Лысак В.В. Микробиология

Подождите немного. Документ загружается.

Во время конъюгации в донорных клетках осуществляется реплика-

ция ДНК по типу «катящегося кольца» или «разматывающегося рулона».

Для этого фермент эндонуклеаза в точке начала передачи F-фактора раз-

резает одну из нитей ДНК с образованием 5′- и 3′-ОН-концов. На 3′-ОН-

конце с помощью ДНК-полимеразы III происходит наращивание нуклео-

тидов

, комплементарных нуклеотидам неповрежденной нити ДНК. Вто-

рой конец (5′-конец) разрезанной нити начинает отходить в виде «хво-

ста» и переходит по конъюгационному мостику в реципиентную клетку,

где служит матрицей для синтеза второй нити (рис. 69).

Интеграция

F-фактора в

хромосому

Конъюгация и пере-

дача F-фактора

–

Hfr a

–

Hfr a

Конъюгация и передача

хромосомных генов

–

/а

–

Рекомбинация

Нет рекомбинации

–

Рис. 69.

Передача генетического материала при конъюгации

После репликации в реципиентной клетке двухцепочечная ДНК

вступает в гомологичную рекомбинацию с ДНК реципиентной клетки.

Образуются рекомбинанты, которые при данном способе обмена генети-

ческой информацией называются трансконъюгантами.

Таким образом, в процессе конъюгации можно различить следующие

стадии:

228

• образование неэффективных пар;

• образование эффективных конъюгационных пар;

• перенос генетического материала из донорных клеток в реци-

пиентные;

• постконъюгационный синтез донорной ДНК в реципиентной

клетке;

• гомологичная рекомбинация перенесенного фрагмента донорной

ДНК с ДНК реципиентной клетки.

Как способ генетического обмена конъюгация используется в сле-

дующих направлениях.

1. Передача многих генетических маркеров из одних клеток в другие.

Показано, что при конъюгации вся хромосома бактерий E. coli передает-

ся за 100 мин. В «мягких» условиях можно добиться переноса всей хро-

мосомы

и даже повторной ее передачи по механизму «катящегося коль-

ца», если в хромосоме нет профага.

2. Метод конъюгационного скрещивания удобен для картирования

хромосомы. Карта хромосомы у бактерий строится в минутах. У бакте-

рий E. coli началом карты (0 мин) являются точки локализации генов,

ответственных за синтез треонина и лейцина.

3. Изучение генетического аппарата у

бактерий.

4. Конъюгация эффективно происходит в природе и поэтому являет-

ся важной составляющей изменчивости бактерий.

7.5.3. Трансдукция

Трансдукция была открыта в 1952 г., после того как была уже описа-

на трансформация у пневмококков и конъюгация у бактерий E. coli.

Н. Циндер, будучи еще студентом, работал в лаборатории Дж. Ле-

дерберга и занимался исследованием наличия конъюгации у бактерий

Salmonella typhimurium. В его распоряжении было 20 моноауксотрофных

штаммов S. typhimurium. Смешивая их попарно в различных

комбинаци-

ях, Н. Циндер пытался выявить прототрофное потомство. В результате в

9 случаях из 79 исследованных комбинаций с частотой 10

–5

–10

–6

были

выявлены клоны прототрофных клеток. Поскольку ни один из исходных

штаммов на минимальной среде ревертантов не образовывал, то был

сделан вывод, что между штаммами S. typhimurium осуществляется

конъюгация, при которой происходит передача наследственной инфор-

мации. Для подтверждения этого Циндер и Ледерберг повторили опыт

Б. Дэвиса с U-образной пробиркой, разделенной стеклянным фильтром,

229

не пропускающим бактериальные клетки. В опыте использовались два

штамма бактерий: S. typhimurium 2Ahis

–

и S. typhimurium 22Atrp

–

В одну ветвь U-образной пробирки вносили культуру штамма 22А в

концентрации 1·10

кл/мл, в другую – такое же количество клеток штам-

ма 2А. После определенного периода инкубации в той части пробирки, в

которую были внесены клетки штамма 22А, Циндер и Ледерберг обна-

ружили прототрофные клетки, которые формировались с частотой 1·10

-5

В той ветви пробирки, в которую были внесены клетки штамма 2А, про-

тотрофы отсутствовали (рис. 70).

