Иванов А.Т., Петрова В.С., Кенигсберг Я.Э. Ветеринарная токсикология

Подождите немного. Документ загружается.

ненную силикагелем ACK на 18 см и промытую 10—20 мл

н-гексана. Затем колонку промывают 100 мл смеси н-гек-

сана и диэтилового эфира в объемном соотношении 6 : 4.

Хроматографирование экстракта и элюирующей смеси

через колонку проводят небольшими порциями (около

20 мл). После очистки экстрактов растворитель испа-

ряют. Сухой остаток переносят в пробирку 1 мл н-гек-

сана (два раза по 0,5 мл), прибавляют 1 мл пиридина.

0,5 мл свежеприготовленного отфильтрованного 10%-ного

раствора KOH энергично встряхивают и нагревают на

кипящей водяной бане в течение 2 мин. Содержимое про-

бирки после охлаждения растворяют в 2 мл этилового

спирта, фильтруют через бумажный фильтр, промывают

фильтр спиртом, доводят объем фильтрата до 5 мл и

колориметрируют против этанола в кюветах с расстоя-

нием между рабочими гранями 1 см при длине волны

490 нм.

Содержание пестицида определяют по градуировоч-

ному графику, для построения которого в пробирки вно-

сят 0,05; 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 0,9; 1,0 мл стандартного раство-

ра технического препарата, содержащего в 1 мл 100 мкг

активнодействующего вещества триаллата, добавляют

1 мл пиридина, 0,5 мл 10%-ногб раствора KOH и выпол-

няют все операции, как описано выше.

На оси абсцисс откладывают количество триаллата

(мкг), на оси ординат соответствующие значения опти-

ческой плотности. Проводят линию через точки пересе-

чения.

Расчет содержания триаллата в пробе ведут по фор-

муле

X-A

где X — содержание триаллата в анализируемой пробе,

мг/кг; А — количество пестицида, определенное по гра-

дуировочному графику, мкг; P — масса пробы, г.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ 2,4-ДИХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ

КИСЛОТЫ (2,4-Д)

Принцип метода основан на экстракции 2,4-Д из

гидролизованной пробы органическим растворителем с

последующим определением его с помощью газожидкост-

ной хроматографии или методом тонкослойной хрома-

тографии.

'141

Газожидкостная хроматография. 250—1000 мл воды

помещают в делительную воронку, подкисляют соляной

кислотой до рН 3, прибавляют 1 мл стандартного раст-

вора 2,4,5-Т с концентрацией 2,5 мкг/мл и экстрагируют

тремя порциями диэтилового эфира (100, 50 и 50 мл).

Объединенный эфирный экстракт переносят в делитель-

ную воронку и экстрагируют трижды по 50 мл 3%-ным

водным раствором бикарбоната натрия. Объединенный

водный раствор промывают двумя порциями петролей-

ного эфира (или гексана) по 50 мл и отбрасывают его,

а водный раствор подкисляют соляной кислотой до рН 3

и трижды экстрагируют диэтиловым эфиром (3X50 мл).

Объединенный эфирный экстракт сушат безводным суль-

фатом натрия (5—10 г) в течение 15—30 мин при перио-

дическом встряхивании и удаляют растворитель. Сухой

остаток в колбе метилируют, используя диметилсульфат.

50 г травы гомогенизируют в 150 мл дистиллирован-

ной воды, гомогенат переносят в круглодонную колбу

емкостью 1 л, приливают 40 мл концентрированной со-

ляной кислоты.

50 г зерна, 10 соломы или сена помещают в круглодон-

ную колбу емкостью 1 л и приливают 150 Мл 2 н. раство-

ра соляной кислоты. К подготовленным образцам добав-

ляют по 1 мл стандартного раствора 2,4,5-Т с концентра-

цией 2,5 мкг/мл, перемешивают, присоединяют обрат-

ный холодильник и помещают на кипящую водяную

баню на 1 ч. После охлаждения гидролизат фильтруют

через бумажный фильтр на воронке Бюхнера, промы-

вают осадок тремя порциями по 30 мл 2 н. раствора со-

ляной кислоты. К фильтрату добавляют 40%-ный раствор

фосфорно-вольфрамовой кислоты до 2%-ной концентра-

ции, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр

на воронке Бюхнера. Осадок трижды промывают 2 н.

