Албертс Б., Брей Д. и др. Молекулярная биология клетки. Том 1
Подождите немного. Документ загружается.
361
Рис. 6-15. Сегмент цепи трансмембранного полипептида,
пронизывающего липидный бислой в виде α-спирали (по данным
рентгеноструктурного анализа кристаллов мембранного белка).
Показана только скелетная модель полипептидной цепи. Гидрофобные
аминокислоты выделены цветом. Торчащие неполярные боковые
группы аминокислотных остатков (не показаны) взаимодействуют с
гидрофобными цепями жирных кислот внутри липидного бислоя.
Полярные пептидные группы образуют между собой водородные
связи (не показаны) и, таким образом, экранируются от гидрофобного
окружения бислоя. Представлен фрагмент полипептида из
бактериального фотосинтезирующего реакционного центра,
изображенного на рис. 6-32. (J. Deisenhofer et al., Nature 318, 618-624,
1985 и H. Michel et al., EMBO J., 5, 1149-1158, 1986.)
Рис. 6-16. Типичный трансмембранный гликопротеин, пересекающий
мембрану 1 раз. Обратите внимание, что полипептидная цепь
пронизывает липидный бислой в виде правозакрученной α-спирали, и
что олигосахаридные группы и дисульфидные связи в
цитоплазматическом домене не образуются из-за восстановительных
условий в цитозоле клетки.
Некоторые белки, связанные с мембранами, вовсе не взаимодействуют с гидрофобной внутренностью липидного бислоя. Они соединены
с той или другой стороной мембраны за счет нековалентных взаимодействий с другими мембранными белками (пример 5 на рис. 6-14). Многие из
них высвобождаются из мембраны в сравнительно мягких условиях, например путем экстракции растворами с очень высокой или низкой ионной
силой или растворами с крайними значениями рН, которые влияют на взаимодействия белок-белок, но оставляют интактным липидный бислой.
Такие белки называют периферическими мембранными белками. Напротив, трансмембранные белки, белки, связанные с
фосфатидилинозитолом, и некоторые белки, удерживаемые в бислое с помощью цепи жирной кислоты (так же как и другие, крепко связанные
белки, которые могут быть высвобождены только после разрушения бислоя детергентами или органическими растворителями) называются
интегральными мембранными белками.
Та часть полипептидной цепи трансмембранных белков, которая погружена в гидрофобное окружение липидного бислоя, состоит в
основном из аминокислотных остатков с неполярными боковыми группами. Однако, поскольку пептидные группы полярны, а молекулы воды
недоступны, все пептидные группы в бислое стремятся образовать водородные связи между собой (см. рис. 3-26). Число водородных связей между
пептидными группами оказывается максимальным, если участок полипептидной цепи, проходящей через бислой, образует регулярную α-спираль.
Именно так большинство полипептидных цепей пересекает мембрану (рис. 6-15). В тех же случаях, когда через бислой проходит несколько
участков полипептидной цепи, пептидные группы могут в принципе быть насыщены водородными связями, если эти участки организованы в виде
Β-СЛОЕВ. Однако чаще полипептидная цепь белков, пронизывающих мембрану несколько раз, образует серию α-спиралей, а не Β-СЛОЕВ (пример 2
на рис. 6-14). Строгое условие максимизации числа водородных связей в отсутствие молекул воды (запрет на дегидратацию) означает также, что
полипептидная цепь, пронизывающая мембрану, вероятно, не меняет своего первоначального направления до полного пересечения мембраны,
поскольку наличие изгиба в цепи привело бы к уменьшению числа регулярных водородных связей. Видимо, по этой причине до сих пор не
обнаружено мембранных белков, погруженных в мембранный слой лишь частично.
362
Трансмембранные белки всегда имеют уникальную ориентацию в липидном бислое. Это отражает асимметричный характер их
биосинтеза и встраивания в мембранный бислой эндоплазматического ретикулума, а также различные функции цитоплазматических и
внеклеточных доменов этих белков. Основная масса трансмембранных белков гликозилирована. Как и в случае с гликолипидами, олигосахаридные
цепи всегда присутствуют на внеклеточной стороне мембраны, поскольку сахарные остатки присоединяются в цистернах эндоплазматического
ретикулума и аппарата Гольджи. Другая асимметрия заключена в белковых сульфгидрильных группах (SH), которые остаются восстановленными
(цистеины) в цитоплазматических доменах, но часто используются для формирования внутри- или межцепных дисульфидных (S — S) связей во
внеклеточных доменах (рис. 6-16).