Штамм 22А

Штамм 2А

Роста нет

Минимальная

глюкозо-солевая среда

Стеклянный фильтр

Рис. 70.

Схематическое изображение классического опыта

Минимальная

глюкозо-солевая среда

Н. Циндера и Дж. Ледерберга

Полученные результаты не подтвердили предположение Н. Циндера

и Дж. Ледерберга о конъюгационном переносе наследственной инфор-

мации у штаммов 2А и 22А S. typhimurium. Последующая проверка этих

штаммов показала, что штамм 22А заражен фагом Р22. Этот фаг спосо-

бен инфицировать и лизировать клетки штамма 2А. После проникнове-

ния через стеклянный фильтр он инфицировал

клетки штамма 2А, ре-

продуцировался и лизировал их. При этом освобождался фильтрующий-

ся агент (ФА) (так его называли Циндер и Ледерберг), который в свою

очередь проникал через стеклянный фильтр. Под влиянием ФА некото-

рые клетки штамма 22А приобретают специфические наследственные

свойства, характерные для того штамма (штамма 2А), из которого выде-

лялся ФА, – способность синтезировать триптофан. Было установлено,

230

что активность агента, способного к фильтрации, не утрачивается при

обработке его ДНКазой, что исключало возможность трансформации.

Вместе с тем показано, что свойства ФА идентичны свойствам фага Р22.

Был сделан вывод, что фаг Р22 переносит наследственную информацию

от клеток штамма 2А в клетки штамма 22А.

Явление переноса генетической информации от клетки-донора

клетке-реципиенту с помощью фага было названо трансдукцией.

Трансдукция основана на том, что в процессе размножения фагов в

бактериях могут образовываться фаговые частицы, которые наряду с фа-

говой ДНК или вместо нее содержат фрагменты бактериальной ДНК. Та-

кие фаговые частицы называются трансдуцирующими. По морфологии

и адсорбционным свойствам они ничем

не отличаются от обычных фаго-

вых вирионов, но при заражении ими новых клеток передают генетиче-

ские детерминанты предыдущего хозяина. Таким образом, чтобы осуще-

ствить трансдукцию, необходимо размножить фаг на клетках штамма-

донора, а затем заразить полученным фаголизатом клетки-реципиента.

Отбор трансдуктантов проводят на селективных средах, где не могут

расти исходные реципиентные

клетки (рис. 71).

(trp

)

ДНК трансдуци-

рующего фага

ДНК реципиентной

бактерии

Среда без триптофана

trp

–

Адсорбция

фага

Размножение

фага

Фаг

Донор (trp

)

Роста

нет

Реципиент (trp

–

)

Среда без

триптофана

Рис. 71. Схема опыта по трансдукции

231

Изучение трансдукции показало, что одни фаги могут переносить

разные бактериальные гены, а другие – только определенные. В соответ-

ствии с этим принято выделять два типа трансдукции:

• генерализованную (неспецифическую, или общую);

• специфическую, или ограниченную.

При генерализованной трансдукции может трансдуцироваться любой

фрагмент бактериальной хромосомы примерно с одинаковой частотой.

При специфической трансдукции могут переноситься строго определен-

ные гены.

В осуществлении генерализованной трансдукции бактериальный ви-

рус является только переносчиком генетического материала бактерий.

При специфической трансдукции вирус включает ДНК бактерий в свой

геном и передает ее

, лизогенизируя бактерии-реципиенты.

Рассмотрим механизмы осуществления генерализованной и специфи-

ческой трансдукции.