раствором соляной кислоты порциями по 30 мл.

Объединенный фильтрат переносят в делительную во-

ронку и обрабатывают тремя порциями диэтилового эфи-

ра (общий объем эфира равен объему фильтрата), про-

мывают 15—20 мл дистиллированной воды до нейтраль-

ной реакции промывных вод и затем экстрагируют тремя

порциями 3%-ного раствора бикарбоната натрия по

50 мл. Водные экстракты объединяют, подкисляют кон-

центрированной соляной кислотой до рН 1 и экстраги-

руют тремя порциями диэтилового эфира по 75, 50, 50 мл.

Объединенный эфирный экстракт после промывания

дистиллированной водой до нейтральной реакции про-

'142

мывных вод сушат безводным сульфатом натрия (5—

10 г) в течение 15—30 мин, периодически встряхивая, и

удаляют растворитель.

Сухой остаток растворяют в 0,5 мл ацетона и раствор

наносят в виде полосы на стеклянную пластинку 9X12 см

с тонким слоем силикагеля KCK и дважды хроматогра-

фируют в системе растворителей петролейный эфир (или

гексан) —диэтиловый эфир — муравьиная кислота (50:

:50:2). Затем снимают силикагель с пластинки в виде

1 см зоны 2,4-Д на уровне Rf 2,4-Д * и количественно

переносят в коническую колбу с притертой пробкой на

50 мл. Смачивают силикагель в колбе 1 мл дистиллиро-

ванной воды, приливают 4—5 мл ацетона, встряхивают

1—2 мин и фильтруют через бумажный фильтр. Обра-

ботку силикагеля ацетоном проводят трижды. Объеди-

ненный ацетоновый экстракт сушат безводным суль-

фатом натрия, удаляют растворитель и метилируют.

В пробу молока 25—50 мл вносят 1 мл стандартного

раствора 2,4,5-Т с концентрацией 2,5 мкг/мл, прибавляют

40—80 мл концентрированной соляной кислоты, поме-

щают в круглодонную колбу емкостью 250 мл, присоеди-

няют обратный холодильник и помещают на кипящую

водяную баню на 1 ч для гидролиза. После охлаждения

в колбу приливают 15 мл 40%-ного раствора фосфорно-

вольфрамовой кислоты, тщательно встряхивают, вносят

100 мл дистиллированной воды и содержимое фильтруют

под вакуумом на воронке Бюхнера. Остаток на фильтре

промывают 2 н. раствором соляной кислоты, экстраги-

руют диэтиловым эфиром трижды порциями по 50 мл.

25—50 г мяса измельчают на мясорубке, помещают в

двугорлую круглодонную колбу емкостью 500 мл, вносят

1 мл стандартного раствора 2,4,5-Т с концентрацией

2,5 мкг/мл, приливают 100—200 мл 6 н. соляной кисло-

ты, присоединяют обратный холодильник и помещают на

кипящую водяную баню на 1 ч, перемешивая содержи-

мое. После охлаждения в колбу приливают 15 мл

40 %-ного раствора фосфорно-вольфрамовой кислоты,

100 мл дистиллированной воды и содержимое фильтруют

под вакуумом на воронке Бюхнера. Остаток на фильтре

промывают 2 н. раствором соляной кислоты, фильтрат

экстрагируют диэтиловым эфиром три раза по 50 мл.

Полученный после очистки проб объединенный эфир-

* Rf 2,4-Д В указанной системе растворителей определяют пред-

варительно.

'143

ный экстракт сушат безводным сульфатом натрия и

упаривают, сухой остаток метилируют.

сухому остатку в колбе приливают 3 мл

5%-ного

раствора диметилсульфата в абсолютном метаноле, тща-

тельно ополаскивают стенки колбы, прибавляют 1 г без-

водного сульфата натрия, присоединяют обратный холо-

дильник и помещают на водяную баню (55 °С) на 10 мин.

