Курсовой проект - Екстремальні гіпертермофільні археї
Подождите немного. Документ загружается.
2
ЗМІСТ
Ст.
ВСТУП 3
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ 6
1.Історія вивчення та відкриття гіпертермофільних архей 6
2. Систематичне положення гіпертермофільних архей 11
2.1. Таксономія 11
2.2. Філогенія 13
3. Середовища існування гіпертермофільних архей 19
3.1. Наземні біотопи 20
3.2. Морські біотопи 21
4. Морфологічні, фізіологічні і культуральні особливості 28
гіпертермофільних архей
4.1. Морфологічні особливості 28
4.2. Фізіологічні властивості 32
4.3. Культуральні властивості 35
5. Енергетичний метаболізм гіпертермофільних архей 36
6. Механізми термофілії гіпертермофільних архей 39
6.1. Термостабільність ліпідів і мембран 40
6.2. Термостабільність білків і ферментів 42
6.3. Термостабільність ДНК та інших нуклеїнових кислот 44
6.4. Межі термоадаптації 45
7. Коротка характеристика окремих представників 46
гіпертермофільних архей
8. Практичне значення і використання в біотехнології 51
8.1. Використання в молекулярній біології 51
8.2. Використання в промислових процесах гідролізу крохмалю 52
8.3. Використання в інших промислових процесах 53
ВИСНОВКИ 55
ЛІТЕРАТУРА 57
3
ВСТУП
Гіпертермофільними називають мікроорганізми з оптимумом росту за
температур вище 80°С [1,2,3]. На відміну від звичайних термофілів вони, як
правило, не ростуть при температурах нижче 60°С [4,5]. За останні 30 років
інтерес до гіпертермофільних мікроорганізмів у науковому співтоваристві
постійно росте. Сучасні гідротермальні системи можна розглядати як аналог
древніх біоценозів Землі. Таким чином, вивчення гіпертермофільних
прокаріот є важливим як для розуміння еволюції мікроорганізмів та їх
метаболічних шляхів, так і для розуміння еволюції біосфери в цілому. Усе
більш поширеною стає гіпотеза про те, що життя вперше зародилося саме
в таких умовах: у тріщинах і порожнинах нагрітих гірських порід, глибоко
в надрах Землі. Тому вивчення подібних мікробних співтовариств, можливо,
згодом наблизить нас до розгадки таємниці походження життя [6]
.
У
термальних екосистемах гіпертермофільні мікроорганізми можуть
виконувати функції первинних продуцентів й/або деструкторів органічної
речовини [7]. Гіпотеза про існування гарячої підземної біосфери, із сумарною
кількістю біомаси, що перевершує наземну (передбачається, що
в порожнинах і тріщинах осадових і вулканічних порід під дном океанів
можуть знаходитися до 2/3 всіх мікроорганізмів, що живуть на планеті),
знаходить своє підтвердження, надаючи активну роль гіпертермофільним
мікроорганізмам у минулих і сучасних біогеохімічних процесах [6]. Крім
того, виняткова стійкість їх біополімерів до високих температур робить їх
перспективними об'єктами, як для фундаментальних досліджень, так й у
зв'язку з можливістю застосування в різних областях біотехнології [3].
Переважна більшість гіпертермофільних організмів становлять археї [1,2,6].
Предметом розгляду даної роботи є саме гіпертермофільні археї.
З'ясування адаптаційних механізмів, які забезпечують активне
існування при високих температурах, що перешкоджають росту переважної
4
більшості прокаріот, становить безсумнівний інтерес.
Адже цей фактор
впливає на всі живі істоти: навколишня температура постійно змінюється, її
перепади в певних районах бувають досить значними, і організми повинні
пристосовуватися . Проведені в цьому напрямку дослідження переконливо
довели, що термофілія включає безліч молекулярних механізмів і не може
бути пояснена тільки якою-небудь однією властивістю організму. Деякі з них
залишаються нез'ясованими і чекають свого пояснення, але вже на
сьогоднішній день досягнуто значних успіхів. Тому ціль даної роботи --
охарактеризувати та зіставити різноманітні механізми та найбільш загальні
молекулярні аспекти, запропоновані останніми роками для пояснення
способів існування гіпертермофільних архей в екстремальних умовах
навколишнього середовища і можливості їх використання в потребах
людини. Для досягнення цілі роботи поставлені такі задачі :
1) Ознайомитися з результатами проведених досліджень за останні
роки, що розширюють наші знання про унікальні особливості
гіпертермофільних архей і в майбутньому , переконаний, знадобляться в
професійній діяльності.
