Курсовой проект - Екстремальні гіпертермофільні археї

Подождите немного. Документ загружается.

6.2. Термостабільність білків і ферментів

Багато дослідників вважають, що визначальна роль в термофілії

належить білкам, в першу чергу ферментним. Виділяють декілька основних

факторів їх термостабільності :

1.Особливості амінокислотного складу.

При температурах вище 100°C, стабільність амінокислот знижується в

ряду:

(Val,Leu)>Ile>Tyr>Lys>His>Met>Thr>Ser> Trp>(Asp, Glu, Arg, Cys)[51]

Виходячи з відносно повільного росту гіпертермофільних архей, період

напіврозпаду найбільш нестабільних амінокислот значно коротший ніж

період регенерації цих організмів. Тому деякі амінокислоти проходять

прискорену ковалентну модифікацію, що включає дезамінування, ß-

окислення, гідроліз, утворення дисульфідних містків та інші реакції, за

максимальної температури, тиску і крайніх значень pH, які гіпертермофіли

можуть витримувати[52]. Деякі амінокислоти більш стійкіші, знаходячись в

гідрофобному ядрі протеїнів, ніж у водних розчинах. Незважаючи на це, Asp,

Glu, Arg, Cys зустрічаються в термостабільних варіантах деяких загальних

білків значно рідше[18]. Крім цього, додатковий захист архебактеріальних

білків від денатурації в екстремальних умовах забезпечується збільшенням

вмісту неполярних амінокислотних залишків (наприклад, для протеїнів

Pyrococcus furiosus співвідношення неполярних і полярних амінокислотних

залишків складає 3 : 1)[7]

2.Гідрофобні взаємодії.

Щільно, ефективно упаковане гідрофобне ядро є загальною

особливістю термостійких глобулярних протеїнів гіпертермофілів[18]. Слід

зазначити, що в даний час вплив температури на гідрофобні взаємодії

активно вивчається, але однозначної відповіді все ще не знайдено. Є

свідчення, що збирання субодиниць термостійкого ферменту

глутаматдегідрогенази проходить лише за високих температур завдяки

гідрофобним взаємодіям. Причому за відносно помірних умов частково

зібрані ферменти знаходяться в „замороженому” стані, а включаються лише

за оптимальної температури[53]. Ця система демонструє пристосованість

гіпертермофілів до високотемпературних умов проживання.

3.Іонні взаємодії.

Кислотні чи основні бокові групи амінокислотних ланцюгів на поверхні

субодиниць або доменів ферментів сприяють їх кооперативному

зв’язуванню[18]. Іонні взаємодії за природою діють на значно більш довших

радіусах ніж гідрофобні, і є відносно стійкішими до змін структури води за

високих температур. Тому найбільш широко поширені мережі іонних

взаємодій спостерігаються в протеїнах екстремальних гіпертермофілів

( наприклад, глутаматдегідрогенази Pyrococcus furiosus ) порівняно з

відповідними в термофілах або мезофілах[53].

4. Кооперативна Асоціація.

Міжмолекулярні асоціації можуть попередити процес дисоціації

мономерів олігомерних білків. Тому багато ферментів, які в мезофілах

знаходять мономерними, в гіпертермофільних представників формують

олігомери. (Наприклад, хорізматмутаза

Methanococcus

jannaschii в процесі

термоадаптації набула тетрамерної організації)[54].

5.Фіксація білкових N-,C-кінців.

Доведено, що термінальні N-,C-кінці багатьох гіперстабільних білків

зафіксовані для запобігання розплітанню і денатурації протеїнів ( Наприклад,

кінцева карбоксильна група димерної гіпертермофільної цитратсинтази,

знаходячись в місці з’єднання мономерів, захищена від негативних взаємодій

і від самочинного вивільнення )[18].

6.Великий вклад в термостабільність вносять також координаційні,

водневі, дисульфідні та ароматичні зв’язки, а також додаткова стабілізація

ά-спіралей глобулярних білків[10].

Для гіпертермофілів характерна наявність великої кількості шаперонів.