6.2.2. Мембранные белки могут быть растворены и очищены в растворах детергентов [9]
Как правило, трансмембранные белки (и некоторые другие, прочно связанные с мембраной) могут быть солюбилизированы только с
помощью реагентов, разрушающих гидрофобные взаимодействия и, в конечном счете, бислой. Наиболее успешно это можно сделать, используя
детергенты - небольшие амфипатические молекулы, стремящиеся образовать в воде мицеллы (рис. 6-17). При смешивании детергента с мембраной
гидрофобные концы его молекул связываются с гидрофобными участками мембранных белков, вытесняя оттуда молекулы липидов. Поскольку
противоположный конец молекулы детергента полярный, такое связывание приводит к тому, что мембранные белки переходят в раствор в виде
комплексов с детергентом. Некоторые прочно связанные с белками молекулы липидов также остаются в этих комплексах (рис. 6-18). Полярные
концы детергентов могут быть либо заряженными (ионными), как в додецилсулъфате натрия (ДСН), либо незаряженными (неионными), как в
случае тритонов. Структуры этих двух используемых повсеместно детергентов изображены на рис. 6-19.
Сильным ионным детергентом типа ДСН можно солюбилизировать даже самые гидрофобные белки мембран. Это позволяет
анализировать такие белки методом электрофореза в полиакриламидном геле, содержащем ДСН. Разработка данной методики произвела
настоящую революцию в изучении мембранных белков. Детергенты такого типа разворачивают (денатурируют) полипептидную цепь белка,
внедряясь в его внутреннее «гидрофобное ядро» (см. рис. 3-22). Обычно при этом белки утрачивают активность и становятся непригодными для
исследования их функции. Тем не менее белки могут быть легко очищены в денатурированной под действием ДСН форме. В некоторых случаях
удаление детергента приводит к ренатурации и восстановлению функциональной активности.
Менее гидрофобные мембранные белки можно солюбилизировать при низких концентрациях мягкого детергента. Это позволяет
получить их если не в нативной, то по крайней мере в функционально активной форме. Если же детергент затем удалить в отсутствие
фосфолипидов, то мембранные белки обычно агрегируют и выпадают в осадок (рис. 6-20). Однако если очищенные белки смешать с
фосфолипидами до удаления детергента, то белки в активной форме обычно встроятся в липидный бислой, формируемый молекулами
фосфолипидов (рис. 6-21). Таким образом можно реконструировать функционально активные системы мембранных белков из очищенных
компонентов. Это один из возможных подходов к изучению их функциональной активности. Например, если удается показать, что очищенный
белок перекачивает ионы через
Рис. 6-17. Поперечный разрез мицеллы, образовавшейся в воде из молекул детергента. Молекулы детергента являются амфипатическими,
поскольку имеют полярный и неполярный концы.
Рис. 6-18. Солюбилизация мембранных белков с помощью детергента. Детергент разрушает липидный бислой, в результате чего белки
оказываются в растворе в виде комплексов с молекулами липидов и детергента. Фосфолипиды мембран также солюбилизируются с помощью
детергента.
363
Рис. 6-19. Структуры молекул двух широко распространенных детергентов: додецилсульфата натрия (ДСН, анионного детергента) и тритона Х-100
(неионного детергента). Заметьте, что участок в скобках повторяется семь раз.
синтетический липидный бислой в отсутствие других белков, можно со всей определенностью сказать, что это ионный насос. Более того,
контролируя в экспериментах условия реакции (доступность белков для АТР и ионов), можно выяснить детальный механизм действия этого белка
(см. разд. 6.4.4).
6-12
6.2.3. Поверхность мембранных белков, обращенную к цитоплазме, можно изучать на примере «теней» эритроцитов [10]
О плазматической мембране эритроцитов человека (рис. 6-22) известно гораздо больше, чем о любой другой мембране эукариотической
клетки. Такая ситуация сложилась вследствие ряда причин. 1) Эритроциты можно получать в большом количестве (например, из банков крови).
При этом они практически не загрязнены клетками других типов. 2) Поскольку эритроциты не имеют ядра и внутренних органелл, их
плазматическая мембрана - это единственная мембрана данных клеток и ее можно выделить в чистом виде, без примеси внутренних мембран.
