Лысак В.В. Микробиология

Подождите немного. Документ загружается.

микроорганизмов можно продуванием под давлением через толщу среды

стерильного воздуха.

Культивирование анаэробных микроорганизмов более сложно, чем

выращивание аэробов, так как здесь должен быть сведен до минимума

контакт микроорганизмов с молекулярным кислородом. Для этого ис-

пользуют различные приемы для создания анаэробных условий. Их под-

разделяют на физические, химические и биологические. Все они

основа-

ны на том, что микроорганизмы культивируют в каком-то замкнутом

пространстве.

К физическим методам создания анаэробных условий относится вы-

ращивание микроорганизмов в микроанаэростатах – вакуумных метал-

лических камерах, снабженных манометром. Анаэростатом может слу-

жить обычный стеклянный эксикатор с притертой крышкой. Из анаэро-

стата откачивают воздух, а затем заполняют его газовой

смесью, состоя-

щей на 80–90 % из азота и на 10–20 % углекислого газа, до давления по-

рядка 500 мм рт. ст.

К химическим методам создания анаэробных условий относится ис-

пользование химических веществ, поглощающих кислород. В качестве

поглотителей кислорода в лабораторной практике применяется щелоч-

ной раствор пирогаллола, дитионит натрия (Na

), металлическое же-

лезо, хлорид одновалентной меди и некоторые другие реагенты. Погло-

тители помещают на дно химического эксикатора, в который помещают

анаэробные микроорганизмы, засеянные в пробирки, колбы или чашки

Петри. Эксикатор закрывают притертой крышкой. При этом способе соз-

дания анаэробных условий необходимо учитывать поглощающую спо-

собность используемых веществ и объем замкнутого

пространства, в ко-

тором выращивается культура.

Биологический способ создания анаэробных условий заключается в

следующем. Питательную среду в чашке Петри разделяют желобком на

две половины, на одну половину засевают облигатные аэробные бакте-

рии, а на другую облигатные анаэробные бактерии. Чашку закрывают,

зазор между донышком и крышкой заливают парафином или воском и

помещают

в термостат с оптимальной для роста микроорганизмов тем-

пературой. Вначале наблюдается рост аэробных микроорганизмов (до

истощения свободного кислорода), после чего начинается размножение

клеток анаэробов.

Для культивирования анаэробных бактерий используют и другие ме-

тоды, ограничивающие доступ воздуха к растущей культуре:

• выращивание в высоком слое среды;

• выращивание в толще плотной среды;

118

• культивирование в вязких средах, в которых диффузия молекуляр-

ного кислорода в жидкость уменьшается с увеличением ее вязкости;

• заливка среды с посевом высоким слоем стерильного вазелинового

масла или парафина.

119

Глава 6. МЕТАБОЛИЗМ МИКРООРГАНИЗМОВ

Метаболизм – это совокупность биохимических процессов, проте-

кающих в клетке и обеспечивающих ее жизнедеятельность. Клеточный

метаболизм складывается из двух противоположно направленных про-

цессов: энергетического метаболизма (катаболизма) и конструктивного

метаболизма (анаболизма).

Энергетический метаболизм (катаболизм) – это совокупность ре-

акций окисления различных восстановленных органических и неоргани-

ческих соединений, сопровождающихся выделением энергии, аккумули-

руемой клеткой

в форме фосфатных связей.

Конструктивный метаболизм (анаболизм) – это совокупность ре-

акций биосинтеза, в результате которых за счет веществ, поступающих

извне, и промежуточных продуктов (амфиболитов), образующихся при

катаболизме, синтезируется вещество клеток. Этот процесс связан с по-

треблением свободной энергии, запасенной в молекулах АТФ или других

богатых энергией соединениях.

Конструктивный и энергетический

метаболизм состоит из ряда по-

следовательных ферментативных реакций, протекание которых условно

можно представить следующим образом. На начальном этапе воздейст-

вию подвергаются молекулы химических веществ, которые служат ис-

ходными субстратами для метаболизма обоих типов. Иногда эту часть

метаболического пути называют периферическим метаболизмом, а

ферменты, катализирующие первые этапы превращения субстрата, – пе-

риферическими.

