Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора
биологических наук. — Кольцово, ГНЦ вирусологии и биотехнологии
«Вектор», 2007. — 47 с.
Специальность 03.00.03 - молекулярная биология, 03.00.06 -
вирусология
Научный консультант д.б.н., профессор Ильичёв А.А.
Целью настоящей работы являлась разработка и оптимизация методов получения рекомбинантных антител, направленных к вирусным патогенам и, прежде всего, особо опасным вирусам, патогенным для человека.
Научная новизна результатов исследования Впервые сконструирована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека из периферических лимфоцитов доноров, иммунизированных вирусом осповакцины. Впервые из сконструированной иммунной библиотеки и из имеющейся синтетической библиотеки отобраны одноцепочечные антитела человека, направленные к жизнеспособным ортопоксвирусам – вирусу натуральной оспы, штаммы variola major и variola minor alastrim, вирусам осповакцины, оспы коров, эктромелии, а также к рекомбинантному белку prA30L вируса натуральной оспы. Впервые обнаружены рекомбинантные антитела человека, обеспечивающие различное связывание штаммов variola major и variola minor alastrim вируса натуральной оспы. Впервые выявлены одноцепочечные антитела человека, способные нейтрализовать инфекционность вирусов оспы обезьян, осповакцины, оспы коров и эктромелии. Впервые получены штаммы Escherichia coli, продуцирующие в растворимой форме одноцепочечные антитела человека sb9, s1F4, s1I6, и s2I19, подтверждена их способность связывать ортопоксвирусы. Впервые из имеющейся синтетической и сконструированной нами наивной библиотеки одноцепочечных антител отобраны одноцепочечные антитела человека, направленные к белкам вируса Эбола; созданы штаммы Escherichia coli HB2151/pHEN-4D1 и Escherichia coli HB2151/pHEN-2E3, продуцирующие антитела s4D1 и s2E3 в растворимой форме. Сконструированы полноразмерные антитела человека, направленные к ортопоксвирусам и к вирусу Эбола. Показано, что полноразмерные антитела человека, направленные к ортопоксвирусам, обладают вируснейтрализующей активностью. Сконструированы оригинальные экспрессионные вектора, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках Escherichia coli. Впервые предложено введение в С-конец молекулы одноцепочечного антитела основного вируснейтрализующего эпитопа поверхностного белка вируса гепатита В (НВs), содержащего два остатка цистеина, что обеспечивает как формирование димерной формы одноцепочечных антител, так и возможность детекции этих антител с помощью МКА, направленных к основной антигенной детерминанте НВs-антигена. На основе сконструированных векторов созданы штаммы E.coli, продуцирующие мономерные и димерные одноцепочечные антитела к поверхностному гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита с уровнем продукции около 20% суммарного клеточного белка.
Практическая значимость работы. В результате работы созданы оригинальные генетические конструкции, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных мономерных и димерных антител в клетках E.coli. Отработаны способы наработки и очистки одноцепочечных антител, что может быть использовано для масштабирования наработки одноцепочечных антител к различным антигенам. Сконструирована и охарактеризована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека, обогащенная антителами к ортопоксвирусам. Данная библиотека является источником вариабельных доменов иммуноглобулинов человека, направленных к ортопоксвирусам, и предназначена для поиска специфических антител и создания на их основе терапевтических препаратов для лечения ортопоксвирусных инфекций и профилактики поствакцинальных осложнений, а также для разработки диагностических тест-систем. Сконструирована и охарактеризована наивная библиотека одноцепочечных антител человека, которая является источником вариабельных доменов антител человека к широкому спектру антигенов. Получено одноцепочечное антитело человека к фактору некроза опухоли, обладающее константой аффинности около 4×108М-1 Это дает основание рассматривать данное антитело перспективным для терапии вирусных геморрагических лихорадок и ряда аутоиммунных заболеваний. Сконструированы полноразмерные антитела человека к ортопоксвирусам, обладающие вируснейтрализующей активностью. Эти антитела являются перспективными для разработки на их основе препаратов нового поколения для профилактики и терапии поствакцинальных осложнений.