Между тем при получении плазматической мембраны из клеток других типов, в которых она обычно составляет менее 5% от массы всех мембран
(см. табл. 8-2), это представляет серьезную проблему. 3) Мембраны эритроцитов, или «тени» (пустые оболочки), легко получить, поместив клетки в
гипотетический солевой раствор. Концентрация соли в таком растворе ниже, чем в клетке, поэтому вода устремляется внутрь эритроцитов,
заставляя их разбухать и лопаться (лизис), высвобождая гемоглобин (главный немембранный белок). 4) Мембранные «тени» можно изучать как в
поврежденном виде (в этом случае реагенты взаимодействуют с молекулами на обеих сторонах мембраны), так и после самопроизвольного
восстановления их целостности, когда водорастворимые реагенты не могут проникать во внутреннее пространство. Кроме того, из теней
эритроцитов можно получить замкнутые, вывернутые наизнанку пузырьки (рис. 6-23); это дает возможность изучать независимо друг от друга
внешнюю и внутреннюю (цитоплазматическую) стороны мембраны. Использование теней эритроцитов с разрывами и без разрывов впервые
позволило установить, что некоторые мембранные белки пронизывают липидный бислой (см. ниже), и что состав липидов на двух сторонах бислоя
различен. Как и в большинстве основных принципов, первоначально установленных при изучении мембран эритроцитов, эти факты постепенно
были подтверждены и при изучении мембран ядерных клеток.
Характер расположения в мембране того или иного белка можно определить несколькими способами. Один из них основан на том, что
меченные (флуоресцентными красителями или радиоактивными изотопами) водорастворимые реагенты не способны проникать через мембрану и
поэтому ковалентно связываются со специфическими группами только на ее наружной стороне. После этого мембраны растворяют, белки
разделяют методом электрофореза в полиакриламидном геле, а меченые белки идентифицируют либо по радиоактивности (радиоавтография гелей),
либо по флуоресценции в ультрафиолетовом свете. Используя такое направленное мечение, можно определить, как конкретный белок (полоса в
геле) ориентирован в мембране: если он метится одновременно и на внешней стороне (вместе с нативными клетками и тенями без разрывов), и на
цитоплазматической стороне (вместе с замкнутыми вывернутыми наизнанку пузырьками), то это, несомненно, трансмембранный белок.
Альтернативный подход состоит в обработке либо наружной, либо внутренней поверхности мембраны не проникающими через нее
протеолитическими ферментами: если какой-
364
Рис. 6-20. Схема, показывающая, что при удалении детергента из солюбилизированных с его помощью мембранных белков, почти не защищенные
от контактов с водой гидрофобные участки на поверхности белков стремятся взаимодействовать друг с другом, в результате чего образуются
большие агрегаты белков, осаждающиеся из раствора.
Рис. 6-21. Солюбилизация, очистка и реконструкция функциональных молекул (Na
+
+ К
+
)-АТРазы в фосфолипидных пузырьках (Na
+
+ К
+
)-АТРаза
- это анионный насос, присутствующий в плазматических мембранах большинства животных клеток. Он использует энергию гидролиза АТР для
перекачки ионов Na
+
из клетки, а К
+
внутрь клетки. Реконструкция проводится в присутствии высоких концентраций Na
+
и АТР, так как АТРаза
функционирует в качестве насоса только при достаточной концентрации этих веществ внутри пузырьков. Детергент удаляется продолжительным
диализом или с помощью хроматографии.
365
Рис. 6-22. Микрофотография эритроцитов человека, полученная с помощью сканирующего электронного микроскопа. Клетки имеют
двояковогнутую форму и не содержат ядер. (С любезного разрешения Barnadette Chialley.)
Рис. 6-23. Получение теней эритроцитов с разрывами и без разрывов, а также замкнутых пузырьков с правильной ориентацией бислоя и
вывернутых наизнанку. Показано, что эритроциты разрываются только в одном месте, давая тени с единственным отверстием. Маленькие пузырьки
получаются при механическом разрушении теней. Ориентация мембран в пузырьках определяется ионными условиями во время процедуры
разрушения.