Последующие превращения (промежуточный мета-

болизм) включают ряд ферментативных реакций и приводят к синтезу

промежуточных продуктов. Образующиеся на последних этапах конеч-

ные продукты конструктивных путей используются для построения ве-

щества клеток, а энергетических – выделяются в окружающую среду.

Конструктивные и энергетические процессы протекают в клетке од-

новременно. У большинства прокариот они тесно связаны

между собой.

В процессе анаболизма синтезируются многочисленные ферменты, уча-

ствующие в энергетическом метаболизме. С другой стороны, в реакциях

120

катаболизма образуется не только энергия для биосинтетических целей,

но и многие промежуточные продукты, которые необходимы для синтеза

веществ, входящих в состав клеточных структур.

Метаболизм прокариот, как энергетический, так и конструктивный,

отличается чрезвычайным разнообразием. Это является результатом то-

го, что бактерии в качестве источников энергии и углерода могут ис-

пользовать самый широкий

набор органических и неорганических со-

единений. Такая способность обусловлена различиями в наборе клеточ-

ных периферических ферментов, или экзоферментов, относящихся к

классу гидролаз, которые выделяются наружу и разрушают макромоле-

кулы исходных субстратов до веществ с низкой молекулярной массой.

Образующиеся в результате действия таких ферментов вещества посту-

пают в клетку бактерий и

подвергаются действию ферментов промежу-

точного метаболизма. Эти ферменты называются эндоферментами, так

как они локализуются внутри клетки. Эндоферменты, синтезируемые

микроорганизмами, относятся ко всем известным классам ферментов –

оксидоредуктазам, трансферазам, гидролазам, лиазам, изомеразам и др.

Многие из эндоферментов локализованы на мембранах или на рибосо-

мах, в таком состоянии они называются связанными ферментами. Другие

ферменты

находятся в свободном, растворенном состоянии в цитоплаз-

ме.

Набор ферментов в клетке может изменяться в зависимости от усло-

вий, в которых обитают бактерии, соответственно все ферменты подраз-

деляют на две группы: конститутивные и индуцибельные. Конститу-

тивные ферменты синтезируются постоянно, независимо от наличия

веществ-субстратов. В клетке они обнаруживаются в более

или менее

постоянных концентрациях. Примером конститутивного фермента явля-

ется ДНК-полимераза. Индуцибельные ферменты синтезируются в от-

вет на появление в среде субстрата-индуктора. К ним относится боль-

шинство гидролаз. Способность к индукции синтеза таких ферментов

обеспечивает быструю приспособляемость бактерий к конкретным усло-

виям.

Таким образом, назначение метаболизма состоит в следующем:

• генерация энергии в молекулах АТФ или других богатых энергией

соединениях;

• образование субъединиц, из которых синтезируются макромолеку-

лы основных биополимеров клетки (белков, нуклеиновых кислот, поли-

сахаридов, липидов);

• активация образованных субъединиц за счет переноса фосфатной

группы с АТФ, происходящая с затратой энергии. Тем не менее этот

121

процесс необходим, поскольку только активированные субъединицы

способны вступать в реакции полимеризации;

• синтез специфических макромолекул из активированных субъеди-

ниц, т. е. их полимеризация. Полимеризация активированных субъеди-

ниц может происходить двумя способами:

а) в реакциях матричного синтеза (так синтезируются белки и нук-

леиновые кислоты);

б) за счет простой конденсации одинаковых активированных субъ-

единиц (например, образование молекул крахмала из остатков глюкозы).

6.1. Общая характеристика энергетического метаболизма

Ранее было отмечено, что по отношению к энергетическим источни-

кам все микроорганизмы подразделяются на две группы: хемотрофные и

фототрофные. Хемотрофные микроорганизмы используют для синтеза

молекул АТФ энергию, освобождаемую в результате химических реак-

ций, фототрофные – световую энергию в процессе протекания фотосин-

теза.

