Лысак В.В. Микробиология

Подождите немного. Документ загружается.

Рис. 27. Строение вируса с кубической симметрией

Кроме того, вирусы подразделяют на две группы по наличию в ви-

русной частице той или иной нуклеиновой кислоты:

• ДНК-содержащие, имеющие в качестве генетического материала

либо одно-, либо двухцепочечную ДНК, которая может быть как линей-

ной, так и кольцевой. Примером ДНК-содержащих вирусов являются ко-

лифаги Т2, Т4, λ ; вирус простого герпеса; вирус оспы и др.

• РНК-содержащие вирусы, генетическая информация которых

представлена РНК. РНК также может быть как одно-, так и двухцепо-

чечной. Вирусы с одноцепочечной РНК можно разделить, в свою оче-

редь, на два типа: с «плюс»-цепью РНК и с «минус»-цепью РНК. У виру-

сов первого типа цепь РНК может функционировать в клетке

-хозяине

непосредственно как информационная РНК, тогда как у вирусов второго

типа на «минус»-цепи должна синтезироваться сначала с помощью кле-

точных РНК-полимераз «плюс»-цепь РНК, которая и служит информа-

ционной РНК. Примером РНК-содержащих вирусов являются реовиру-

сы, вирус гриппа, ретровирусы и др.

В зависимости от организма хозяина выделяют

вирусы, инфицирую-

щие животных и человека, растения и микроорганизмы.

Вирусы растений иначе называются фитопатогенными вирусами. Эти

вирусы попадают внутрь растительных клеток через поражения расти-

тельной ткани или с помощью переносчиков насекомых либо нематод.

Фитопатогенные вирусы вызывают у растений множество болезней, осо-

бенно большой вред приносят вирусы, поражающие картофель.

У человека вирусы

вызывают множество заболеваний, включая оспу,

грипп, корь, свинку, инфекционный гепатит, желтую лихорадку, полио-

миелит, герпес, бешенство, СПИД, раковые заболевания и др. Многие

вирусные заболевания у человека и животных можно предупредить пу-

тем иммунизации. Вирусные заболевания трудно поддаются лечению,

так как вирусы не чувствительны к большинству известных антибиоти-

ков. Вирусы животных

и человека передаются контактным путем, с по-

мощью насекомых-переносчиков, а также через объекты окружающей

среды.

Вирусы бактерий называются бактериофагами (фагами). Вероятно,

в природе не существует бактерий, которые не были бы чувствительны-

ми к одному из типов бактериофагов.

3.2. Строение бактериофагов. Взаимодействие бактериофагов

с чувствительными клетками бактерий

Строение бактериофагов можно рассмотреть на примере колифага

Т4, электронная микрофотография которого была получена одной из

первых. Этот бактериофаг, как и все Т-четные колифаги, относится к

сложным вирусам, т. е. он состоит из икосаэдрической головки диамет-

ром 650 Å, длиной 950 Å и отростка, или хвоста (рис. 28). В капсиде

головки находится плотно упакованная двухцепочечная линейная

ДНК и

фермент транскриптаза в неактивном состоянии. Отросток фага имеет

сложное строение. В нем различают полый стержень, покрытый сокра-

тимым чехлом, который заканчивается базальной пластинкой с шипами

и нитями. Все структуры отростка имеют белковую природу. В области

базальной пластинки находится фермент – бактериофаговый лизоцим,

способный разрушать муреин клеточной стенки бактерий. Здесь

же име-

ется АТФаза, которая регенерирует энергию для сокращения чехла отро-

стка бактериофага.

Головка

ДНК

Стержень

Воротничок

Чехол

Базальная

пластинка

Нить

Рис. 28. Строение бактериофага Т4

Некоторые изученные бактериофаги имеют более простое строение.

В зависимости от формы зрелых фаговых частиц различают следующие

морфологические типы бактериофагов:

• состоящие из икосаэдрической головки и спирального хвоста с сок-

ратимым чехлом (Т-четные колифаги);

• состоящие из икосаэдрической головки и длинного гибкого несок-

ратимого отростка (колифаги Т1 и Т5);

• нитчатые бактериофаги (колифаг fd);

• состоящие из икосаэдрической головки с коротким несократимым

отростком (колифаги Т3 и Т7, фаг Р22 бактерий Salmonella typhimurium).