Генерализованная трансдукция

Одним из умеренных бактериофагов, осуществляющих генерализо-

ванную трансдукцию, является уже упоминаемый фаг Р22 S. typhimu-

rium, с которым работали Н. Циндер и Дж. Ледерберг. К фагам, осущест-

вляющим генерализованную трансдукцию, относятся также фаги P1

E. coli, PBS1 B. subtilis и др.

Генерализованная трансдукция осуществляется дефектными части-

цами фагов. Образование таких частиц происходит в ходе репродукции

фагов, сопровождающейся распадом бактериальной хромосомной ДНК.

Следует отметить, что образование их может происходить как при лити-

ческом развитии фага (фаги Р22 S. typhimurium и P1 E. coli), так и после

индукции профага (фаг P1 E. coli). При этом в часть фаговых частиц на-

чинает упаковываться не фаговая, а бактериальная ДНК. Размеры фраг-

ментов бактериальной ДНК, включающейся

в такие частицы, не превы-

шают объема головки, а упаковываться могут самые разнообразные

фрагменты бактериальной хромосомы. Фаговые частицы, несущие фраг-

менты ДНК бактерий, называются дефектными или трансдуцирующими.

Если полученным фаголизатом, содержащим как нормальные, так и

дефектные частицы, обработать клетки штамма-реципиента, то зараже-

ние их нормальным фагом ведет, как правило,

к лизису клеток. Однако

некоторые клетки инфицируют дефектные трансдуцирующие фаги. В

клетки поступают короткие фрагменты двунитевой ДНК донора. Цирку-

ляризации бактериальной ДНК при этом не происходит, т. е. рекомби-

232

нируют с ДНК реципиента линейные фрагменты ДНК донора. Рекомби-

нация, происходящая при общей трансдукции, находится под контролем

recA-гена, т. е. это общая гомологичная рекомбинация, осуществляемая

путем реципрокного обмена соответствующими гомологичными участ-

ками. Возникают рекомбинанты, называемые трансдуктантами. Транс-

дуктанты нелизогенны и не обладают иммунитетом к фагам, так как

трансдуцирующие частицы, вызвавшие

их образование, не содержат фа-

говой ДНК (рис. 72).

Фаг инфицирует донорную

бактериальную клетку

ДНК

ага

Донорная ДНК франментируется,

фаговая ДНК реплицируется и

синтезируются фаговые белки

Фрагменты донорной бактериальной

ДНК упаковываются в фаговый

капсид

Трансдуцирующая частица инфицирует

реципиентную бактериальную клетку,

происходит гомологичная рекомбинация

между донорной и реципиентной ДНК

–

Рекомбинантная

бактериальная клетка

Рис. 72. Схема генерализованной трансдукции

При генерализованной трансдукции может переноситься любой бак-

териальный признак с частотой 10

–5

–10

–6

. Количество бактериальной

ДНК, которое может переноситься фагом обычно составляет 1

–2 % всей

233

ДНК, содержащейся в клетке. Исключение составляет бактериофаг РBS1

B. subtilis, который может трансдуцировать до 8 % генома хозяина.

Однако при генерализованной трансдукции могут возникать не толь-

ко истинные рекомбинанты-трансдуктанты, в которых привнесенный ген

наследуется стабильно из поколения в поколение (полная, или завершен-

ная, трансдукция), но и абортивные трансдуктанты. При абортивной,

или незавершенной,

трансдукции внесенный дефектным фагом фраг-

мент бактериальной хромосомной ДНК донора не рекомбинирует с хро-

мосомной ДНК реципиентной клетки. Находясь в реципиентной клетке,

привнесенный ген экспрессируется, что придает клетке новый фенотип,

например способность к синтезу какой-то аминокислоты. Однако ген эк-

зогеноты (привнесенный ген) не способен реплицироваться. Вследствие

этого при делении клетки

он передается только одной из дочерних осо-

бей, но во второй клетке сохраняется белок – продукт экспрессии прив-

несенного гена, и эта клетка в известной степени сохраняет приобретен-

ный фенотип. С ростом числа делений идет разведение данного продук-

та, поэтому абортивные трансдуктанты на селективной среде формируют

микроколонии по сравнению с колониями

истинных трансдуктантов. Та-

кие микроколонии абортивных трансдуктантов содержат только одну

клетку, несущую экзогеноту, или привнесенный фагом ген донорной

ДНК.