Синтез молекул АТФ из АДФ и фосфатов может происходить двумя

способами:

• фосфорилированием в дыхательной или фотосинтетической элек-

тронтранспортной цепи. Этот процесс у прокариот связан с мембранами

или их производными, поэтому его называют мембранным фосфорили-

рованием. Синтез АТФ в данном случае происходит при участии фер-

мента АТФ-синтазы:

АДФ + Ф

АТФ;

• фосфорилированием на уровне субстрата. При этом фосфатная

группа переносится на АДФ от вещества (субстрата), более богатого

энергией, чем АТФ:

S ~ Ф + АДФ S + АТФ.

Такой способ синтеза АТФ получил название субстратного фосфо-

рилирования. В клетке реакции субстратного фосфорилирования не свя-

заны с мембранными структурами и катализируются растворимыми

ферментами промежуточного метаболизма.

У хемотрофных

бактерий генерация энергии в молекулах АТФ сво-

дится к двум типам биохимических реакций: окисления и восстановле-

ния. Окисляться микроорганизмами могут самые разнообразные органи-

ческие и неорганические вещества, являющиеся донорами электронов.

122

Поскольку электроны не могут самостоятельно существовать, они обяза-

тельно должны быть перенесены на молекулы, способные их восприни-

мать. Такие молекулы называются акцепторами электронов. Донором

электронов не может быть предельно окисленное вещество, а их акцеп-

тором – предельно восстановленное. При биологическом окислении ча-

ще всего происходит одновременный перенос двух электронов; при этом

от

субстрата отщепляются также два протона (Н

). Такое окисление суб-

страта, происходящее с отщеплением двух протонов и двух электронов,

называется дегидрированием. Поэтому нередко термины «донор водоро-

да» и «донор электронов» употребляются как синонимы.

Все окислительно-восстановительные реакции энергетического мета-

болизма у хемотрофных микроорганизмов можно разделить на три типа:

• аэробное дыхание, или аэробное окисление;

• анаэробное дыхание;

• брожение.

Основной процесс энергетического метаболизма многих прокариот –

аэробное дыхание, при котором донором водорода или электронов яв-

ляются органические (реже неорганические) вещества, а конечным ак-

цептором – молекулярный кислород. Основное количество энергии при

аэробном дыхании образуется в электронтранспортной цепи, т. е. в ре-

зультате мембранного фосфорилирования.

Анаэробное дыхание – цепь анаэробных окислительно-восстано-

вительных

реакций, которые сводятся к окислению органического или

неорганического субстрата с использованием в качестве конечного ак-

цептора электронов не молекулярного кислорода, а других неорганиче-

ских веществ (нитрата –

, нитрита – , сульфата – , сульфита

–

, CO

-2

и др.), а также органических веществ (фумарата и др.). Мо-

лекулы АТФ в процессе анаэробного дыхания образуются в основном в

электронтранспортной цепи, т. е. в результате реакций мембранного

фосфорилирования, но в меньшем количестве, чем при аэробном дыха-

нии.

Брожение – совокупность анаэробных окислительно-восстанови-

тельных реакций, при которых органические соединения служат

как до-

норами, так и акцепторами электронов. Как правило, доноры и акцепто-

ры электронов образуются из одного и того же субстрата, подвергающе-

гося брожению (например, из углевода). Сбраживанию могут подвер-

гаться различные субстраты, но лучше других используются углеводы.

АТФ при брожении синтезируется в результате реакций субстратного

фосфорилирования.

123

Наиболее выгодным типом окислительно-восстановительных реак-

ций у бактерий, в результате которых генерируется наибольший запас

энергии в виде молекул АТФ, является аэробное дыхание. Наименее вы-

годным типом энергодающих реакций является брожение, сопровож-

дающееся минимальным выходом АТФ.

Поскольку большинство микроорганизмов в качестве источника

энергии использует углеводы, и в первую очередь глюкозу, рассмотрим

основные пути ее расщепления или катаболизма.