Рис. 6-24. Картина, полученная при электрофорезе белков, входящих в состав мембраны эритроцитов человека, в присутствии ДСН. Окрашивание
проводилось кумасси синим (А). Положение в геле некоторых белков (Б); полоса, соответствующая гликофорину, выделена цветом для облегчения
её идентификации вблизи полосы 3. Другие полосы в геле на рисунке опущены. Многочисленные углеводные остатки в гликофорине замедляют
движение молекул этого белка настолько, что они движутся почти так же, как значительно более крупные молекулы полосы 3. (С любезного
разрешения Ted Steck.)
либо белок частично расщепляется в обоих случаях, то он должен быть трансмембранным. Кроме того, с помощью меченых антител можно
определить, на какой стороне мембраны находится специфическая часть трансмембранного белка.
При изучении белков плазматической мембраны эритроцитов человека методом электрофореза в ПААГ в присутствии ДСН удается
идентифицировать около 15 главных белков с молекулярной массой от 15000 до 250000. Три из них - спектрин, гликофорин и так называемая
полоса 3- составляют в сумме более 60% (по весу) всех мембранных белков (рис. 6-24). Все три белка связываются с мембраной по-разному.
Поэтому мы рассмотрим данные белки в качестве примеров трех главных способов ассоциации белков с мембранами.
6-14
6.2.4. Спектрин - белок цитоскелета, нековалентно связанный с цитоплазматической стороной мембраны эритроцитов [11]
Большинство мембранных белков эритроцитов человека - это периферические мембранные белки, ассоциированные с бислоем на его
плазматической стороне. Самый распространенный из таких белков спектрин представляет собой длинную, тонкую, гибкую «палочку» длиной
около 100 нм. Его масса составляет около 25% массы мембранных белков, что соответствует 2,5 х 10
5
копий на клетку. Спектрин является важным
компонентом белковой сети (цитоскелета), поддерживающей структурную целостность и двояковогнутую форму эритроцитов (см. рис. 6-22).
Если цитоскелет экстрагировать из теней эритроцитов растворами с низкой ионной силой, мембрана фрагментируется на мелкие пузырьки.
366
Рис. 6-25. Молекулы спектрина из эритроцитов человека. А. Схематическое изображение. Б. Электронная микрофотография. Каждый гетеродимер
состоит из двух антипараллельных слегка перекрученных друг с другом, гибких полипептидных цепей, которые нековалентно взаимодействуют во
множестве точек, включая оба конца. Фосфорилированная «головка» - место, где объединяются два димера, образуя тетрамер, расположена слева.
Каждая из а и (3 цепей состоит из большого числа повторяющихся доменов, длиной 106 аминокислотных остатков. Предполагают, что каждый
домен организован группой из трех α-спиралей (не показано), связанных нерегулярными перетяжками. На (Б) показаны спектриновые молекулы,
оттененные платиной. (A-D. W. Speicher и V.Т. Marcher, Nature 311, 177-180; Б - с любезного разрешения D. М. Shotten et al., J. Моl. Biol., 131, 303-
329, 1979. Academic Press Inc. (London) Ltd.)
Молекула спектрина состоит из двух больших полипептидных цепей: α-спектрина (около 240 000 дальтон) и β-спектрина (около 220 000
даль-тон). По-видимому, каждая цепь должна быть построена из множества α-спиральных сегментов, объединенных в группы по три и связанных
между собой неспиральными участками (рис. 6-25). Такие спектриновые гетеродимеры самопроизвольно агрегируют (голова к голове), образуя
тетрамеры длиной 200 нм. Концы пяти или шести тетрамеров соединяются между собой, связываясь с короткими активными филаментами и с
другим белком (полосой 4.1), в так называемый «узловой комплекс». Таким образом, образуется гибкая сетеподобная структура на
цитоплазматической поверхности мембраны (рис. 6-26). Именно цитоскелет, в основу которого входит спектрин, позволяет эритроцитам
противостоять давлению на мембрану при прохождении через узкие капилляры. У анемичных мышей и людей с наследственной аномалией
спектрина эритроциты имеют сферическую (а не двояковогнутую) форму и повышенную хрупкость. Степень тяжести анемии прямо
пропорциональна степени недостаточности спектрина.