После окончания реакции метилирования содержимое

колбы охлаждают под водопроводной водой, приливают

3 мл насыщенного раствора хлористого натрия, 1 мл

н-гексана, энергично встряхивают в течение 2 мин и пос-

ле расслоения фаз вводят 3 мкл гексанового слоя в хро-

матограф.

Анализ проводят на газовом хроматографе с детекто-

ром по захвату электронов или постоянной скорости ре-

комбинации. Используют колонку длиной 2 м, диаметром

3 мм, заполненную хроматоном N-AW, силанизиро-

ванным ДМХБ с 5 % SE-30 или OV-17. Скорость газа-

носителя (азот о. с. ч.) через колонку — 50 мл/мин, про-

дувочного газа—150 мл/мин, температура термостата

колонок — 200 °С, детектора — 220

C. Шкала электро-

метра 2

•

-12

, скорость протяжки диаграммной ленты —

240 мм/ч. Хроматографирование одной пробы проводят

дважды. На хроматограммах измеряют высоты пиков

метиловых эфиров 2,4-Д и 2,4,5-Т, вычисляют среднее

значение отношений этих высот из параллельных опре-

делений. Содержание препарата находят по градуиро-

вочному графику.

Для построения градуировочного графика к пробам

чистых образцов прибавляют 5, 10, 15, 20 мкг 2,4-Д и

1 мл стандартного раствора 2,4,5-Т, далее поступают,

как описано для каждого образца. На хроматограммах

измеряют высоты пиков метиловых эфиров 2,4-Д и

2,4,5-Т, вычисляют среднее их значение и строят график

зависимости отношения высот хроматографических пи-

ков метиловых эфиров 2,4-Д и 2,4,5-Т от содержания

2,4-Д. Полученный градуировочный график обрабаты-

вают по методу наименьших квадратов и получают

уравнение в виде

Y-A

где X — содержание 2,4-Д, мг/л; Y — соотношение высот

хроматографических пиков метиловых эфиров 2,4-Д и

2,4,5-Т; А и В — коэффициенты, полученные при обра-

'144

ботке градуировочного графика по методу наименьших

квадратов.

Тонкослойная хроматография. Сухой остаток в колбе

растворяют в 0,2 мл диэтилового эфира и с помощью ка-

пилляра или медицинского шприца количественно нано-

сят на хроматографическую пластинку (9X12 см) с тон-

ким слоем силикагеля КСК, закрепленного гипсом. За-

тем на хроматографическую пластинку наносят 2, 5 и

10 мкг 2,4-Д в виде раствора в ацетоне и проводят

хроматографирование в системе растворителей петролей-

ный эфир (или н-гексан) —диэтиловый эфир — муравьи-

ная кислота (50': 50: 2). После окончания данного про-

цесса пластинку извлекают из хроматографической ка-

меры и сушат в вытяжном шкафу. Для обнаружения

зоны локализации 2,4-Д пластинку обрабатывают прояв-

ляющим реактивом (0,5 г азотно-кислого серебра, 5 мл

дистиллированной воды, 7 мл аммиака, помещают в кол-

бу емкостью 100 мл и доводят до метки ацетоном), сушат

и облучают УФ-лучами в течение 10—15 мин. При нали-

чии в пробе 2,4-Д на пластинке появляется серо-черное

пятно на белом фоне с величиной Rf 0,5. Количественное

определение 2,4-Д проводят путем визуального сравне-

ния размера и интенсивности окраски пятен стандарта с

пятном пробы. Минимально детектируемое количество

2,4-Д на хроматографической пластинке 1 мкг.

Содержание 2,4-Д находят по формуле

х =

A-S

PSi '

где X — содержание 2,4-Д в пробе, мг/л или мг/кг; А —

количество препарата в стандарте, мкг; S

— площадь

пятна исследуемой пробы, мм

; Si — площадь пятна

стандарта, мм

; P — объем или масса пробы, мл или г;

К — коэффициент пересчета на объем всего анализируе-

мого экстракта.