2) Розкрити та виділити особливі адаптаційні риси в фізіологічних та
морфологічних властивостях гіпертермофільних архей.
3) Приділити особливу увагу промисловому та лабораторному
використанню гіпертермофільних архей та їх перспективам як
біотехнологічних об'єктів.
4) Наголосити на основних перевагах, актуальності та комерційній
цінності використання термостабільних ферментів гіпертермофільних архей
в порівнянні з такими в термофільних бактерій та архей.
Обмеженість розгляду даної теми у вітчизняних наукових виданнях
зумовила і стимулювала до використання значної кількості матеріалів з
іноземних джерел, що надало даній роботі передового і пізнавального
характеру.
5
Як правило, біотехнологічний потенціал гіпертермофільних архей у
значній мірі пов'язаний з наявністю в них термостабільних ферментів, серед
яких найбільш широким використанням й комерційною успішністю
користуються термостабільні ДНК-полімерази, основною перевагою яких
перед бактеріальними полімеразами є більш висока термостабільність і
точність копіювання [7]. Крім цього, практичного використання набувають й
інші термостабільні ферменти архей, зокрема, в молекулярній біології,
хімічному синтезі, целюлозно-паперовій і харчовій промисловості. Широкі
перспективи застосування і очевидні переваги створюють умови для
подальшого їх впровадження у технологічні процеси.
Особливу подяку автор висловлює науковому керівникові доц.,к.б.н.
Орябінській Л.Б. за запропоновану тему, обговорення результатів, цінні
поради і зауваження та загальне наукове керівництво.
6
ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ
1. ІСТОРІЯ ВИВЧЕННЯ ТА ВІДКРИТТЯ ГІПЕРТЕРМОФІЛЬНИХ
АРХЕЙ
Неймовірно, але факт: головною відмінною фізіологічною рисою
гіпертермофільних мікроорганізмів є здатність до росту при високих
температурах (вище 80°С), тобто в умовах, цілком неприйнятних для
більшості живих істот [8;9]. Коли американський мікробіолог Томас Брок
(T.D.Brock) в 1968 р. вперше доповів на конференції результати своїх
досліджень з цього питання, багато його колег вважали, що він божевільний,
а його співробітникам радили пошукати роботу в іншому місці. І для цього
були всі підстави [10]. Адже з Луї Пастера було загальновизнаним, що
вегетативні клітини бактерій успішно гинуть при температурах від 80 до
100°С (Це спостереження ґрунтувалось на технології пастеризації). Крім
цього, вважалось, що високі концентрації солей в морській воді і
прісноводних гарячих джерелах, створюючи додатковий стрес на живі
організми, унеможливлювали їх існування за таких умов. Тому усілякі
заперечення вищенаведеного навіть не сприймалися до уваги [11].
Але Брока це не зупинило. Він помістив в гарячі джерела
Йеллоустонського національного парку (з температурою води, близькою до
точки кипіння) скляні диски з надією, що на них утворяться колонії існуючих
у цій воді мікроорганізмів. У ті роки найвищою температурою, при якій
могло існувати життя, вважали 75°С (Thermus aquaticus [10]). Однак вже
через кілька днів пластинки Брока вкрилися тонким шаром мікроорганізмів, і
біолог впевнився, що навіть там, де температура ніколи не падала нижче
100°С, існує життя [12]. Ці невідомі раніше живі істоти стали важливим
об'єктом досліджень біологів. Перш за все вчені зацікавилися особливостями
7
обміну речовин цих мікроорганізмів і спробували знайти їм місце в загальній
еволюційній картині живого світу.
Спочатку знайдені бактерії, віднесені до роду Sulfolobus,
американський дослідник Кастенхольц (Castenholz) розглядав як рідкісних і
незвичайних представників серед Pseudomonad [13]. Але згодом німецький
мікробіолог Карл Воуз (Сarl Woese) в 1977 році опублікував свою
революційну концепцію трьох доменів живого світу на підставі
порівняльного аналізу нуклеотидних послідовностей гена 16S рибосомальної
РНК, запропонувавши три самостійні лінії розвитку відносити до
домініоніонів (від англ. domain) і називати археями (Archae), бактеріями або
еубактеріями (Bacteria) і еукаріями (Eukarya), замість еукаріот для
співзвучності з іншими назвами [7]. Його колеги, Карл Стеттер ( Karl O.