Научный консультант д.б.н., профессор Ильичёв А.А.
Целью настоящей работы являлась разработка и оптимизация методов получения рекомбинантных антител, направленных к вирусным патогенам и, прежде всего, особо опасным вирусам, патогенным для человека.
Научная новизна результатов исследования Впервые сконструирована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека из периферических лимфоцитов доноров, иммунизированных вирусом осповакцины. Впервые из сконструированной иммунной библиотеки и из имеющейся синтетической библиотеки отобраны одноцепочечные антитела человека, направленные к жизнеспособным ортопоксвирусам – вирусу натуральной оспы, штаммы variola major и variola minor alastrim, вирусам осповакцины, оспы коров, эктромелии, а также к рекомбинантному белку prA30L вируса натуральной оспы. Впервые обнаружены рекомбинантные антитела человека, обеспечивающие различное связывание штаммов variola major и variola minor alastrim вируса натуральной оспы. Впервые выявлены одноцепочечные антитела человека, способные нейтрализовать инфекционность вирусов оспы обезьян, осповакцины, оспы коров и эктромелии. Впервые получены штаммы Escherichia coli, продуцирующие в растворимой форме одноцепочечные антитела человека sb9, s1F4, s1I6, и s2I19, подтверждена их способность связывать ортопоксвирусы. Впервые из имеющейся синтетической и сконструированной нами наивной библиотеки одноцепочечных антител отобраны одноцепочечные антитела человека, направленные к белкам вируса Эбола; созданы штаммы Escherichia coli HB2151/pHEN-4D1 и Escherichia coli HB2151/pHEN-2E3, продуцирующие антитела s4D1 и s2E3 в растворимой форме. Сконструированы полноразмерные антитела человека, направленные к ортопоксвирусам и к вирусу Эбола. Показано, что полноразмерные антитела человека, направленные к ортопоксвирусам, обладают вируснейтрализующей активностью. Сконструированы оригинальные экспрессионные вектора, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных антител в клетках Escherichia coli. Впервые предложено введение в С-конец молекулы одноцепочечного антитела основного вируснейтрализующего эпитопа поверхностного белка вируса гепатита В (НВs), содержащего два остатка цистеина, что обеспечивает как формирование димерной формы одноцепочечных антител, так и возможность детекции этих антител с помощью МКА, направленных к основной антигенной детерминанте НВs-антигена. На основе сконструированных векторов созданы штаммы E.coli, продуцирующие мономерные и димерные одноцепочечные антитела к поверхностному гликопротеину Е вируса клещевого энцефалита с уровнем продукции около 20% суммарного клеточного белка.
Практическая значимость работы. В результате работы созданы оригинальные генетические конструкции, обеспечивающие высокий уровень продукции одноцепочечных мономерных и димерных антител в клетках E.coli. Отработаны способы наработки и очистки одноцепочечных антител, что может быть использовано для масштабирования наработки одноцепочечных антител к различным антигенам. Сконструирована и охарактеризована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека, обогащенная антителами к ортопоксвирусам. Данная библиотека является источником вариабельных доменов иммуноглобулинов человека, направленных к ортопоксвирусам, и предназначена для поиска специфических антител и создания на их основе терапевтических препаратов для лечения ортопоксвирусных инфекций и профилактики поствакцинальных осложнений, а также для разработки диагностических тест-систем. Сконструирована и охарактеризована наивная библиотека одноцепочечных антител человека, которая является источником вариабельных доменов антител человека к широкому спектру антигенов. Получено одноцепочечное антитело человека к фактору некроза опухоли, обладающее константой аффинности около 4×108М-1 Это дает основание рассматривать данное антитело перспективным для терапии вирусных геморрагических лихорадок и ряда аутоиммунных заболеваний. Сконструированы полноразмерные антитела человека к ортопоксвирусам, обладающие вируснейтрализующей активностью. Эти антитела являются перспективными для разработки на их основе препаратов нового поколения для профилактики и терапии поствакцинальных осложнений.