Термостабільні білки теплового шоку (шаперони сімейств Hsp60 і Hsp70) при

зв'язуванні з іншими протеїнами роблять їх стійкішими до нагрівання. Так, в

гіпертермофільних архебактерій роду Pyrodictium 80 % цитоплазматичних

білків - шапероніни, що складаються з декількох субодиниць - шаперонів

сімейства Hsp60. Шапероніни архей близькі по будові еукаріотичним,

складаються з 3 різних мономерів, утворюючи 8- і 9-членні кільця. Шаперони

сімейства Hsp90 в архей поки не знайдені[55].

Слід додати, що основні температурні точки гіпертермофілів залежать

від конформації одного або декількох ключових ферментів: при мінімальних

температурах білкові молекули переходять до жорсткої неактивної

конформації; оптимальна температура визначає найбільш сприятливий

конформаційний стан ферментних білків; при максимальній температурі

починаються порушення структури білків і зниження їх ферментативної

активності, а за вищих температур ріст організмів припиняється унаслідок

теплової денатурації білків[2].

6.3. Термостабільність ДНК та інших нуклеїнових кислот

Стійкість ДНК до денатурації в екстремальних умовах проживання

гіпертермофільних архей може забезпечуватися ДНК-зв'язуючими білками -

аналогами гістонів еукаріот, поліамінами, відносно високим вмістом

нуклеотидних залишків G і C[7]. Зв'язування гістонів з еукаріотичними ДНК

призводить до її негативної спіриалізації, тоді як для комплексів ДНК з

білком HMf архей Methanobacteriales характерна позитивна

суперспіриалізація[56]. Клітинні поліаміни, що стабілізують ДНК і вторинні

структури РНК, в гіпертермофільних архей досить різноманітні : лінійні

триаміни (спермідин, норспермідин і гомоспермідин), тетрааміни (спермін і

норспермін), пента- і гексааміни, гуанідоамін (агматин), четвертинний

пентаамін N4-біс(амінопропіл)спермідин та ацетильований пентаамін[57].

Крім цього, денатурація ДНК за високих температур зменшується завдяки

присутності стабілізуючого фактора -- циклічного 2,3- дифосфогліцерата ( в

присутності K

), але лише в деяких гіпертермофілах[10]. Незначна кількість

ДНК-зв'язуючих білків, названих Sac7d, виявлена в членів роду Sulfolobus

(Сrenarchaeotа ), вони підвищують температуру плавлення ДНК приблизно

на 40°C[33] . Натомість Euryarchaeotа містять вищезгадані гістоноподібні

протеїни, які зумовлюють компактну укладку ДНК в подібні до нуклеосоми

структури, захищаючи її таким чином від теплової денатурації.

Серед гіпертермофільних архей діють ефективні механізми репарації та

відновлення нативної структури ДНК. Так, американський мікробіолог

Денніс Гроган виявив в Sulfolobus acidocaldarius особливий світлозалежний

процес відновлення пошкоджених ділянок ДНК, відомий як

„фотооживлення”[56]. Цікавим виявилось те, що даний механізм відмінно

працював лише за кімнатних температур, які далекі від оптимальних для

даної групи мікроорганізмів, а також те, що пошкодження ДНК, здійснені

ультрафіолетовим випромінюванням, були більш відчутнішими, ніж

здійснені високою температурою. Можливо, в термальних біотопах головним

агресивним щодо ДНК фактором є короткохвильова частина сонячного

спектра, ніж екстремально високі температури.

6.4. Межі термоадаптації

Лабораторні дослідження доводять, що межі високотемпературної

витривалості екстремальних архей лежать в діапазоні від 140 до 150°C[33].

Такі умови в природі реалізуються лише в глибоководних гідротермальних

джерелах ( типу „ чорних курців”). З’являються дані про ідентифікацію архей

за температур більш ніж 250°C[2]. Це видається можливим завдяки високим

тискам за яких вода не кипить, бо життєво необхідною умовою існування є

наявність води саме в рідкому агрегатному стані[12]. Цікавим видається те,

що в таких випадках АТФ не може слугувати енергетичним ресурсом, бо

переходить в інші нестабільні форми[33]

Розібрані вище гіпотези, імовірно, вносять певний вклад в механізми

термофілії, доповнюючи один одного, хоча не виключено, що молекулярні

механізми цього явища можуть бути значно ширше і для їх розуміння

необхідні додаткові дослідження.