Stetter ) і Вольфрам Зілліг (Wolfram Zillig), ґрунтуючись на дослідженні ДНК-
залежних ДНК-полімераз різних мікрорганізмів, підтвердили висновки Воуза
[11].Також виявилось, що насправді рід Sulfolobus належить до домену
Archaea і має досить древнє походження, знаходячись біля кореня
запропонованого філогенетичного дерева. Подальший аналіз показав, що
еукаріоти та архебактерії мають спільного універсального предка
небактеріального походження і першими організмами, що відокремились від
Archae/Eukarya лінії були саме гіпертермофіли. Отже, гіпертермофільні
організми виявились найбільш близькоспорідненими до предка сучасного
живого світу, розвиваючись у високотемпературних умовах молодої Землі
[14]. Можливо, вони були першими формами життя на планеті [8].
Більшість з близько 20 досліджених до нашого часу родів
гіпертермофілів, окрім 2 (Thermotoga та Aquifex), класифікують як археї
[11][14]. Ранні дослідження таких мікроорганізмів наводили на думку, що їх
геном може характеризуватися високим вмістом Г-Ц пар, але сучасні методи
доводять, що немає жодної очевидної кореляції між Г-Ц вмістом генома і
природним температурним оптимумом росту для даних бактерій [15].
8
Натомість комплексні дослідження повних геномних сіквенсів цієї
групи бактерій призвели до дивовижних результатів. Виявилось, що лише
один білок – зворотня гіраза присутній у всіх без виключення
гіпертермофілів ( у деяких кренархеот їх навіть дві ) і відсутній у
мезофільних і термофільних мікроорганізмів [16]. Цей фермент запобігає
розкручуванню подвійної спіралі молекули ДНК при високих температурах і
підтримує її у функціональному стані. Виявлення його тільки у
гіпертермофільних мікроорганізмів підтверджує правильність виділення їх в
окрему групу. Збереження функціонально-активної ДНК було абсолютно
необхідним для перших мікроорганізмів, що подолали 80°-градусний
температурний бар'єр. В нещодавній роботі (2004 року) групи японських
мікробіологів на чолі з Харуюкі Атомі (Haruyuki Atomi) було, навпаки,
експериментально показано, що видалення гена зворотньої гірази з генома
Thermococcus kodakaraensis KOD1 не призводило до летального результату
при 90°С. Однак ДНК штаму, позбавленого цього гену, не була позитивно
суперспіриалізованою, і ріст бактерії був сповільненим у порівнянні з
"нормальним" штамом, що особливо яскраво виражалось при більш високих
температурах [17].
Відкриття і виділення термостабільної ДНК-полімерази (Tfu-ДНК-
полімерази) в 1991 році з гіпертермофільних архей Pyrococcus furiosus,
оптимум роботи якої знаходиться в області 72°С, поряд з її використанням в
методі ПЛР, призвело до забезпечення як високої процесивності
(протяжності ділянки, що синтезується за одне зв'язування ферменту, і в
результаті швидкості синтезу), так і високої точності копіювання ДНК [18].
Крім того, що ця полімераза витримує високу (94—96°C) температуру,
необхідну для денатурації ДНК, у неї присутній механізм корекції помилок у
3'→5' напрямку (3'→5' екзонуклеазна активність).Такі полімерази дозволили
значно скоротити число мутацій, які зустрічаються в копійованій
послідовності ДНК, якісно вдосконаливши метод ПЛР, що в наш час широко
використовується в біологічній і медичній практиці, наприклад для
9
клонування генів, введення мутацій, виділення нових генів, секвенування,
для створення генетично модифікованих організмів, діагностики
захворювань (спадкових, інфекційних), ідентифікації малих кількостей ДНК,
встановлення батьківства [19].
Дослідження гіпертермофільних мікроорганізмів визначають і
розширюють наші уявлення про верхні температурні межі життя. У 1969 році
оптимальну температуру росту бактерії Thermus aquaticus - 75°С вважали
екстремально високою [10]. Зафіксовані до недавнього часу найвищі
температури росту становили 113°С (Pyrolobus fumarii)та 121°С ("Geogemma
barosii strain 121", 2003) [20]. 2008 року група японських дослідників на чолі з
Кеном Такаі (Ken Takai), культивуючи архебактерії Methanopyrus kandleri
strain 116 в автоклаві (!) з використанням унікальних технологій, довели
можливість росту і розмноження даної бактерії за температури 122°С та
тиску 20 МПа без порушень метаболізму та на протязі тривалого часу [21].
Вельми можливим представляється існування гіпертермофільних архей і за
значно вищих температур. Зокрема, вищезгаданий мікроорганізм Geogemma
barosii Strain 121 витримував нагрівання до 130°С протягом двох годин, але
не міг розмножуватися до тих пір, поки не був „охолоджений” до
температури 103°C [21]. Тим не менш, вважається малоймовірним, що
гіпертермофільні організми могли б вижити при температурах вище 150°C,
адже в цій точці ДНК та інші біологічні молекули зазнають необоротної
руйнації [20].
