москалев А.А. Старение и гены

Подождите немного. Документ загружается.

и генетических особенностей со сходными по размеру долгожи-

вущими видами — голым слепышом, летучими мышами, некото-

рыми птицами. Несмотря на то что гены долгожительства мышей

были открыты позже, чем у других объектов, грызуны стали одной

из первых моделей, для которых было показано позитивное дейст-

вие ограничения калорийности питания. Оказалось, что это уни-

версальное внешнесредовое воздействие, продлевающее жизнь и

замедляющее старение у всех исследованных с этой точки зрения

видов (McCay et al., 1939). Мыши являются удобной моделью изу-

чения возрастзависимой динамики экспрессии генов.

Однако имеются и существенные ограничения при распро-

странении на человека выводов, полученных на мышах. Во-пер-

вых, мыши характеризуются ускоренным старением, тогда как че-

ловек — постепенным (Finch, 1998). Во-вторых, различия касают-

ся исследований связи клеточного старения и старения организма

в целом. В отличие от клеток человека и приматов, клетки лабора-

торных мышей имеют чрезвычайно длинные теломеры, поэтому

не испытывают репликативного старения (Weinstein, Ciszek, 2002;

Pelicci, 2004). В то же время клетки мышей гораздо более чувстви-

тельны к окислительным повреждениям — стресс-индуцирован-

ному преждевременному старению, чем клетки человека (Weinert,

Timiras, 2003). Кроме того, у мышей, так же как у нематод и дрозо-

фил, выключение рецептора инсулина в жировой ткани приводит к

увеличению продолжительности жизни, тогда как у человека на-

рушение инсулинового сигналинга ведет к сахарному диабету.

Таким образом, в качестве наиболее генетически близкого к

человеку короткоживущего модельного объекта мыши играют важ-

ную роль в проверке механизмов старения, выявленных на более

простых моделях. Анализ (табл. 8) показывает, что все гены долго-

жительства мышей имеют ортологов у человека.

1.3.5. Человек

Несмотря на огромный вклад в генетику старения, мо-

дельные системы, описанные в предыдущих разделах, имеют

определенные ограничения при экстраполяции полученных с их

помощью данных на человека. Во-первых, они относятся к быст-

ростареющим животным. Мутации, продлевающие их жизнь, до-

бавляют недели или месяцы жизни беспозвоночным и год или ме-

нее грызунам. Это так называемые «r-стратеги», характеризую-

щиеся быстрыми темпами развития, высокой плодовитостью и

короткой продолжительностью жизни. Для человека характерна

«K-стратегия», отличающаяся длинным периодом развития, не-

большим потомством и относительным долгожительством. Не-

удивительно, что некоторые маркеры старения человека (напри-

мер, полиморфный локус CETP) у грызунов и беспозвоночных

не обнаружены. В случае с модельными организмами мы зачас-

тую мало знаем о патофизиологии их старения. Дополнительные

уникальные быстроэволюционирующие интронные после-

довательности ДНК отличают Homo sapiens даже от ближайших

родственников — шимпанзе (Pan troglodytes), чья продолжитель-

ность жизни вдвое меньше. Наконец, генетика модельных объек-

тов ограничена исследованиями высокоинбредных организмов в

однотипном средовом окружении, тогда как современная генетика

человека имеет дело с огромным разнообразием межгенных и ген-

но-средовых взаимодействий, что позволяет вскрыть причины ме-

жиндивидуальных отличий в продолжительности жизни (Martin

et al., 2007). Для изучения генетики старения человека разрабо-

таны методы анализа клеточного старения в культуре клеток и тех-

нологии экспрессионных микрочипов, используются также близ-

нецовый метод и исследование долгожителей.

Существует три подхода к генетическому анализу биологии

старения человека. Первый и самый развитый — поиск биохи-

мических и генетических основ варьирования чувствительности к

основным гериатрическим заболеваниям. К нему относится изуче-

ние прогероидных синдромов. Если принять во внимание, что

главным фактором риска практически всех гериатрических болез-

ней является биологическое старение, то синдромы ускоренного

старения могут служить отправной точкой в исследованиях при-

чин старения. Второй подход — поиск аллелей, обусловливающих

экстраординарное продление жизни. Хотя ранее обнаруженная

связь долгожительства с локусом на хромосоме 4 не была под-

тверждена, ассоциативные исследования позволили выявить су-

ществование полиморфизмов, имеющих отношение к продолжи-

тельности жизни. Третий подход существует в проекте. Он по-

требует долговременного исследования большого количества пар

сибсов среднего возраста, в высшей степени дискордантных или

конкордантных по скорости снижения разнообразных физиологи-

ческих функций (Martin et al., 2007).