Впервые абортивную трансдукцию обнаружили при передаче генов,

ответственных за жгутикообразование, по образованию на питательной

среде «ползущих следов», или шлейфов. При исследовании под микро-

скопом таких клонов оказалось, что жгутик, а следовательно, и подвиж-

ность сохраняет одна клетка. Такие клетки делятся и оставляют по ходу

движения неподвижное потомство.

Установлено, что соотношение между

частотой осуществления за-

вершенной и абортивной трансдукции составляет примерно 1:10, т. е.

абортивная трансдукция происходит чаще, чем полная завершенная.

Специфическая трансдукция

Специфическая трансдукция была открыта в 1956 г. М. Морзе и суп-

ругами Е. и Дж. Ледерберг. Характерной особенностью специфической

трансдукции является то, что каждый трансдуцирующий фаг передает

только определенную, весьма ограниченную область бактериальной

хромосомы. Если в генерализованной трансдукции фаг выступает в каче-

стве «пассивного» переносчика генетического материала бактерий, а ге-

нетическая рекомбинация

у трансдуцируемых бактерий происходит по

234

общим закономерностям рекомбинационного процесса, то при специфи-

ческой трансдукции фаг не только переносит генетический материал, но

и обеспечивает его включение в бактериальную хромосому.

Наиболее известным примером специфической трансдукции является

трансдукция, осуществляемая фагом λ, который способен заражать клет-

ки бактерий E. coli с последующей интеграцией его ДНК в геном бакте-

рий.

Умеренный фаг

λ при лизогенизации бактерий в результате сайт-

специфической рекомбинации (разрыв и перекрестное воссоединение

цепей ДНК) встраивается в их хромосому только в одном месте: на уча-

стке между локусами bio и gal. Этот участок получил название attλ. Вы-

резание (эксцизия) профага из хромосомы при индукции профага осуще-

ствляется также по механизму

сайт-специфической рекомбинации.

Сайт-специфическая рекомбинация происходит точно, но не безоши-

бочно. Приблизительно один раз на миллион событий при эксцизии про-

фага рекомбинация осуществляется не в attλ-сайте, а захватывает участ-

ки gal либо bio. Полагают, что это обусловлено «неправильным» образо-

ванием петли при дезинтеграции профага. В результате этого прилегаю-

щая к профагу

область бактериального генома выщепляется из состава

хромосомы и переходит в состав генома свободного фага. Соответст-

вующая по расположению в петле область генома профага остается в

бактериальной хромосоме. Таким образом, между профагом и бактери-

альной хромосомой осуществляется генетический обмен. Встраи-

вающийся в геном фага бактериальный генетический материал может

заместить до 1/3 генетического

материала фага.

После упаковки фаговой ДНК, часть которой замещена бактериаль-

ной, в фаговую головку образуются дефектные фаговые частицы. Фаг

является дефектным вследствие того, что объем головки ограничен и при

включении в его геном фрагмента бактериальной ДНК часть фагового

генома остается в хромосоме бактерий. Если дефект несущественен, то

фаг сохраняет жизнеспособность, так

как его белковая оболочка остается

неповрежденной и обеспечивает адсорбцию на клетках. Такой дефект-

ный фаг может заражать другие клетки, но не может вызывать репродук-

тивную инфекцию, так как гены, ответственные за репродукцию, отсут-

ствуют. Если в таком дефектном фаге в ДНК сохранились липкие концы,

обеспечивающие превращение ее в циркулярную форму,

то ДНК де-

фектного фага вместе с фрагментом бактериальной ДНК может интегри-

роваться в ДНК реципиентных бактерий и вызывать их лизогенизацию

(рис. 73).