При связывании радиоактивно меченного спектрина с мембранами эритроцитов, из которых предварительно был удален спектрин и
некоторые другие периферические белки, удалось идентифицировать белок, ответственный за соединение спектринового цитоскелета с
плазматической мембраной. Крупный внутриклеточный белок был назван анкирином. Он связывал как β-спектрин, так и цитоплазматический
домен трансмембранного белка полосы 3 (см. рис. 6-26). Соединяя белок полосы 3 со спектрином, анкирин связывал сеть, образуемую спектрином,
с мембраной. При этом сильно уменьшалась скорость диффузии молекул белка полосы 3 в липидном бислое. Однако цитоскелет на основе
спектрина может соединяться с мембраной и по другому механизму. Было показано, что цитоскелетный белок полосы 4.1 (который
367
Рис. 6-26. Схематическое изображение (А) и электронная микрофотография (Б) цитоскелета (на основе спектрина) на цитоплазматической
поверхности мембраны эритроцитов человека. Структура, представленная на (А), вытекает главным образом из исследований взаимодействия
очищенных белков in vitro. Спектриновые димеры ассоциируют «голова к голове», образуя тетрамеры, которые объединяются с помощью коротких
актиновых филаментов (содержащих 15 мономеров) и белка полосы 4.1 (а два или три других белка не показаны), в результате чего образуется сеть.
Эта цитоскелетная сеть связана с мембраной благодаря взаимодействию спектриновых тетрамеров с молекулами белка полосы 3, но не прямо, а
через молекулы анкирина. Она может также связываться с мембраной при взаимодействии белка полосы 4.1 с молекулами гликофорина (не
показано). Электронная микрофотография демонстрирует эритроциты после фиксации и негативного контрастирования. Спектриновая сеть была
специально растянута, для того чтобы были видны отдельные детали структуры; в нормальной клетке такая сеть занимает лишь 1/10 изображенной
площади. (С любезного разрешения Т. Byers и D. Branton, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 6153-6157, 1985.)
связывает спектрин и актин) соединяется с цитоплазматическим доменом гликофорина, другого трансмембранного белка эритроцитов.
Аналогичные, но гораздо более совершенные и сложные цитоскелетные сети лежат в основе плазматических мембран ядерных клеток.
Такие сети, состоящие из кортикальных областей (или кортексов) цитоплазмы, содержат множество актиновых филаментов, которые, по-
видимому, соединены с плазматическими мембранами несколькими различными способами. В кортексе обнаружены белки, структурно
гомологичные спектрину, анкирину и белку полосы 4.1, но их организация и функции до сих пор не поняты.
6.2.5. Гликофорин пронизывает липидный бислой в виде одиночной α-спирали [11]
Гликофорин - это один из двух главных белков, выступающих не внешней поверхности эритроцитов человека. Он оказался первым
мембранным белком, для которого была определена полная аминокислотная последовательность. Гликофорин представляет собой небольшой
трансмембранный гликопротеин (131 аминокислотный остаток). Большая часть массы этого белка находится на наружной поверхности
368
мембраны, где локализован и его гидрофильный N-концевой участок. С этой областью белковой молекулы связаны 15 отдельных олигосахаридных
боковых цепей, в которых в сумме содержится около 100 сахарных остатков, что составляет примерно 60% массы молекулы гликопротеина.
Фактически подавляющую часть углеводов клеточной поверхности (включая более 90% сиаловой кислоты) и, следовательно, большую часть всех
отрицательных зарядов клеточной поверхности несут на себе молекулы гликофорина. Гидрофильные С-концевые хвосты этих молекул погружены
в цитозоль, а гидрофобный α-спиральный участок, насчитывающий приблизительно 20 аминокислотных остатков, пронизывает липидный бислой.
Несмотря на то что в клетках содержится много молекул гликофорина (более 6 х 10
5
), их функция остается неизвестной. Более того,
люди, в эритроцитах которых отсутствует большинство этих молекул, производят впечатление совершенно здоровых. Гликофорин обнаружен
только в эритроцитах, однако в структурном отношении его можно отнести к общему классу мембранных гликопротеинов, пронизывающих
липидный бислой в виде одиночной α-спирали (см. пример 1 на рис. 6-14 и рис. 6-16). Различные рецепторы на поверхности клеток принадлежат
именно к этому классу белков.
6-14
6.2.6. Полоса 3 из мембраны эритроцитов человека представляет собой белок, транспортирующий анионы [13]
О белке полосы 3 известно (в отличие от гликофорина), что он играет важную роль в функционировании клетки. Этот белок называется
полосой 3, поскольку при электрофорезе в ПААГ в присутствии ДСН он занимает соответствующее положение относительно других белков (см.