Какова «естественная» продолжительность жизни человека?

Анализ продолжительности жизни 53 родов приматов показал, что

вариация по этому показателю может быть объяснена массой моз-

га и размерами тела. Основываясь на этой модели, «естественная»

продолжительность жизни представителей рода Homo должна на-

ходиться в пределах 52—90 лет (Bronikowski et al., 2002). Остеоло-

гический анализ останков показывает, что предки человека в сред-

нем жили 36 лет, их возраст редко превышал 50-лет. Однако иссле-

дования предконтактных охотников-собирателей свидетельствуют

о том, что наши предки имели более длинную жизнь. В среднем

15-летний представитель племени Dobe !Kung доживает до 69

лет. Ожидаемая продолжительность жизни лесных жителей Ache

15-летнего возраста сотавляет 52 (мужчины) и 58 (женщины) лет.

Для примера отметим, что в 1900 г. в США 15-летний индивидуум

доживал до 62 лет, в настоящее время — до 77 лет (совмещенные

данные по мужчинам и женщинам всех рас) (Bronikowski et al.,

2002). Увеличение продолжительности жизни в индустриа-

лизованных обществах за последнее столетие — результат умень-

шения основной смертности, т. е. улучшения общего состояния

здоровья, но не снижения накопления возрастзависимых повреж-

дений (Partridge et al., 2005). Иными словами, это следствие про-

изошедшего в середине XX века «эпидемиологического скачка»,

приведшего к снижению темпов смертности от острых инфек-

ционных заболеваний (в связи с развитием гигиены и открытием

антибиотиков). За ним последовало (в 70—80-х годах) вторичное

снижение смертности от сердечно-сосудистых заболеваний в ста-

ром возрасте (Weinert, Timiras, 2003). Тем не менее для осуществ-

ления качественно нового скачка долгожительства и достижения

«благополучного» старения (без патологий) не обойтись без по-

нимания генетических механизмов продолжительности жизни.

Имеющийся в настоящий момент арсенал молекулярно-генетиче-

ских и клинических методов исследования вселяет уверенность

в прогрессе данного направления биогеронтологии. Возможно,

что уже в ближайшем будущем человек станет первостепенным

источником инфорации о «геронтогенах», вытеснив другие объек-

ты исследований на второй план.

Глава 2

МЕХАНИЗМЫ СТАРЕНИЯ

2.1. Клеточное старение

2.1.1. Репликативное и стресс-индуцированное

старение клеток

Август Вейсман еще в XIX веке предложил в качестве

механизма запрограммированного старения ограничение числа де-

лений соматических клеток (герминативные клетки в отличие от

соматических делятся бесконечно). Различия в продолжительнос-

ти жизни животных он пытался объяснить количеством клеточных

генераций (цит. по: Gavrilov, Gavrilova, 2002). Однако впоследст-

вии Алексис Каррель, культивировавший фибробласты сердца цып-

ленка на протяжении десятков лет, обнаружил, что клетки в куль-

туре бессмертны при соблюдении подходящих условий существо-

вания (Carrel, Ebeling, 1921).

Данная точка зрения главенствовала до конца 50-х годов XX ве-

ка, когда было обнаружено старение клеток в культуре, полу-

чившее название лимита Хейфлика (Hayflick, Moorhead, 1961).

Принцип эксперимента Хейфлика и Мурхеда был прост: смешали

равные части нормальных мужских фибробластов, прошедших

40 удвоений популяции в культуре (старые клетки), и женских

фибробластов, выдержавших только 10 удвоений. Когда конт-

рольная несмешанная популяция мужских клеток перестала де-

литься, смешанная опытная культура содержала только женские

клетки — все мужские клетки уже погибли (Hayflick, Moorhead,

1961). Таким образом, Хейфлик заключил, что нормальные клет-

ки имеют ограниченную способность к делению в отличие от ра-

ковых клеток, которые иммортальны (Shay, Wright, 2000). Возник-

ло предположение, что «митотические часы» находятся внутри

каждой клетки, о чем свидетельствовали два наблюдения: 1) нор-

мальные фетальные человеческие фибробласты в культуре подвер-

гаются только определенному числу удвоений популяции; 2) крио-

генно сохраненные клетки «помнят» сколько раз они делились до

заморозки.