235

В фаговую ДНК

включены гены

донорной клетки

Профаг

Эксцизия

профага из

хромосомы,

сопровождаю-

щаяся захватом

генов донора

Индукция

профага

Репродукция

фага и

образование

дефектных

фаговых

частиц

Хромосома

донорной

клетки

Лизис

донорной

клетки

Рекомбинантная

бактериальная

клетка

Дефектная фаговая

частица инфицирует

реципиентную клетку

Трансдуцирующая

ДНК интегрируется

в хромосому

реципиентной клетки

Рис. 73. Схема специфической трансдукции

Было установлено, что при индукции профага λ чаще образуются

дефектные частицы, содержащие гены локуса gal. Такие дефектные час-

тицы обозначают λdgal (фаг λ, defective, gal). Если в геноме фага λ со-

держится ген, ответственный за синтез биотина, то – λdbio. Следователь-

но, если фаголизатом, полученным после заражения донорных бактерий

фагом

λ, в котором содержится дефектные частицы, обработать реципи-

ентные клетки bio

–

или gal

–

, то с частотой 10

–5

–10

–6

образуются транс-

дуктанты bio

или gal

236

Специфическая трансдукция у E. coli осуществляется не только фа-

гом λ, но и родственными ему фагами, получившими наименование

лямбдоидных фагов, к числу которых относятся φ80, 434, 82 и др. В ча-

стности, фаг φ80 включается в хромосому вблизи генов, кодирующих

образование ферментов, ответственных за синтез триптофана. По этой

причине фаг φ80 пригоден для переноса

генов trp.

Было установлено, что фаг P22 S. typhimurium, кроме общей транс-

дукции, может осуществлять и специфическую трансдукцию. При лити-

ческом цикле развития бактериофаг Р22 может осуществлять общую

трансдукцию, а при лизогенизации – специфическую. ДНК фага Р22 ин-

тегрируется в участок хромосомы рядом с генами, ответственными за

синтез пролина. Интеграция профага резко стимулирует

образование

специфических трансдуцирующих частиц.

Таким образом, для осуществления специфической трансдукции не-

обходима предварительная лизогенизация бактерий-доноров и после-

дующая индукция профага из клеток. Образовавшиеся при этом дефект-

ные трансдуцирующие частицы фагов заражают клетки реципиентного

штамма, происходит их лизогенизация и встраивание профага с участком

генома бактерий донора в хромосому реципиента.

Использовать трансдукцию

можно в следующих направлениях:

• трансдуцировать плазмиды и короткие фрагменты хромосомы до-

нора;

• для конструирования штаммов заданного генотипа, в частности

изогенных штаммов. Здесь малый размер передаваемых фрагментов

обеспечивает преимущество трансдукции перед конъюгацией. Изоген-

ные штаммы, сконструированные при помощи генерализованной транс-

дукции, различаются только по участку хромосомы, переносимому

трансдуцирующим фагом;

• для точного картирования бактериальных генов, установления по-

рядка и их расположения в оперонах и тонкой структуры отдельных ге-

нетических детерминант, что осуществляют с помощью комплемента-

ционного теста. Известно, что для синтеза определенной группы про-

дуктов необходимо функционирование нескольких генов. Допустим, что

синтез какого-то фермента определяется продуктами генов а и b

. Пусть

имеются два фенотипически одинаковых мутанта, не способных к синте-

зу фермента, но неизвестно, идентичны или различны они генетически.

Для идентификации генотипа проводят трансдукцию, т. е. размножают

фаг на клетках одной популяции, а затем фаголизатом заражают клетки

второй популяции. Если при высеве на селективную среду формируются

как большие колонии истинных

трансдуктантов, так и маленькие коло-

237