Большинство бактериофагов содержит двухцепочечную ДНК, но оха-

рактеризованы и бактериофаги с одноцепочечной ДНК (колифаг М13) и

с одноцепочечной РНК (колифаги fr, Qβ, R17).

В зависимости от особенностей размножения в чувствительной клет-

ке бактериофаги подразделяются на две группы

: вирулентные и умерен-

ные. Вирулентные фаги всегда лизируют зараженные ими бактерии и

имеют только один путь развития – литический цикл. Умеренные фаги

могут вести себя двояко: после проникновения в клетку нуклеиновая ки-

слота фага либо вовлекается в литический цикл, либо вступает с клеткой-

хозяином в своего рода симбиотические отношения, т. е.

встраивается в

хромосому бактериальной клетки и превращается в профаг, передаваясь

всему потомству данной клетки (лизогенный путь). Бактерии, которые

содержат профаг, называются лизогенными (рис. 29).

Рассмотрим взаимодействие вирулентных фагов с чувствительной

клеткой хозяином на примере колифага Т4.

При смешивании взвеси фаговых частиц с суспензией бактерий фаго-

вые частицы в результате случайных столкновений с

клетками бактерий

прикрепляются к последним (адсорбируются). Адсорбция происходит на

рецепторах, имеющихся в наружной мембране бактерий E. coli. За ад-

сорбцией следует стадия инъекции, или введения ДНК, в клетку. Бакте-

риофаговый лизоцим разрушает клеточную стенку бактерий и с затрата-

ми энергии, регенерируемой АТФазой, происходит сокращение чехла

бактериофага. При этом прокалывается цитоплазматическая мембрана,

полый стержень входит в бактериальную клетку и ДНК фага впрыскива-

ется в нее.

Инъецированная ДНК вызывает полную перестройку метаболизма

клетки: прекращается синтез бактериальной ДНК, РНК и белков. ДНК

бактериофага начинает транскрибироваться с помощью собственного

фермента транскриптазы, который после попадания в бактериальную

клетку активируется. Синтезируются сначала ранние, а затем поздние

иРНК, которые поступают на рибосомы клетки-хозяина, где синтезиру-

ются ранние (ДНК-полимеразы, нуклеазы) и поздние (белки капсида и

хвостового отростка, ферменты лизоцим, АТФаза и транскриптаза) белки

бактериофага. Репликация ДНК бактериофага происходит по полукон-

сервативному механизму и осуществляется с участием собственных

ДНК-полимераз.

Литический цикл

Лизогенный

путь

Рис. 29. Взаимодействие умеренных и вирулентных бактериофагов

с чувствительной клеткой:

А – адсорбция фага на клетке; Б – интеграция фаговой ДНК в хромосому бактерий; В –

репликация фаговой ДНК вместе с бактериальной; Г – деление клетки; Д – репликация фаго-

вой ДНК и синтез фаговых белков; Е – образование капсидов; Ж – упаковка ДНК в капсиды;

З – созревание фаговых частиц; И – лизис клетки и выход фаговых частиц

После синтеза поздних белков и завершения репликации ДНК насту-

пает заключительный процесс – созревание фаговых частиц или соеди-

нение фаговой ДНК с белком оболочки и образование зрелых инфекци-

онных фаговых частиц. Созревание Т-четных фагов – сложный много-

ступенчатый процесс. Сначала образуются капсиды, наполненные внут-

ри белками. После растворения этих внутренних белков готовые головки

заполняются ДНК в определенном количестве, зависящем от типа фага, и

закрываются. На завершающей стадии происходит присоединение ком-

понентов отростка и образуются зрелые фаговые частицы, которые после

лизиса клетки-хозяина под действием лизоцима бактериофага высвобож-

даются

. Оказавшись во внешней среде, они могут адсорбироваться на

чувствительных клетках и повторять весь процесс инфекции. Литиче-

ский цикл фага Т4 длится обычно 25 мин.