Согласно распространенной точке зрения, лимит Хейфлика яв-

ляется проявлением механизма, возникшего у многоклеточных

организмов для подавления опухолеобразования. Другими слова-

ми, опухолесупрессорные механизмы, такие как репликативное

старение и апоптоз, полезны в раннем онтогенезе и зрелости, но

побочно являются причиной старения (Keyes et al., 2005; Campi-

si, d’Adda di Fagagna, 2007). В этом заключается их антагони-

стическая плейотропия. Стимулируя раннюю жизнеспособность,

уменьшая вероятность возникновения рака и являясь барьером на

пути накопления мутаций, они ограничивают продолжительность

жизни в результате накопления дисфункциональных стареющих

клеток или избыточной гибели функциональных (Zhang H. et al.,

2003; Campisi, 2005).

Многоклеточные организмы содержат соматические клетки

двух различных типов: постмитотические, не способные делить-

ся, и митотически компетентные. У многих простых организмов,

подобных дрозофиле и Caenorhabditis elegans, постмитотические

клетки у взрослых особей преобладают. У более сложных живот-

ных, таких как млекопитающие, напротив, многие соматические

ткани содержат митотические клетки. Такие ткани имеют пре-

имущество, поскольку они способны к обновлению, репарации и

в ряде случаев к регенерации (Campisi, 2005). Появление спо-

собности к обновлению соматических тканей, вероятно, позволи-

ло значительно увеличить продолжительность жизни организмов.

Однако обновляемые ткани чувствительны к гиперпролифератив-

ным заболеваниям, наиболее смертельным из которых является

рак. Это происходит потому, что, во-первых, нарушение регуля-

ции пролиферации клеток служит важным шагом на пути к раку,

во-вторых, репликация ДНК увеличивает вероятность приобрете-

ния соматических мутаций, в том числе ведущих к опухолеобразо-

ванию (Campisi, 2005). Таким образом, у сложных организмов уве-

личение продолжительности жизни привело к опасности заболеть

раком. Это вызвало необходимость коэволюции механизмов реге-

нерации тканей и супрессии опухолей.

Одна мутантная клетка должна дать миллионы потомков, что-

бы редкие мутационные события встретились в опасном сочета-

нии. Более того, большинство раковых мутаций являются рецес-

сивными, а это значит, что обе копии гена должны нести мутации.

Обычно это происходит в результате редкого события нерасхож-

дения хромосом, при котором обе нормальные копии уходят од-

ной дочерней клетке, тогда как другая не имеет нормальной копии

вовсе. В результате клетка получает способность экспрессировать

рецессивную, потенциально раковую мутацию. Она опять дол-

жна дать миллион клеток-потомков, прежде чем произойдет новая

необходимая для озлокачествления мутация. Это соответствует

20—40 клеточным делениям на одну мутацию. Общепринято, что

одной-единственной клетке требуется от четырех до шести мута-

ций для превращения в злокачественную (если эпигенетические

изменения не ускорят этот процесс). Таким образом, ограничения

общего числа делений до 100 вполне достаточно, чтобы предот-

вратить получение «недостающих» мутаций предраковой клеткой

с одной-двумя предрасполагающими к возникновению рака мута-

циями. Возможно, что репликативное старение клеток человека

позволяет «подсчитывать» число делений. Вероятно, лишь немно-

гие предки людей жили дольше 30—40 лет из-за болезней и давле-

ния хищников. В результате эволюция нашла баланс между заме-

ной клеток (тканевой репарацией) и остановкой пролиферации.

Это привело к ограничению числа клеточных делений на уровне

50—80 (для фибробластов в культуре клеток), что соответствует

возрасту 40 лет, без лишнего запаса делений. Современные успехи

санитарии, профилактики и лечения заболеваний привели к тому,

что продолжительность жизни большой массы людей

существенно выше 40 лет . Поэтому репликативное старение,

играющее позитивную роль до достижения этого возраста,

вносит свой вклад в снижение функционирования тканей в

старости (Wright, Shay, 2005а).

Клетки у организмов с обновляемыми тканями постоянно вы-

ходят из клеточного цикла в ответ на повреждение ДНК, наруше-

ние хроматина и на сильные митогенные сигналы (сверхактивация

протоонкогенов Ras, Raf, Mek, Mos, E2F-1). Данный вид ответа, на-

зываемый клеточным старением, прежде всего контролируется су-

прессорами опухолей (p53 и RB) и, как уже говорилось, является

потенциальным противораковым механизмом (Macip et al., 2002;

Campisi, 2005; Campisi, d’Adda di Fagagna, 2007).