У бактерий возможны три пути катаболизма глюкозы:

1) гликолиз, или фруктозодифосфатный путь, или путь Эмбдена –

Мейергофа – Парнаса (по имени исследователей, внесших большой

вклад в изучение этого процесса);

2) окислительный пентозофосфатный путь, или гексозомонофосфат-

ный путь, или путь Варбурга – Диккенса – Хореккера;

3) 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконатный

путь (КДФГ-путь), или

путь Энтнера – Дудорова.

Следует отметить, что все перечисленные пути катаболизма глюкозы

у микроорганизмов могут протекать при разных типах энергетического

метаболизма (аэробное дыхание, анаэробное дыхание, брожение).

Все пути катаболизма начинаются с того, что глюкоза, поступившая в

клетку, сначала фосфорилируется при участии фермента гексокиназы и

АТФ как донора

фосфата. Образуется глюкозо-6-фосфат, который пред-

ставляет метаболически активную форму глюкозы в клетке и служит ис-

ходным соединением для любого из трех путей катаболизма углеводов.

Пути расщепления глюкозы состоят из многих биохимических реак-

ций, каждая из которых катализируется специфическим ферментом.

Наиболее распространенным путем катаболизма глюкозы у многих

микроорганизмов является гликолиз (рис

. 31). При этом глюкозо-6-фос-

фат изомеризуется с помощью глюкозофосфатизомеразы и фосфорили-

руется далее в фруктозо-1,6-дифосфат, который затем расщепляется на

3-фосфоглицериновый альдегид (3-ФГА) и фосфодиоксиацетон. Послед-

ний под действием фермента триозофосфатизомеразы превращается в

3-ФГА. Таким образом, из одной молекулы глюкозы образуются две мо-

лекулы 3-ФГА. На эти реакции превращения

глюкозы в 3-ФГА затрачи-

вается энергия двух молекул АТФ. Далее происходит окисление каждой

молекулы 3-ФГА до 1,3-дифосфоглицериновой кислоты (1,3-ФГК).

1,3-ФГК – высокоэнергетическое соединение, содержащее макроэр-

гическую фосфатную связь, реагирует с АДФ (фермент фосфоглицерат-

киназа), отдавая высокоэнергетическую фосфатную группу, в результате

чего синтезируется молекула АТФ.

124

ГЛЮКОЗА

АТФ

Гексокиназа

АДФ

Глюкозо-6-фосфат

Глюкозофосфатизомераза

Фруктозо-6-фосфат

АТФ

6-Фосфофруктокиназа

АДФ

Фруктозо-1,6-дифосфат

Фруктозодифосфатальдолаза

3-Фосфоглицериновый Диоксиацетонфосфат

альдегид (3-ФГА) Триозофосфатизомераза

НАД

Глицеральдегидфос-

фатдегидрогеназа

НАД ·

1,3-Дифосфоглицериновая

кислота

АДФ

Фосфоглицераткиназа

АТФ

3-Фосфоглицериновая

кислота

Фосфоглицеромутаза

2-Фосфоглицериновая

кислота

Енолаза

Фосфоенолпируват

Пируваткиназа АДФ

АТФ

Пируват

Таким образом, энергия, освободившаяся при окислении 3-ФГА, пу-

тем субстратного фосфорилирования оказывается аккумулированной в

молекуле АТФ. Образуется 3-фосфоглицериновая кислота (3-ФГК).

