Курсовая работа - Малая ядерная РНК

Подождите немного. Документ загружается.

После связывания U2 мяРНП к сплайсосоме присоединяется крупный

рибонуклеопротеид, содержащий 3 мяРНК: U4,U5 и U6 (рис. 6). В результате

образуется комплекс B1, содержащий 5 молекул мяРНК. U1 мяРНК в этом

комплексе связана с 5’SS, U2 – с местом разветвления, а U4 мяРНК связана с

U6 многочисленными комплементарными взаимодействиями и тем самым до

поры до времени блокирует активность U6 мяРНК . Все мяРНК, кроме U6

синтезируются РНК полимеразой II и имеют классические атрибуты мяРНП

– связанные Sm белки и триметилированный кеп. U6 мяРНК

транскрибируется РНК полимеразой III и не имеет кеп-структуры. Кроме

того, вместо Sm белков с ней связаны гомологичные им Lsm белки.

Рис. 6. Образование B1 комплекса: связывание U4/U5/U5 мяРНП.

После образования B1 комплекса происходит самая драматическая

конформационная перестройка сплайсосомы (рис. 7). Во-первых, теряется связь U1

мяРНК с 5'SS. Во-вторых, расплетается дуплекс между U4 и U6 мяРНК. В-третьих,

образуются дуплексы между U6 мяРНК и 5’SS, а также U6 и U2 мяРНК. Самую

активную роль в этих перестройках играют белки, ассоциированные с U5 мяРНК.

U5-200k расплетает дуплекс между U4 и U6 мяРНК, а U5-100k помогает образовать

контакт между U6 и 5’SS. Другой белок, ассоциированный с U5 (U5-220k)

способствует тому, что консервативная шпилька U5 мяРНК связывает 5’SS и 3’SS. В

результате оказывается, что дуплекс U2 и U6 связывает место разветвления и 5'-

место сплайсинга. U5 мяРНК дополнительно фиксирует 5’SS так, что оказывается

возможным провести нуклеофильныю атаку 2’-OH выпетливающегося аденозина на

межнуклеотидную связь 5’SS.

Рис. 7. Образование комплекса B2.

wПереход от B2 комплекса к C1 как раз соответствует первой стадии

сплайсинга, т.е. образованием лассообразной структуры и освобождению 3’-

гидроксила 5’-концевого экзона (рис.8). В самом каталитическом акте

сплайсосомы принимают участие белки Spp2p и Prp2p, хотя основную роль в

катализе играют не белки, а сплайсосомная РНК.

После прохождения первой стадии сплайсинга необходимо подставить в

активный центр сплайсосомы 3’SS. За выбор 3’-места сплайсинга отвечает

U5-220k белок. Целый ряд белковых факторов играют роль в подстановке 3’-

места сплайсинга в активный центр. Кроме того, осуществляется контроль за

правильностью проведения первой стадии сплайсинга в котором принимает

участие белок Prp16p.

Рис. 8. Образование комплекса C1: подстановка 3’SS в

активный центр.

Особую роль в позиционировании 5’-экзона и 3'-места сплайсинга играет U5

мяРНК. Молекула U5 мяРНК содержит петлю из неспаренных нуклеотидов

на ножке (стволике), где нуклеотиды образуют пары, создавая двойную РНК-

спираль. Нуклеотиды петли, взаимодействуя за счет водородных связей с

экзонами, удерживают их вблизи друг от друга. Кроме того, первый и

последний нуклеотиды интрона образуют неканонические взаимодействия

двух G (гуанозинов). Эти взаимодействия помогают стягивать экзоны и

осуществлять сплайсинг. Характер водородных связей функциональных

групп гуанина отличается от классических, наблюдаемых в паре G-C Уотсона

и Крика. Так, аминогруппа G, участвующая в установлении

комплементарных взаимодействий с С, здесь остается вне игры. Вторая

стадия сплайсинга, катализируемая сплайсосомой заключается в атаке 3’-

гидроксила первого экзона на межнуклеотидную связь между интроном и 3’-

концевым экзоном. В результате экзоны оказываются соединенными, а

интрон – вырезанным в виде лассообразной структуры (рис.9).

Рис. 9. Образование комплекса C2. Лигирование экзонов

и полное выщепление интрона.

Рис. 10. Образование комплекса I. Высвобождение интрона и лигированных

экзонов.