Развитие умеренных фагов (лизогения) подробно охарактеризовано

для колифага λ. Это сложный фаг, содержащий линейную двухцепочеч-

ную ДНК. На 5′-конце каждой ее цепи имеется одноцепочечная последо-

вательность

из 12 нуклеотидов – так называемые липкие концы (cos-

сайты). Сразу же после проникновения фаговой ДНК в бактериальную

клетку липкие концы ДНК ковалентно соединяются ДНК-лигазой клет-

ки-хозяина и образуется кольцевая молекула.

Далее, как правило, эта кольцевая молекула бактериофаговой ДНК не

приступает к транскрипции, а встраивается в бактериальную хромосому.

Установлено, что

гены фага λ кодируют синтез четырех регуляторных

белков, один из которых репрессорный белок сI (кодируется геном сI)

блокирует развитие событий литического цикла, а антирепрессорный бе-

лок Cro (кодируется геном сro), наоборот, запускает их. После поступле-

ния ДНК фага λ в клетку выбор между литическим и лизогенным путем

развития зависит от относительной

скорости накопления регуляторных

белков: если преобладает антирепрессорная функция белка Cro, то раз-

виваются события литического цикла, если успевает проявиться функция

репрессорного белка сI, литический цикл не осуществляется, так как бе-

лок сІ связывается с ДНК фага λ в особых участках, препятствуя

транскрипции фаговых генов.

Встраивание ДНК фага λ в бактериальную хромосому

осуществляет-

ся согласно интегративной модели А. Кемпбелла. Этот процесс назы-

вается сайт-специфической рекомбинацией, так как встраивание ДНК

фага λ осуществляется в одном и том же месте (сайте) между генами gal

и bio и не зависит от recA-системы бактериальной клетки.

За интеграцию ДНК фага λ ответствен фермент – лямбда-интеграза.

Этот

фермент узнает две разные последовательности: одну в хромосом-

ной ДНК (attλ), а другую – в ДНК фага (b

), с последующим разрывом

молекул ДНК и их перекрестным воссоединением.

Завершением процесса является то, что ДНК фага λ реплицируется с

клеточной ДНК как единая структура, и все дочерние клетки при деле-

нии получают копию фаговой ДНК в составе хромосомы. Подобные

клетки называются лизогенными, а ДНК фага λ в них – профагом.

Состояние лизогении, поддерживаемое благодаря постоянному обра-

зованию белка-репрессора сІ, довольно неустойчиво: в любой момент

может произойти переключение на литический путь из-за проявления

антирепрессорных функций белка Cro. Показано, что в популяции

лизо-

генных бактерий в одной из 10

–10

клеток происходит спонтанная ин-

дукция профага и запускается литический цикл и такие клетки подвер-

гаются лизису. Эффективность данного процесса зависит как от состоя-

ния бактерии-хозяина, так и от действия разнообразных физических и

химических факторов. Индукторами перехода лизогения ↔ литический

цикл являются ультрафиолетовое излучение, митомицин С, алкилирую-

щие агенты, для

некоторых фагов также и изменение температуры.

Явление индукции профага очень важно учитывать при составлении

многокомпонентных заквасок для получения молочнокислых продуктов.

Если среди штаммов, входящих в такие закваски, окажутся лизогенные и

нелизогенные, но чувствительные к фагу, обусловившему лизогению

бактерий, то произойдет явление фаголизиса (т. е. гибели клеток), очень

опасное для молочной

промышленности. Следует отметить, что фаголи-

зис может быть обусловлен и вирулентными фагами, попадающими в

технологические потоки при плохой организации производства. Явление

фаголизиса также может наблюдаться и в процессе микробного синтеза

аминокислот, что значительно снижает рентабельность этих отраслей

биотехнологии.

Суммируя вышеизложенное, можно констатировать, что умеренные

бактериофаги могут находиться в трех состояниях: в

свободном состоя-

нии в виде частиц – вирионов; в состоянии профага; в вегетативном

(активном) состоянии, когда бактериофаг способен вызывать лизис

бактериальной клетки (табл. 5).