Чем характеризуются стареющие клетки? Они существенно

отличаются от молодых клеток по морфологии: увеличены в раз-

мерах, иногда имеют несколько ядер, избыточно вакуолизованы,

уплощены; кроме того, они отличаются экспрессией генов и дру-

гими своими функциональными характеристиками (Cao et al.,

2003; Kurz, 2004; Papazoglu, Mills, 2007). Например, стареющие

фибробласты человека устойчивы к церамид-индуцируемой про-

граммированной гибели клеток либо к апоптозу, вызванному ли-

шением ростовых факторов или оксидативным стрессом (но не

Fas-лигандом). Однако не все стареющие клетки теряют чувстви-

тельность к апоптозу. Так, стареющие эндотелиальные клетки или

лимфоциты предпочитают клеточному старению апоптоз (Campi-

si, d’Adda di Fagagna, 2007). По-видимому, устойчивость к апопто-

зу позволяет фибробластам и эпителиальным клеткам продолжать

выполнять свои функции в ткани, несмотря на серьезные повреж-

дения. В противном случае такая ткань быстро дегенерировала бы,

поскольку с возрастом происходит снижение способности к ком-

пенсаторной пролиферации.

In vivo стареющие клетки в ткани обнаружить непросто, так

как их трудно отличить от покоящихся или терминально диффе-

ренцированных клеток. Однако были выявлены специфичные био-

маркеры клеточного старения: старение-ассоциированная •-

галак-тозидаза, регулятор старения p16, белки DEC1, p15 и DCR2

(Dimri et al., 1995; Kurz, 2004; Campisi, d’Adda di Fagagna, 2007).

Таким образом, было доказано накопление с возрастом in vivo

клеток с признаками старения (Dimri et al., 1995).

Различают репликативную и стресс-индуцированную формы

клеточного старения (Weinert, Timiras, 2003).

Репликативное старение — это перманентное неделящееся со-

стояние, которое возникает в соматических клетках после опреде-

ленного количества клеточных делений. В идеальных условиях

клеточной культуры неопухолевые соматические клетки способ-

ны совершать несколько десятков митозов, после чего стареют.

Стареющие клетки блокируются в G

-фазе клеточного цикла, по-

сле чего они уже не способны реплицироваться, оставаясь метабо-

лически активными и жизнеспособными.

Фибробласты человека с мутацией гена ключевого сенсора по-

вреждения ДНК — ATM (ataxia-telangiectasia mutated), в кото-

рых сверхэкспрессирована каталитическая субъединица теломера-

зы (hTERT), приводящая к удлинению теломер, защищены от преж-

девременного репликативного старения. Однако они по-прежнему

подвержены активации проверочной точки G

и гиперчувстви-

тельны к ионизирующей радиации. Таким образом, в дополне-

ние к репликативному старению фибробласты подвергаются еще

и стресс-индуцированному преждевременному старению (SIPS).

Оно часто возникает при повреждении ДНК, индуцированном

ультрафиолетом или рентгеновским облучением, оксидативным

стрессом (H

или гипероксия), воздействием этанола и ингиби-

торов деацетилаз гистонов. Данный вид старения фенотипически

похож на репликативное: наблюдается увеличение и уплощение

клеток, позитивное окрашивание на старение-ассоциированную

β-галактозидазу, прекращение синтеза ДНК, накопление р53, р21

и р16, фосфорилирование р38 митоген-активируемой протеинки-

назы — p38 MAPK (Naka et al., 2004; Pascal et al., 2005). SIPS может

вносить значительный вклад в клеточное старение в целом. У мы-

шей оно полностью замещает репликативное старение. Тогда как

фибробласты человека способны делиться в культуре при нор-

мальной концентрации кислорода 40—60 раз, клетки мышей —

около 14 раз. Дело в том, что фибробласты мышей вступают в

стресс-индуцированное старение в ответ на обычную концентра-

цию кислорода (20 %), однако при 3 % кислорода клетки мышей не

подвергаются репликативному старению вовсе (мышиные клет-

ки имеют очень длинные теломеры). Эти данные определяют мес-

то клеточного старения, по крайней мере стресс-индуцирован-

ного, в свободнорадикальной теории старения (Weinert, Timiras,

2003).

Репликативное старение определяется количеством делений

клеточной популяции; следовательно, существуют некие «мито-

тические часы», способные записывать эти деления. На роль таких

часов претендуют теломеры (Оловников, 1971). Укорочение тело-

мер может также быть ассоциировано с SIPS, так как сверхэксп-

рессия антиоксидантных белков в фибробластах человека замед-

ляет скорость укорочения теломер и продлевает их жизнь (Naka

et al., 2004; Pascal et al., 2005). Рассмотрим теломеразависимые ме-

ханизмы репликативного старения.