После прохождения обеих стадий сплайсинга становится необходимо

разобрать сплайсосому, освободить лигированные экзоны, а также

вырезанный интрон (рис 10). мРНК высвобождает HRH1 белок. Разборкой

сплайсосомы занимается белок mDEAH9. Дополнительный белковый фактор

(Prp24p) нужен для воссоздания U4/U6 гетеродимера. Не все белки,

входящие в состав сплайсосомы, покидают мРНК после сплайсинга.

Некоторые остаются связанными с мРНК в ядре и участвуют в экспорте

сплайсированной мРНК. Другие переносятся с мРНК в цитоплазму, где

осуществляют “контроль качества” мРНК при ее трансляции.

На рисунке 11 схематично представлен весь цикл работы сплайсосомы.

Рис. 11. Цикл работы сплайсосомы.

Таким образом, сплайсинг протекает в несколько этапов: начинается с

взаимодействия пре-мРНК с U1 мяРНК, затем образуются лассо и сложная

многокомпонентная структура. Пространственная структура

взаимодействующих участков молекул РНК обеспечивает каталитические

реакции разрыва одних межнуклеотидных связей и возникновение новых. В

основе катализа лежит способность РНК образовывать описанные структуры,

обеспечивающие высокую реакционную способность определенных

нуклеотидов, расположенных по длине молекул РНК. Возникновение таких

структур обеспечивает точность сплайсинга. В ряде случаев, например в

транскриптах генов клеточных органелл (митохондрий или хлоропластов),

образование сложной трехмерной структуры в районе интрона обеспечивает

его вырезание и сшивание экзонов без участия белков. Такой процесс, не

зависящий от белков, называют самосплайсингом или аутосплайсингом.

Обнаружение способности молекул РНК катализировать собственные

химические превращения или модификацию (созревание) других молекул

РНК позволило назвать их рибозимами по аналогии с ферментами

(энзимами). Необходимо отметить, что активность рибозимов сильно

увеличивается, когда они находятся в комплексе с белками. В обоих случаях

успешный ход катализа обеспечивается трехмерными структурами белка или

РНК-РНК-комплекса. Повреждение этих структур останавливает реакцию. В

случае рибозимов первостепенную роль играют комплементарные

взаимодействия нуклеотидных пар. Заметим, однако, что белки ускоряют

взаимодействия мяРНК с пре-мРНК.

В сплайсинге принимают участие белки, обладающие ферментативной

активностью. Для сборки комплекса, катализирующего сплайсинг,

необходимо потребление энергии в виде расщепляемых молекул АТФ,

поэтому в его составе обнаруживаются белки, обладающие

аденозинтрифосфатазной активностью. Кроме того, здесь функционируют и

РНК-хеликазы - ферменты, способные расплетать при потреблении АТФ

двойные спирали РНК-РНК. Эти ферменты подобны ДНК-хеликазам,

расплетающим двунитевую спираль ДНК при репликации молекулы ДНК.

Хеликазы обеспечивают ход сплайсинга. Они вовремя разрушают одни РНК-

РНК взаимодействия (например, U4 мяРНК - U6 мяРНК ), способствуя тем

самым возникновению новых нековалентных связей между молекулами РНК.

Таким образом, последовательность событий, ведущих к сплайсингу экзонов,

достаточно жестко определена, причем каждая последующая стадия (или

реакция) обусловлена предыдущей. Многокомпонентность машины

сплайсинга позволяет ускорять или тормозить процесс созревания РНК, если

изменять концентрацию отдельных компонентов или вызывать их

химическую модификацию. Например, наблюдали фосфорилирование белков

сплайсинга, сопровождающееся активацией одних и инактивацией других

белков.

Альтернативный регулируемый сплайсинг.

Оказалось, что экзоны, если их несколько, могут сшиваться

(сплайсироваться) в разных комбинациях. Более того, нуклеотидная

последовательность, выступающая как экзон в одном случае, ведет себя как

интрон в другом. Эти возможности выбора путей сплайсинга молекулы РНК-

предшественника представлены на рис. 12.

Рис. 12. Схема альтернативного сплайсинга пре-мРНК.