Рис. 31. Гликолитический путь расщепления глюкозы

125

CO ~ Ф

Н С– ОН

СН

О – Ф

_______________________

1,3-ФГК

+ АДФ

Фосфоглицераткиназа

C – OН

Н С– ОН

СН

О – Ф

______________________

3-ФГК

+ АТФ

Далее 3-ФГК под действием фермента фосфоглицеромутазы превра-

щается в 2-ФГК, из которой в результате отщепления воды образуется

фосфоенолпировиноградная кислота (ФЕП). Это также высокоэнергети-

ческий фосфат, с которого богатая энергией фосфатная группа перено-

сится пируваткиназой на АДФ, образуется молекула АТФ и пировино-

градная кислота (ПВК). Это второе фосфорилирование на уровне суб-

страта

СОOН

CO ~ Ф

СН

________________

ФЕП

+ АДФ

Пируваткиназа

СОOН

C O

СН

________________

ПВК

+ АТФ

Таким образом, при распаде одной молекулы глюкозы образуется че-

тыре молекулы АТФ, в которых аккумулируется освободившаяся энер-

гия. Поскольку в начале процесса на активирование глюкозы были за-

трачены две молекулы АТФ, чистый выход АТФ на одну молекулу глю-

козы составляет две молекулы. Суммарное уравнение гликолиза можно

записать следующим образом:

+ 2АДФ + 2Ф

+ 2НАД 2С

+ 2АТФ + 2НАД ·

Пентозофосфатный путь расщепления углеводов характерен для

некоторых представителей семейства Enterobacteriaceae, а также для ге-

тероферментативных молочнокислых бактерий и некоторых масляно-

кислых бактерий. В этом цикле глюкозо-6-фосфат, образующийся путем

активирования глюкозы молекулой АТФ, превращается через ряд про-

межуточных реакций в 6-фосфоглюконовую кислоту, которая подверга-

ется окислению и декарбоксилированию с образованием рибулозо

-5-

фосфата, СО

и НАДФ ·

. Рибулозо-5-фосфат включается в сложный

цикл, приводящий к образованию из трех его молекул двух молекул глю-

козо-6-фосфата и одной молекулы 3-фосфоглицеринового альдегида.

Глюкозо-6-фосфат может снова включаться в цикл, а 3-ФГА может быть

превращен в пировиноградную кислоту.

126

С энергетической точки зрения этот путь катаболизма углеводов в 2

раза менее эффективен, чем гликолитический, так как при окислении од-

ной молекулы глюкозы образуется только одна молекула АТФ. Однако

большое значение этого пути в том, что он обеспечивает клетки бактерий

пентозами (рибулозо-5-фосфатом), которые являются предшественника-

ми нуклеотидов и нуклеиновых кислот. Кроме

того, в этом цикле обра-

зуются две молекулы НАДФ ·

, которые необходимы клетке для вос-

становительных реакций биосинтеза.

Путь Энтнера – Дудорова встречается у прокариот реже других. Он

характерен в основном для псевдомонад и уксуснокислых бактерий. От

пентозофосфатного пути он отличается тем, что 6-фосфоглюконовая ки-

слота превращается в пировиноградную кислоту и 3-ФГА. Последний

может превращаться в пировиноградную кислоту. Из одной молекулы

глюкозы при функционировании этого пути синтезируется одна молеку-

ла АТФ, по одной молекуле НАДФ ·

и НАД ·

. Следует подчеркнуть,

что путь Энтнера – Дудорова является самым кратчайшим механизмом

расщепления углеводов до пировиноградной кислоты.

Сравнительная характеристика различных путей катаболизма глюко-

зы представлена на рис. 32.

ГЛЮКОЗА

АТФ

АДФ

АДФ АТФ Глюкозо-6-фосфат

Фруктозо-1,6-дифосфат 6-Фосфоглюконовая 6-Фосфоглюконовая

кислота кислота

3-ФГА 3-ФГА + ПВК Рибулозо-5-фосфат + СО

2АТФ 2НАД · Н

3-ФГА + 2 глюкозо-6-фосфат

2 ПВК АТФ НАД ·

АТФ 2НАДФ ·

НАДФ ·

ПВК ПВК

А Б В

Рис. 32. Схема путей катаболизма глюкозы в клетках прокариот:

А – гликолиз; Б – путь Энтнера – Дудорова; В – пентозофосфатный путь

Таким образом, рассмотрев пути катаболизма глюкозы, мы можем

заключить, что важнейшим продуктом, образующимся в них, является

пировиноградная кислота, которая подвергается дальнейшим превраще-

127