Кроме того, что наличие профага является потенциально летальным

для лизогенной бактерии фактором, делает ее иммунной к заражению

гомологичным фагом, он может сообщать клетке-хозяину и другие приз-

наки

. Преобретение новых признаков, обусловленных профагом, называ-

ется фаговой или лизогенной конверсией. Лизогенная конверсия может

затрагивать такие важнейшие свойства бактерий как морфология их

колоний, биохимические признаки, способность синтезировать токсины

или антибиотики, устойчивость к лекарственным препаратам и др. Это

явление хорошо изучено у некоторых болезнетворных бактерий.

Таблица 5

Отличительные свойства состояний умеренных бактериофагов

Свойства Вирион Профаг Вегетативный фаг

Наличие специфической

нуклеиновой кислоты

+ + +

Репликация нуклеиновой

кислоты

–

Вместе с бактериальной

хромосомой

Синтез фаговых белков – – +

Способность к заражению + – –

Способность вызывать лизис

клетки

– – +

Например, показано, что способность дифтерийной палочки (Corуne-

bacterium diphtheriae) синтезировать сильнейший дифтерийный токсин

детерминируется геном tox

, а активность этого гена в свою очередь за-

висит от присутствия в бактериальной клетке в состоянии профага спе-

цифического фага β. Известно, что бактерии Clostridium botulinum – воз-

будители ботулизма, синтезируют смертельный токсин только при лизо-

генизации их специфическими бактериофагами.

Глава 4. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

НА МИКРООРГАНИЗМЫ

Факторы внешней среды, влияющие на жизнеспособность микроор-

ганизмов, подразделяют на химические и физические. Они действуют на

микроорганизмы по-разному. С одной стороны, оказывают стимули-

рующее действие, например, при использовании определенных химиче-

ских веществ, необходимых микроорганизмам для поддержания их жиз-

недеятельности; поддержании оптимальной температуры, обеспечиваю-

щей наиболее высокую скорость роста клеток, и

т. п.

С другой стороны, действие химических и физических факторов мо-

жет вызывать торможение метаболизма либо приводить клетки микроор-

ганизмов к гибели. В зависимости от этого все физические и химические

факторы подразделяют на микробостатические и микробоцидные.

Факторы внешней среды, полностью или частично угнетающие рост и

задерживающие развитие микроорганизмов, относят к

микробостатиче-

ским. Микробоцидные факторы вызывают гибель микроорганизмов. В

зависимости от концентрации или дозы действующего агента, продол-

жительности контакта и вида микроорганизма один и тот же фактор мо-

жет оказывать как микробостатическое, так и микробоцидное действие.

4.1. Действие факторов химической природы

Как уже отмечалось, одно и то же химическое вещество может прояв-

лять избирательную активность в отношении микроорганизмов, действуя

только на конкретные структуры или процессы микробной клетки и не

действуя на клетки других организмов. Такие вещества удобно исполь-

зовать в терапии для лечения заболеваний микробной этиологии.

Некоторые химические вещества действуют опосредованно, т

. е. при-

водят к микробостатическому эффекту, не поражая саму клетку микро-

организмов. Например, при повышении концентрации сахарозы в среде

из клеток микроорганизмов выходит вода, что задерживает их рост, т. е.

приводит к микробостатическому эффекту. На этом основано приготов-

ление варенья, джемов и т. п. При разведении этих продуктов микроор-

ганизмы восстанавливают свои функции, и в благоприятных условиях

вновь могут расти и развиваться.

Химические соединения по механизму действия на клетки микроор-

ганизмов могут быть разделены:

• на повреждающие клеточную стенку или цитоплазматическую

мембрану;

• повреждающие ферменты, участвующие в обмене веществ, а так-

же нарушающие синтез основных биополимеров клетки.

К первой группе относятся химические вещества, повреждающие

структуру клеточной стенки (лизоцим и др.), нарушающие полупрони-

цаемость цитоплазматической мембраны (фенолы, хлороформ, крезолы,

нейтральные мыла, поверхностно-активные вещества или детергенты,

эфиры, ионы водорода, спирты, толуолы). Действие фенола, хлороформа,

крезола

, эфира, толуола, спирта связано в первую очередь с растворени-

ем липидов цитоплазматической мембраны, что приводит к нарушению

ее проницаемости и разрушению. Кроме того, этанол в достаточно высо-

кой концентрации (70 %) вызывает коагуляцию белков и оказывает мик-

робоцидное действие. Детергенты способны накапливаться в липопро-

теиновых мембранах (за счет того, что они, как

и мембраны, имеют по-

лярную структуру) и вызывать нарушение их функций. Поскольку эти

вещества обладают широким спектром антимикробного действия, их

обычно применяют для дезинфекции различных поверхностей, материа-

лов и объектов окружающей среды.