рис. 6-24). Как и гликофорин, полоса 3 является трансмембранным белком. Однако в отличие от него этот белок имеет глобулярную конформацию,
а его полипептидная цепь (длиной около 930 аминокислотных остатков) пересекает бислой по крайней мере 10 раз. Каждый эритроцит содержит
около 10
6
молекул белка полосы 3, которые, по-видимому, образуют в мембране димеры и, возможно, тетрамеры.
Основная функция эритроцитов, как известно, заключается в переносе О
2
из легких ко всем тканям и СО
2
из тканей к легким. Белок
полосы 3 принимает участие в этом обмене. Находясь в легких, эритроциты избавляются от СО
2
, аккумулированного в тканях, путем замены ионов
НСО
3
-
на С1
-
. В мембране есть специальный анионный транспортный белок для осуществления данного процесса. Газообмен можно заблокировать
специфическим ингибитором, связывающимся с транспортным белком. При использовании ингибиторов, меченных радиоактивными изотопами,
этот анионный транспортный белок был идентифицирован. Им оказался белок полосы 3. Совсем недавно процесс анионного транспорта был
реконструирован in vitro с использованием очищенного белка полосы 3, встроенного в фосфолипидные пузырьки. Очень похожие анионные
транспортные белки были обнаружены и во многих других ядерных клетках, где они помогают контролировать внутриклеточный рН.
Белок полосы 3 можно зарегистрировать в виде внутримембранных частиц с помощью электронной микроскопии в сочетании с
замораживанием - скалыванием. В этом случае клетки замораживают в жидком азоте и полученный кусочек льда раскалывают острым ножом.
Плоскость скола обычно проходит через гидрофобную сердцевину мембранного бислоя, разделяя его на два монослоя. Затем на образовавшиеся
поверхности напыляют платину и рассматривают платиновые реплики
Рис. 6-27. Схема, показывающая, как с помощью электронной микроскопии образцов, приготовленных методом замораживания - скалывания,
можно получить изображения внутренней гидрофобной поверхности цитоплазматической (или протоплазматической) половины бислоя
(называемой Р-поверхностью) и наружной половины бислоя (называемой Е-поверхностью). После показанного здесь процесса скалывания
открытые поверхности сколов оттеняют платиной и углеродом, органические вещества удаляют, а полученную платиновую реплику
рассматривают в электронный микроскоп (см. также рис. 4-23).
369
Рис. 6-28. Электронная микрофотография скола эритроцитов человека. Обратите внимание, что плотность внутримембранных частиц на
цитоплазматической (Р) поверхности выше, чем на наружной (Е). (С любезного разрешения L. Engstrom и D. Branton.)
в электронный микроскоп. С помощью этой методики открываются (рис. 6-27) две различные гидрофобные внутренние поверхности:
цитоплазматической (или протоплазматической) половины бислоя (Р-поверхность) и внешней половины бислоя (Е-поверхность, от англ. external).
Мембраны человеческих эритроцитов в таких препаратах выглядят усеянными относительно гомогенными по размеру (7.5 нм в диаметре)
внутримембранными частицами. Как оказалось, их больше на Р-поверхности, чем на Е-поверхности (рис. 6-28). По-видимому, это главным образом
белки полосы 3, поскольку такие же частицы обнаружены при скалывании синтетических липидных бислоев, реконструированных вместе с белком
полосы 3. Рис. 6-29 убеждает нас в том, что именно молекулы белка полосы 3, а не молекулы гликофорина, видны на электронных
микрофотографиях мембран эритроцитов, полученных с помощью метода замораживания - скалывания. Ведь нетрудно себе представить, каким
образом трансмембранный белок, такой, например, как белок полосы 3, основная масса которого расположена в пределах липидного бислоя, может
осуществлять пассивный транспорт полярных молекул через неполярный бислой. Ясно, что белок полосы 3 (или его
Рис. 6-29. Схема, показывающая, что может произойти с молекулами гликофорина и белка полосы 3 в мембранах эритроцитов человека во время
процедуры замораживания - скалывания. При расщеплении липидного бислоя из замороженного монослоя выдергивается либо внутренняя, либо
внешняя половина трансмембранного белка. Преимущественно белки остаются на той половине, с которой ассоциирована более крупная часть
белковой молекулы. Поэтому молекулы белка полосы 3 обычно остаются на внутренней (Р) поверхности скола. Поскольку при этом над
поверхностью скола экспонирована достаточно большая часть белка, они видны на микрофотографиях в виде внутримембранных частиц.