Так, например, участок экзона 1а может вести себя как интрон. Другой

случай демонстрирует образование двух разных РНК, несущих участки,

кодирующие разные белковые структуры. Так, если экзон 2 кодирует в

молекуле белка элементы α-спирали, а экзон 3 - так называемой β-структуры,

то РНК 1 будет кодировать белок, не включающий указанный участок β-

структуры, а РНК 2, напротив, служит матрицей при образовании белка без

участка α-спирали. В результате образуются так называемые изоформы

белка. Это наблюдаемое для многих генов явление выбора путей созревания

мРНК получило название альтернативного сплайсинга. Многие гены

содержат десяток и более экзонов. Поэтому число вариантов зрелых молекул

мРНК, содержащих разные экзоны, потенциально может быть достаточно

большим, приближаясь к величине 2

, где n - число экзонов. Таким образом,

экзон-интронная структура оказывается чрезвычайно экономичной,

обеспечивая большое разнообразие белков, кодируемых разными мРНК,

которые, однако, произошли из одного и того же РНК-предшественника в

результате транскрипции одного гена.

Случаи альтернативного сплайсинга имеют место в мышечной ткани,

приводя к образованию функционально различающихся, но во многом

1а Экзон 2

Экзон 1

1 2

РНК1

РНК2

α-спираль в белке

β-структура в белке

1а

сходных (содержат общие экзоны!) белков. Рассмотрим конкретный пример -

тропомиозин, белок, участвующий в мышечном сокращении. В разных

клетках с гена тропомиозина синтезируются разные белки:

Это же явление широко распространено в нервной ткани, где, как известно,

транскрибируется огромное множество генов, обеспечивая разнообразие

белков. Так, например, разнообразие белков оболочки нервных волокон

обусловлено альтернативным сплайсингом. Альтернативный сплайсинг

нередко используется при синтезе вариантов белков - "факторов

транскрипции", необходимых для включения (или выключения) гена и

работы РНК-полимеразы. Наличие белка - фактора транскрипции может

определять судьбу клетки, ее дифференцировку в клетку

специализированной ткани: нервной, жировой, почечной и т.д.

Альтернативный сплайсинг выполняет свою роль и при образовании

вариантов белков клеточной адгезии, которые отвечают за передвижение

клеток и структурирование тканей. Бактерии, обладающие, как правило,

генами без интронов, лишены этого способа регуляции работы (экспрессии)

генов.

Каким образом осуществляется выбор пути альтернативного сплайсинга,

являющегося важным механизмом регуляции активности генов и клеточной

дифференцировки? Характер сплайсинга регулируется белками, способными

связываться с молекулой РНК в районах интронов или пограничных участках

экзон-интрон. Такие белки могут блокировать удаление одних интронов, в то

же время активируя вырезание других. РНК-предшественник складывается в

сложную трехмерную структуру, взаимодействуя с другими компонентами

сплайсосомы. Поэтому нетрудно представить себе такие пространственные

изменения этой структуры при участии белков, регулирующих сплайсинг,

которые исключат катализ объединения одной пары интронов и, напротив,

будут эффективно способствовать сшиванию другой пары.

Направленная регуляция путей сплайсинга может иметь громадные

биологические последствия, например определять пол организма. Случай

определения пола, основанный на регуляции сплайсинга, достаточно хорошо

изучен у плодовой мушки дрозофилы (рис.13). Успехи этих исследований

основаны на работах генетиков, изучавших мутации, нарушающие

становление пола. Огромную роль здесь сыграли также работы, в которых в

экспериментах in vitro были использованы "клонированные гены"

(рекомбинантные ДНК).

Рис.13. Регулируемый каскад следующих друг за другом альтернативных путей

сплайсинга определяет становление пола на самых ранних стадиях развития дрозофилы.

Прямая и волнообразная стрелки обозначают соответственно начало и конец трансляции

(образование белка). Экзоны, специфичные для самцов, выделены розовым цветом.

У дрозофилы (впрочем, как и у человека) есть две половые хромосомы (X и

Y). Две X-хромосомы имеют самки, тогда как самцы - единственную X-

хромосому, а также Y-хромосому. Наличие двух X-хромосом у самок

достаточно для включения "главного гена", заставляющего включиться

"нижележащие" гены, участвующие в определении пола. Главный ген (рис.

13) поначалу начинает работать (транскрибироваться) только у самок с двумя

Х- хромосомами. В клетке срабатывают механизмы, подсчитывающие число

Х-хромосом. Этот механизм основан на том, что у самок с двумя Х-