7. КОРОТКА ХАРАКТЕРИСТИКА ОКРЕМИХ ПРЕДСТАВНИКІВ

ГІПЕРТЕРМОФІЛЬНИХ АРХЕЙ

Тип: Nanoarchaeota. Рід: Nanoarchaeum. Вид: Nanoarchaeum equitans

Nanoarchaeum equitans (або наноархей) – унікальний вид

гіпертермофільних архей, знайдений в 2002 році в гідротермальних джерелах

біля узбережжя Ісландії німецьким мікробіологом Карлом Шеттером (Karl

Stetter), єдиний відомий до теперішнього часу представник типу

Nanoarchaeota[26]. Може розвиватися лише в кокультурі з археями роду

Ignicoccus з царства Crenarchaeota , що є унікальним явищем серед

екстремальних архей. На одній клітині Ignicoccus паразитує від 2 до 4 клітин

Nanoarchaeum equitans, діаметр яких 0,35-0,50 мкм ( Рисунок 7.1) – це одні з

найменших живих організмів[23]. Клітинна стінка наноархей складається з S-

шару, який, здається, вкриває периплазматичний простір. У місці їх контакту

прикріплювальних структур не виявлено[33]. Відділення Nanoarchaeum

equitans від клітин Ignicoccus може бути викликане м'яким ультразвуковим

опроміненням. При культивуванні кокультури в штучних умовах на пізній

експоненціальній фазі росту спостерігалося самостійне відділення близько

80% клітин Nanoarchaeum equitans від Ignicoccus[58].

Метаболізм Nanoarchaeum equitans поки не відомий. Вони не

розмножуються у відсутності живих клітин Ignicoccus. Nanoarchaeum equitans

строгі анаероби. Оптимальна температура проживання цих архей складає

90°C[58].

Рисунок 11 -- Електронні мікрофотографії клітин Nanoarchaeum

equitans (менші) на поверхні Ignicoccus штаму

Kin 4M (більші)[23].

Їх геном повністю секвенований і складає 490 885 пар основ. Це

найменший геном (менше лише у вірусів), який поки що вдалося

зафіксувати. В Nanoarchaeum equitans залишилися лише гени, що

відповідають за біосинтез білка, реплікацію, транскрипцію і трансляцію, 95

% генома кодують білки. Nanoarchaeum equitans не можуть синтезувати

ліпіди, нуклеотиди і амінокислоти отримуючи їх від Ignicoccus, можливо

вони також залежать від енергетичного метаболізму господаря[26].

Швидкість росту Ignicoccus в чистій культурі і кокультурі з Nanoarchaeum

equitans не відрізняється, лише дуже велике число наноархей пригнічує

розвиток Ignicoccus. У зв'язку з цим Nanoarchaeum equitans можна розглядати

як паразитів, що робить їх єдиними відомими паразитами серед архей[10].

Nanoarchaeum equitans виділені з гарячих сірчаних джерел Серединно-

атлантичного хребта на глибині 106 м. Пізніше 16s рРНК наноархей з

послідовностями, схожими на Nanoarchaeum equitans, виявили в чорних

курцях Тихого океану, у гейзерах Йеллоустона і Камчатки. Методом FISH

встановлено, що всі Nanoarchaeota прикріпляються до клітин інших архей,

тому паразитизм може бути характерною ознакою всього типу[58].

Тип: Euryarchaeota. Рід: Thermococcus.

Вид: Thermococcus kodakaraensis

Раніше відомий як представник роду Pyrococcus, Thermococcus

kodakarensis - гіпертермофільний архей, метаболізм якого пов’язаний з

молекулярною сіркою; зазвичай населяє морські гідротермальні джерела і

наземні гарячі сірковмісні сольфатари. Вперше був виявлений в сольфатарах

острова Кодакара (Японія), завдяки якому і отримав свою назву. Цей

унікальний мікроорганізм представляє значний інтерес для науковців,

оскільки розвинув особливі механізми адаптації до надзвичайно

високотемпературних умов. Крім цього, він виробляє комерційно цінні

термостійкі ДНК-полімерази та інші ферменти, які використовуються для

реалізації ПЛР (Полімеразної Ланцюгової Реакції)[19]. Thermococcus

kodakarensis росте за оптимальної температури 86°C, в діапазоні 60-100°C, і

при pH 5-9. Клітини мають форму нерегулярних кокків (1-2 мкм в діаметрі) з

єдиною ліпідною мембраною і рухливі завдяки полярним жгутикам (

Рисунок 7.2)[23]. Це строгі анаероби що окрім сірки, використовують як

джерела вуглецю та енергії амінокислоти, пептиди, піруват та крохмаль.