Для определения содержания в пробе натриевой,

диметилдиэтил- или триэтаноламинной соли 2,4-Д полу-

ченный результат необходимо соответственно умножить

на 1,1; 1,46 и 1,67.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ 2-МЕТИЛ-4-ХЛОРФЕНОКСИУКСУСНОЙ

КИСЛОТЫ (2М-4Х)

Принцип метода основан на экстракции 2М-4Х из ана-

лизируемой пробы органическим растворителем с после-

'145

дующим определением в виде метилового эфира бром-

производного 2М-4Х с помощью газожидкостной

хроматографии с детектором постоянной скорости ре-

комбинации. Метод позволяет определять соли 2М-4Х,

так как при экстракции из пробы они превращаются в

кислоту.

Для приготовления стандартного раствора метилово-

го эфира бромпроизводного 2М-4Х в грушевидную колбу

вносят 2 мкл стандартного раствора 2М-4Х в диэтиловом

эфире и добавляют 0,2 мл 5%-ного раствора брома в

четыреххлористом углероде, насыщенном йодом. Колбу

закрывают притертой пробкой, встряхивают и оставляют

на 24 ч, затем помещают на водяную баню при темпера-

туре 50

C и под вакуумом упаривают содержимое до

сухого остатка. После этого в колбу приливают 3 мл

5%-ного раствора диметилсульфата в безводном метано-

ле, 1 г безводного сульфата натрия, тщательно ополаски-

вают стенки колбы, присоединяют обратный холодиль-

ник и помещают на 10 мин на водяную баню, нагретую

до 55 °С. После окончания реакции метилирования со-

держимое колбы охлаждают под водопроводной водой,

прибавляют 3 мл 0,01 н. раствора метабисульфита нат-

рия в насыщенном водном растворе хлористого натрия,

1 мл гексана и энергично встряхивают. После разделе-

ния фаз в хроматограф вводят 2 мкл гексанового рас-

твора.

Анализ проводят на газовом хроматографе, исполь-

зуя стеклянную колонку длиной 2 м с внутренним диа-

метром 3 мм, заполненную хроматоном-N-cynep с 5 %

OV-17. Газ-носитель — азот особой чистоты, скорость

на входе в колонку — 50 мл/мин, скорость продувочного

газа— 150 мл/мин. Температура испарителя 220 °С, тер-

мостата колонок 190°С, термостата детектора 230°С.

Пробу воды 250—1000 вносят в делительную воронку,

подкисляют 10%-ным раствором серной кислоты до рН 3

(индикаторная бумага) и экстрагируют тремя порциями

диэтилового эфира (100, 50 и 50 мл). Объединенный

эфирный экстракт помещают в делительную воронку,

прибавляют 75 мл 3%-ного водного раствора бикарбо-

ната натрия и экстрагируют 3 мин. После расслоения

фаз собирают нижний водный слой. Экстракцию повто-

ряют еще двумя порциями раствора бикарбоната нат-

рия по 50 мл. Объединенный экстракт промывают тремя

порциями петролейного эфира по 50 мл, отбрасывая его,

подкисляют 10%-ным водным раствором серной кислоты

'146

до рН 3 (индикаторная бумага) и экстрагируют тремя

порциями диэтилового эфира (100, 50 и 50 мл). Объеди-

ненный эфирный экстракт помещают в делительную во-

ронку, прибавляют 75 мл 3%-ного водного раствора би-

карбоната натрия и экстрагируют 3 мин. После расслое-

ния фаз собирают нижний водный слой. Экстракцию

повторяют еще двумя порциями по 50 мл раствора би-

карбоната натрия. Объединенный экстракт промывают

тремя порциями петролейного эфира по 50 мл, отбрасы-

вая его, подкисляют 10%-ным водным раствором серной

кислоты до рН 3 и трижды экстрагируют диэтиловым

эфиром порциями по 50 мл.

Объединенный эфирный экстракт сушат, пропуская

через стеклянную колонку, заполненную безводным суль-

фатом натрия (20 г). Растворитель удаляют на ротаци-

онном испарителе в грушевидной колбе емкостью 100 мл

и к сухому остатку прибавляют 0,2 мл 5%-ного раствора

брома в четыреххлористом углероде, насыщенном йодом.