Починаючи зі знаменитої експедиції парусно-парового корвета
„Челленджер” в 1872-1876 роках, в ході якої були зібрані унікальні матеріали
про мешканців океанічного дна, велика увага (особливо останніми роками)
приділяється дослідженню екстремальних природних біотопів; не в останню
чергу завдяки наявності високотехнологічного сучасного обладнання та
фінансуванню даних проектів такими потужними організаціями як US
National Science Foundation ( програма „Life in Extreme Environments” ) та
Joint Oceanographic Institutions for Deep Earth Sampling (Об'єднаний
10
океанографічний інститут дослідження глибин Землі з міжнародною
програмою глибокого буріння океанічного дна) [1;20]. Дослідження
стимулюються припущенням, що нагріта глибинна біосфера в деяких деталях
імітує умови древньої Землі, в яких зародилось життя на нашій планеті [22].
До сих пір максимальна глибина, на якій у товщі морських донних
відкладень були виявлені живі мікроорганізми, становила 842 м [23]. В 2008
році результати глибоководного буріння біля берегів Ньюфаундленда
показали, що багате мікробне життя присутнє аж до глибини 1626 м під
рівнем морського дна, де при температурі близько 100°C мешкають
різноманітні гіпертермофільні архебактеріі. В цьому 2009 році японські
дослідники на дослідницькому буровому судні „Тікю” планують досягнути
рекордної глибини в 7000 метрів і взяти зразки порід з верхнього шару земної
мантії. Видається можливим, що в них будуть знайдені нові представники
екстремальних мікроорганізмів [6].
Останніми роками приділяється значна увага дослідженню
морфологічних та фізіологічних особливостей гіпертермофільних архей.
Зокрема, американськими дослідниками на чолі з Деннісом Гроганом (Dennis
Grogan) виявлено механізми світлозалежної фотореактивації ( репарації )
ДНК (Sulfolobus acidocaldarius [24],1996); під керівництвом професора
Рольфа Бернандера (Rolf Bernander) група шведських мікробіологів відкрила
невідомий до нашого часу механізм клітинного поділу у архебактерії
Sulfolobus acidocaldarius [5]; для членів порядку Sulfolobales описаний новий
шлях фіксації CO
2
– цикл 3-гідроксипропіоната (Metallosphaera sedula
[25],1999); вперше серед архебактерій відкрите явище паразитизму (для
Nanoarchaeum equitans [26],2003) -- це призвело до виокремлення четвертого
типу в домені Аrchea — Nanoarchaeota; нарешті, виявлено провідну роль
гіпертермофільних архей в процесах біомінералізації (наприклад,
геологічний процес утворення реальгару (AsS) із арсенату, що раніше
вважався чисто хімічним, може здійснювати кренархеота Pyrobaculum
arsenaticum [27],2000).
11
Дійсно, щоб охопити всю ширину сучасних досліджень та повністю
охарактеризувати їх історичний хід, слід значно розширити формат даної
роботи. В межах викладеного можна підсумувати, що на сьогоднішній день
головними досягненнями слід вважати успішне практичне використання
гіпертермофільних архей в біотехнології, молекулярній біології та
промисловості; виявлення їхнього унікального положення в системі живого
світу завдяки тривалим дослідженням в області генетики, морфології,
фізіології та метаболізму даної групи мікроорганізмів; розширення знань про
межі виживання живих істот і можливості зародження життя в
екстремальних умовах первісної Землі.
2.СИСТЕМАТИЧНЕ ПОЛОЖЕННЯ ГІПЕРТЕРМОФІЛЬНИХ АРХЕЙ
2.1. Таксономія
На сьогоднішній день описано понад 70 видів гіпертермофільних архей
та бактерій, що були виділені з різноманітних наземних і морських біотопів в
усьому світі [27]. Представників цієї досить строкатої (особливо, стосовно
філогенії та фізіологічних властивостей ) групи мікроорганізмів об’єднують в
29 родів та 10 порядків[28] (рисунок 1).
На сьогодні класифікація прокаріот, заснована на аналізі нуклеотидної
послідовності гена 16S-рРНК, вважається обов’язковою для розрізнення та
характеристики нових таксономічних груп. Слід зазначити, що більш
традиційні критерії (вміст GC пар ДНК, ДНК-ДНК гомологія, морфологія та
фізіологічні особливості) можуть бути використані лише як окремі ознаки
при визначенні вищих таксонів представників однієї філогенетичної лінії
(наприклад, при описі різних видів чи штамів)[23].