Метаболічні шляхи T. kodakarensis включають глюконеогенезис і гліколіз;

продукти метаболізму - водень і сірководень[33].

Рисунок 12 --Мікрофотографія характерної клітини гіпертермофільної

археї Thermococcus kodakarensis[23]

Нещодавно японські біохіміки виявили в Thermococcus kodakarensis

незвичайний спосіб фіксації вуглекислого газу, що відрізняється від циклу

Кальвіна безпосередньою участю в ньому рибонуклеотидов

(АМФ).Можливо, цей спосіб фіксації неорганічного вуглецю найдревніший з

тих, що були відомі до цих пір[59].Thermococcus kodakarensis відіграють

важливу роль в екології гідротермальних систем і зустрічаються в багатьох

гіпертермофільних мікробних співтовариствах.

Тип: Crenarchaeota. Рід: Pyrodictium. Вид: Pyrodictium occultum

Pyrodictium occultum – яскравий представник гіпертермофільних архей

з оптимальною температурою росту приблизно в межах 80°C-105°C,

метаболізм якого тісно пов’язаний з молекулярною сіркою. Має унікальну

клітинну структуру, що включає мережу порожнистих канальців і плоских,

дископодібних клітин -- 0.3 - 2.5 мікрон в діаметрі і аж до 3 мікрон в ширину

( Рисунок 13)[43].

Рисунок 13 -- Мікрофотографія дисків і канальців Pyrodictium occultum[43].

Поки точна причина такої морфології невідома, ймовірно, що діапазон

рухливості, забезпечений порожнистими канальцями, дозволяє клітинам

вільно переходити в найбільш сприятливі місця існування, дозволяючи

Pyrodictium occultum населяти різноманітні щілини в глибоководних

пористих стінках гідротермальних джерел „чорних.курців”[10].

Екологічна роль даних архей досі нез’ясована через труднощі

виділення непошкоджених клітин мікроорганізмів і недослідженість

природних біотопів Pyrodictium.

8. ПРАКТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ І ВИКОРИСТАННЯ В БІОТЕХНОЛОГІЇ

Практичне використання гіпертермофільних архей перш за все

пов’язане з комерційною цінністю їх термостабільних ферментів, до яких

прикутий зростаючий інтерес з боку наукових та індустріальних кіл. З

появою потужних сучасних інструментів молекулярної біології та значної

кількості описаних і виділених гіпертермофільних ензимів, їх впровадження

в нові технологічні процеси зростає з року в рік[43]. Але на даний час

використовують лише невелику частину відомих термостабільних ферментів

і тому доцільно розглянути й подальші перспективи на наступні роки.

8.1. Використання в молекулярній біології

Найбільш поширеного використання набули термостабільні ДНК-

полімерази (Tfu-ДНК-полімерази) з гіпертермофільних архей Pyrococcus

furiosus, оптимум роботи яких знаходиться в області 72°С; їх впровадження в

метод ПЛР призвело до забезпечення як високої процесивності (протяжності

ділянки, що синтезується за одне зв'язування ферменту, і в результаті

швидкості синтезу), так і високої точності копіювання ДНК [19]. Крім того,

що ця полімераза витримує високу (94—96°C) температуру, необхідну для

денатурації ДНК, у неї присутній механізм корекції помилок у 3'→5'

напрямку (3'→5' екзонуклеазна активність)[54].Такі полімерази дозволили

значно скоротити число мутацій, які зустрічаються в копійованій

послідовності ДНК, якісно вдосконаливши метод ПЛР, що в наш час широко

використовується в біологічній і медичній практиці, наприклад для

клонування генів, введення мутацій, виділення нових генів, секвенування,

для створення генетично модифікованих організмів, діагностики

захворювань (спадкових, інфекційних), ідентифікації малих кількостей ДНК,

встановлення батьківства.