Молекулы гликофорина обычно остаются на внешней (Е) поверхности скола, но их экспонированных цитоплазматических хвостов не хватает для
того, чтобы создать изображение каких-либо четко различимых частиц.
370
димер либо тетрамер) способен обеспечить трансмембранный гидрофильный проход, по которому ионы С
-
и HCO
3
-
переносятся без контакта с
гидрофобным окружением липидного бислоя (см. рис. 6-43, А). Маловероятно, что подобный транспорт может осуществлять молекула
гликофорина, пронизывающая бислой в виде простой α-спирали. Для того чтобы понять механизм функционирования мембранных транспортных
белков, необходима точная информация об их трехмерной структуре в составе бислоя. Первым транспортным белком, для которого подобные
детали стали известны, оказался бактериородопсин - белок, работающий как фотоактивируемый протонный (Н
+
) насос в плазматической мембране
некоторых бактерий. Структура бактериородопсина аналогична структуре других мембранных белков. Этот белок заслуживает того, чтобы
остановится на нем поподробнее.
6.2.7. Бактериородопсин - это протонный насос, пронизывающий бислой в виде семи α-спиралей [14]
«Пурпурная мембрана» бактерий Holobacterium halobium - это четко очерченный участок (пятно) неправильной формы на
плазматической мембране (рис. 6-30), которая содержит молекулы одного белка - бактериородопсина, В каждой молекуле имеется одна
поглощающая свет простетическая группа, или хромофор (называемый ретиналем), родственная витамину А и идентичная хромофору,
обнаруженному в родопсине палочек сетчатки глаза у позвоночных (см. разд. 19.6.6). Ретиналь ковалентно связан с боковой цепью лизина в белке.
При активации одним квантом света возбужденный хромофор вызывает конформационные изменения в белке, в результате чего два протона
переносятся с внутренней поверхности клетки на наружную. Вследствие такого переноса в клетке создается градиент концентрации протонов и
градиент электрического потенциала, которые в свою очередь обусловливают синтез АТР с помощью второго белка клеточной плазматической
мембраны.
Молекулы родопсина образуют в клеточной мембране плоскую кристаллическую решетку, подобную двумерному кристаллу. Сочетание
методов электронной микроскопии низкой интенсивности и малоуглового рассеяния электронов позволило определить трехмерную структуру
белка и его ориентацию в мембране с разрешением 0,7 нм. Последний метод аналогичен рентгеноструктурному анализу, который используется для
получения трехмерных кристаллов растворимых белков. Изучение бактериородопсина показало, что его молекула состоит из семи α-спиралей
(каждая из которых содержит около 25 аминокислотных остатков), плотно упакованных друг с другом (рис. 6-31). Эти спирали пересекают
линейный бислой примерно под прямым углом к плоскости мембраны. Весьма возможно, что протоны проходят через мембрану при участии
хромофора по сопряженной системе боковых цепей α-спиралей, однако детальные механизмы этого процесса еще неизвестны.
Бактериородопсин относится к семейству мембранных белков, обладающих сходной структурой, но различными функциями. Например,
рецептор света - белок родопсин - в палочках сетчатки глаза позвоночных и некоторые другие белки-рецепторы клеточной поверхности,
связывающие специфические гормоны, также уложены в виде семи трансмембранных α-спиралей. Эти белки функционируют скорее как
переносчики сигнала, чем как транспортные белки, поскольку каждый из них в ответ на внешний сигнал активирует другой белок плазматической
мембраны, который генерирует химический сигнал в цитозоле.
Для полного понимания механизмов функционирования бактериородопсина необходимо определить точное положение всех его атомов
Рис. 6-30. Схематическое изображение бактерии Halobacterium halobiит, показывающее пятна пурпурной мембраны, содержащей
молекулы бактериородопсина. У этих бактерий, живущих в солнечных озерах и получающих много солнечного света, в процессе эволюции
появились разнообразные белки, активируемые светом, в том числе и бактериородопсин - фотоактивируемый протонный насос плазматической
мембраны.