Концентрация ионов водорода в окружающей среде действует на

микроорганизмы двояко:

1) непосредственно на полупроницаемость цитоплазматической мем-

браны;

2) косвенно

или опосредованно: а) через влияние на ионное состояние

и доступность многих ионов и метаболитов; б) стабильность макромоле-

кул; в) равновесие зарядов на поверхности клетки.

При низких значениях рН понижается растворимость углекислого га-

за – источника углерода для автотрофных бактерий, а растворимость та-

ких катионов, как Cu

, Mo

, Mg

, Al

, возрастает и достигает токсич-

ных уровней. Кроме того, многие органические кислоты при низких зна-

чениях рН находятся в недиссоциированной форме и легко проникают в

клетку, становясь токсичными для нее. Наоборот, при высоких значени-

ях рН растворимость многих катионов, необходимых клетке (Fe

, Ca

), резко понижается, они выпадают в осадок и становятся недоступ-

ными для клеток микроорганизмов.

Концентрация ионов водорода во внешней среде влияет и на равнове-

сие электрических зарядов на поверхности клетки: при низких значениях

рН увеличивается суммарный положительный заряд, при высоких – сум-

марный отрицательный заряд. Кроме того, в кислой среде разрушаются

ДНК и АТФ, а в щелочной – РНК и фосфолипиды.

В зависимости от отношения к кислотности

среды бактерии могут

быть разделены на несколько групп:

1) нейтрофилы – оптимальное значение рН для роста составляет 6–8,

а рост возможен, как правило, в диапазоне от 4 до 9. К этой группе отно-

сится большинство известных микроорганизмов. Типичными нейтрофи-

лами являются штаммы бактерий Escherichia coli, Bacillus megaterium,

Streptococcus faecalis и др.;

2) ацидофилы – оптимальная кислотность среды для роста

ниже 4

единиц рН. Среди них различают факультативные (интервал рН 1–9,

оптимум 2–4) и облигатные ацидофилы (интервал рН 1–5, оптимум 2–

4). В природе экстремально кислые условия встречаются в некоторых

озерах, болотах, горячих источниках. Типичными представителями об-

лигатных ацидофилов служат бактерии родов Thiobacillus, Sulfolobus,

Acetobacter и др.;

3) алкалофилы – оптимальные условия для развития

находятся в

пределах значений рН 9,0–10,5, которые встречаются в щелочных поч-

вах, в местах скопления экскрементов животных. Среди алкалофилов

различают факультативных алкалофилы (интервал рН для роста 5–11,

оптимум рН 9,0–10,5), к которым относятся нитратвосстанавливающие и

сульфатвосстанавливающие бактерии, многие аммонификаторы. Обли-

гатные алкалофилы растут при высоких значениях рН – 8,5–11,0, при

оптимуме 9,0–10,5. К таким бактериям относятся Bacillus pasteurii

, неко-

торые цианобактерии и др.

Однако следует отметить, что хотя микроорганизмы и могут осуще-

ствлять процессы жизнедеятельности в условиях различной кислотности

или щелочности среды, реакция внутри их клеток поддерживается всегда

близкой к нейтральной. Это достигается благодаря наличию в цитоплаз-

ме буферных систем и низкой полупроницаемости мембраны для ионов

водорода.

Способность

к росту при низких или высоких значения рН обеспечи-

вает микроорганизму определенные преимущества, так как в этих усло-

виях мала конкуренция со стороны большинства других организмов.

К группе химических веществ, оказывающих микробоцидное дейст-

вие на микроорганизмы, повреждающих ферменты и вызывающих на-

рушение обмена веществ, относятся ионы тяжелых металлов, оксид уг-