2.1.2. Теломеры и теломераза

Теломеры, структуры на концах линейных хромосом

эукариот, были впервые описаны в первой половине XX века Гер-

маном Мёллером в его классическом исследовании на дрозофиле

(Muller, 1938). Он отметил, что хромосомные инверсии, происхо-

дящие при радиационно-индуцируемых двухцепочечных разры-

вах, никогда не содержат самый конец хромосомы. Он же ввел тер-

мин «теломера» от греческих слов «телос» (конец) и «мерос»

(часть). Спустя некоторое время Барбара Мак-Клинток обнаружи-

ла, что, в то время как нарушенные концы хромосом кукурузы сли-

ваются, образуя дицентрики, ненарушенные концы не вызывают

аберраций (McClintock, 1941). Таким образом, была доказана за-

щитная роль теломер.

Почти сразу после открытия полуконсервативной природы ре-

пликации ДНК было показано, что 3'-концы линейных хромосом

не могут копироваться репликационной машиной из-за РНК-прай-

мера, инициирующего синтез ДНК de novo и удаляемого при про-

цессинге фрагментов Оказаки. Возникла идея, что с каждым кле-

точным делением теряется короткий сегмент 5'-концевой дочерней

цепи ДНК (Оловников, 1971; Olovnikov, 1973). Данное укорочение

не нарушает целостности генома до превышения критической ве-

личины. Подобные же изменения в теломерах могут также быть

вызваны экзонуклеазами, обрабатывающими 5'-конец родитель-

ской цепи, и активными формами кислорода (Herbig, Sedivy, 2006).

В 1978 г. Элизабет Блекберн обнаружила, что теломеры рес-

ничного простейшего Tetrahymena thermophila состоят из просто-

го гексамерного повтора TTGGGG (Blackburn, Gall, 1978). Тело-

меры клеток человека также состоят из тысяч повторов, но уже

нуклеотидов TTAGGG. В 1986 г. было показано, что теломеры че-

ловека не во всех тканях имеют одинаковую длину и что при деле-

ниях нормальных фибробластов в культуре они укорачиваются

(Shay, Wright, 2000).

Однако оставалась проблема теломер в половых и раковых

клетках высших организмов. В 1985 г. Кароль Грейдер открыла

у Tetrahymena фермент теломеразу, синтезирующую повторы и

удлиняющую теломеры (Greider, Blackburn, 1985). Позже этот фер-

мент был обнаружен в экстрактах иммортальных клеточных ли-

ний человека и в большинстве опухолей (Shay, Wright, 2000). На-

конец, в 1998 г. внесение в геном фибробластов активной копии

гена фермента теломеразы, достраивающего теломеры, доказало

возможноть продления жизни клеточных популяций (Bodnar et al.,

1998; Vaziri, Benchimol, 1998).

Теломеры — высокоспециализированные гетерохроматиновые

ДНК-белковые структуры, защищающие концы хромосом эука-

риотических клеток от деградации, рекомбинации или объеди-

нения (Chai et al., 2005; Franco et al., 2005). Они необходимы для

поддержания стабильности генома, точной репликации хромосом,

опосредуют регуляцию клеточного цикла, перемещение и локали-

зацию хромосом в ядре, транскрипционную регуляцию субтело-

мерных генов, а также репликативное клеточное старение. У ря-

да эукариотов теломеры имеют дополнительные специфические

функции. Например, частая конверсия субтеломерных генов опре-

деляет разнообразие поверхностных антигенов у трипаносом, бы-

стро эволюционирующие семейства субтеломерных генов дают

селективные преимущества линиям дрожжей (Riethman et al.,

2004).

Структура теломер у большинства эукариотов высококонсер-

вативна и представляет собой короткие прямые повторы, богатые

G (на 3'-конце) и C (в комплементарной цепи). Например, тело-

мерная ДНК человека состоит из 5000—15 000 пар оснований по-

вторяющихся гексамеров TTAGGG, следующих за одноцепочеч-

ным выступом размером 100—400 нуклеотидов на 3'-конце G-бо-

гатой цепи (Kurz, 2004; Chai et al., 2005; Franco et al., 2005; LeBel,

Wellinger, 2005; Herbig, Sedivy, 2006).

В норме теломерные концы не распознаются в качестве по-

врежденной ДНК, что обусловлено различными защитными меха-

низмами. Одноцепочечные 3'-выступы теломер могут быть защи-

щены белками, связывающимися с одноцепочечной ДНК, такими