Колбу закрывают притертой пробкой, встряхивают и

оставляют на 24 ч, затем помещают на водяную баню с

температурой 50 °С и под вакуумом содержимое упари-

вают до сухого остатка. Далее в колбу приливают 3 мл

5%-ного раствора диметилсульфата натрия, тщательно

ополаскивая стенки колбы, присоединяют обратный хо-

лодильник и помещают на водяную баню с температу-

рой 55

C на 10 мин. После окончания реакции метили-

рования содержимое колбы охлаждают под струей водо-

проводной воды, прибавляют 3 мл 0,01 и. раствора

метабисульфита натрия в насыщенном водном растворе

хлористого натрия, 1 мл гексана и энергично встряхи-

вают в течение 2 мин. После разделения фаз вводят в

хроматограф 3 мкл гексанового раствора.

Измельченную пробу растительного материала 50 г

экстрагируют тремя порциями по 50 мл смеси раствори-

телей (1 часть 10%-ного водного раствора серной кисло-

ты, 1,5 части 95%-ного этилового спирта, 2,5 части петро-

лейного эфира, 7,5 части диэтилового эфира). Продол-

жительность каждой экстракции 15 мин. Пробы с низким

содержанием влаги смачивают перед экстрагированием

дистиллированной водой (10—15 мл). После окончания

последней экстракции кашицу отфильтровывают на во-

ронке Бюхнера под вакуумом и остаток на фильтре про-

мывают двумя порциями по 50 мл смеси растворителей

(1 часть диэтилового эфира+1 часть петролейного

эфира).

'147

Соединенный экстракт переносят в делительную во-

ронку, прибавляют 15 мл 40%-ного водного раствора

фосфорно-молибденовой или фосфорно-вольфрамовой

кислоты, 15 мл концентрированной соляной кислоты и

содержимое периодически встряхивают в течение 15 мин.

После разделения слоев нижний водный однократно экс-

трагируют 30 мл смеси растворителей и объединяют с

верхним. Объединенный экстракт переносят в делитель-

ную воронку, прибавляют 75 мл 3%-ного водного раство-

ра бикарбоната натрия и далее поступают, как при опре-

делении 2М-4Х в воде.

К 1—2 мл крови добавляют двойной объем дистилли-

рованной воды и перемешивают. Экстрагируют двумя

порциями диэтнлового эфира по 75—80 мл. Экстракт

фильтруют через двойной складчатый фильтр из плот-

ной бумаги. Фильтрат упаривают на водяной бане при

60—65

C до 5—10 мл и добавляют 50—60 мл 0,5 н. раст-

вора едкого натра, 10 г хлористого натрия и 50 мл ди-

этилового эфира. После 10—15-минутного встряхивания

эфир отделяют и отбрасывают. Повторяют обработку

эфиром. К щелочному реэкстракту добавляют 6 н. ра-

створ соляной кислоты до рН 1, хорошо перемешивают

и экстрагируют двумя порциями эфира по 75 мл. Эфир

собирают в грушевидную колбу, подсушивают безводным

серно-кислым натрием и выпаривают досуха. Далее по-

ступают, как описано для воды.

В пробу молока объемом 20 мл вносят 1 мл концент-

рированной фосфорной кислоты, 4 г хлористого натрия

и помещают на кипящую водяную баню на 30 мин. Экс-

трагируют два раза 30 мл смеси диэтилового эфира и

этанола 2 : 1 и два раза 30 мл диэтилового эфира, встря-

хивая колбу с каждой порцией растворителя 5—10 мин.

В объединенный экстракт добавляют для створаживания

белков 15 мл 40%-ного раствора фосфорно-вольфрамо-

вой и 15 мл концентрированной соляной кислоты и встря-

хивают в течение 15 мин. В делительной воронке отде-

ляют верхний слой, а нижний повторно экстрагируют

30 мл диэтилового эфира, объединяя эфирный экстракт

с отделенным верхним слоем. Объединенный эфирный

экстракт промывают водой тремя порциями по 50 мл и

экстрагируют 3%-ным водным раствором бикарбоната

натрия тремя порциями по 50 мл. Объединенный бикар-

бонатный экстракт промывают тремя порциями петролей-

ного эфира по 25 мл, отбрасывая эфир. Бикарбонатный

экстракт подкисляют 10%-ным водным раствором сер-

'148

ной кислоты и трижды экстрагируют 30 мл диэтилового

эфира. Далее поступают, как описано для воды.

Для определения содержания 2М-4Х в пробе исполь-

зуют следующую формулу:

х =

P '

где А — количество стандарта, введенное в хроматограф,

мг; Hi — высота пика стандарта, мм; H

— высота пика

препарата в пробе, мм; Vi — объем экстракта, введен-

ный в хроматограф, мкл; V

— общий объем упаренного

экстракта, мкл; P — масса анализируемой пробы, кг

или л.

ОТРАВЛЕНИЕ МИКОТОКСИНАМИ

Отравления микотоксинами, или микотоксикозы,—

заболевания животных и птицы, вызываемые токсинами

микроскопических грибов, поражающих кормовые расте-

ния в стадии их вегетации и при хранении. В настоящее

время известно более 100 микотоксинов, продуцируемых

различными грибами. Наиболее распространенными из

них и опасными для здоровья животных являются афла-

токсины, охратоксины, рубротоксины, зеараленон, Т-2-

токсин, деоксиниваленол и др.

АФЛАТОКСИКОЗ

Заболевание сельскохозяйственных животных, возни-

кающее вследствие скармливания кормов, содержащих

афлатоксины. Продуцентами афлатоксинов являются гри-

бы Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. niger, Penicillium

cirinus и некоторые другие виды.

В настоящее время известно 4 основных афлатокси-

на — это Bi, B

, GJ, G

И ОКОЛО 6 их производных. Наи-

более токсичен и вырабатывается в большем количестве

афлатоксин B

Болеют все виды сельскохозяйственных животных и

птиц. Наиболее чувствительны к афлатоксинам поросята

в возрасте 3—12 недель, менее чувствительны свино-

матки, свиньи на откорме, телята, крупный рогатый скот,

из птиц — индюшата, утята, гусята. В половом отноше-

нии более чувствительны самцы. Недостаток в кормах

витаминов, белка и нарушение общего обмена веществ

'149

в организме способствуют и усугубляют развитие афла-

токсикоза.

Все афлатоксины являются гепатотропными ядами.

Они подавляют синтез нуклеиновых кислот и белка, в ре-

зультате чего развивается жировая и белковая дистрофия

печени.

Результатом функционального нарушения печени яв-

ляется повышение активности в сыворотке крови щелоч-

ной фосфатазы, AcAT, ЛДГ, сорбитолдегидрогеназы, сни-

жение общего белка и глобулинов. Кроме того, афла-

токсины являются канцерогенами, оказывают мутаген-

ное и тератогенное действие.

Клинические признаки острого афлатоксикоза харак-

теризуются отсутствием аппетита, вялостью, нарушением

функции желудочно-кишечного тракта, координации дви-

жений, развитием желтухи,судорог и парезов.

У свиней наступает смерть в течение суток, если с кор-

мом поступает 1—2 мг афлатоксина на 1 кг массы жи-

вотного.

Хроническое отравление животных выражается от-

ставанием в росте, желтушностью слизистых оболочек,

вялостью, снижением массы тела.

Патолого-анатомические изменения. У павших или

убитых животных отмечают желтушность слизистых обо-

лочек, множественные геморрагии на серозных оболоч-

ках и во внутренних органах. Печень увеличена, не-

равномерно окрашена. Слизистая оболочка желудка и

тонких кишок катарально воспалена, с точечными кро-

воизлияниями. В корковом слое почек отдельные точеч-

ные кровоизлияния.

При гистологическом исследовании устанавливают де-

генерацию гепатоцитов, белковую и жировую дистрофию.

Отмечают пролиферацию желчных протоков.

Диагноз ставят на основании клинических признаков

отравления, эпизоотологических данных, патолого-анато-

мических изменений и результатов определения афлаток-

сина в кормах.

Лечение. В первую очередь необходимо исключить из

рациона корм, содержащий афлатоксин. Затем живот-

ным назначают слабительные средства и адсорбенты,

слизистые отвары, симптоматические препараты, метио-

нин, витамин E и вволю зеленую массу.

Профилактика заключается в недопущении к скарм-

ливанию недоброкачественных или сомнительных по ка-

честву кормов без предварительного исследования их на

'150