Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук.
- Москва, МИТХТ им. М.В. Ломоносова, ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А.
Овчинникова РАН, ЗАО "Мастерклон", 2014. - 133 с.
Специальность 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Научный руководитель: доктор химических наук профессор, академик РАН Швец В.И.
Цель исследования заключалась в создании новой методики получения активной фармацевтической субстанции пэгилированной формы рекомбинантного человеческого Г-КСФ, обладающей повышенной стабильностью in vivo, с помощью модифицированного моно-метил-ПЭГ-альдегида с молекулярной массой 21.5 кДа по α-аминогруппе N-концевого остатка.
Научная новизна полученных результатов В результате изучения реакции пэгилирования рчГ-КСФ и дальнейшей оптимизации этого процесса проведен ряд экспериментов по исследованию факторов, влияющих на ход данной реакции, и впервые доказано, что на процесс конъюгации белков (на примере рчГ-КСФ) с модифицированным ПЭГ влияет состав буферной системы. В данном случае установлено, что использование буферной системы, содержащей цитрат-анион (цитрат натрия) приводило к наибольшей эффективности процесса селективной модификации рчГ-КСФ с ПЭГ. Также впервые установлено, что существуют диапазоны оптимальных концентраций взятого в реакцию присоединения рчГ-КСФ, в рамках которых выход конъюгата ПЭГ-Г-КСФ значительно увеличивается, а содержание неспецифически связанных конъюгатов ПЭГ сокращается, что связано с механизмом взаимодействия ПЭГ с белками, который заключается в стерическом исключении молекулы ПЭГ из «белковой зоны» за счет связывания воды полимером.
Практическая значимость полученных результатов
1. Разработаны условия проведения конъюгации концентрированного рчГ-КСФ с ПЭГ, позволяющие проводить данную стадию в минимальном объеме, что делает процесс более технологичным;
2. Минимизирован расход дорогостоящего конъюгационного агента, ПЭГ, позволяя сделать стадию модификации белка более экономичной и таким образом снизить себестоимость препарата ПЭГ-Г-КСФ;
3. Исследовано влияние различных факторов на ход реакции ковалентного присоединения ПЭГ с рчГ-КСФ, сокращено содержание примесей, образующихся в ходе данной реакции, что упростило схему дальнейшей очистки препарата;
4. Разработана унифицированная схема очистки ПЭГ-Г-КСФ на основе существующей схемы для рчГ-КСФ, приемлемая для двух препаратов (рчГ-КСФ и ПЭГ-Г-КСФ);
5. Полученный конечный препарат ПЭГ-Г-КСФ прошел доклинические исследования in vitro, и было установлено, что уровень его биологической активности не уступает уровню активности препарата рчГ-КСФ, что позволяет ввести на российский фармацевтический рынок замену дорогостоящему импортному аналогу «Неуластим».
Специальность 03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
Научный руководитель: доктор химических наук профессор, академик РАН Швец В.И.
Цель исследования заключалась в создании новой методики получения активной фармацевтической субстанции пэгилированной формы рекомбинантного человеческого Г-КСФ, обладающей повышенной стабильностью in vivo, с помощью модифицированного моно-метил-ПЭГ-альдегида с молекулярной массой 21.5 кДа по α-аминогруппе N-концевого остатка.
Научная новизна полученных результатов В результате изучения реакции пэгилирования рчГ-КСФ и дальнейшей оптимизации этого процесса проведен ряд экспериментов по исследованию факторов, влияющих на ход данной реакции, и впервые доказано, что на процесс конъюгации белков (на примере рчГ-КСФ) с модифицированным ПЭГ влияет состав буферной системы. В данном случае установлено, что использование буферной системы, содержащей цитрат-анион (цитрат натрия) приводило к наибольшей эффективности процесса селективной модификации рчГ-КСФ с ПЭГ. Также впервые установлено, что существуют диапазоны оптимальных концентраций взятого в реакцию присоединения рчГ-КСФ, в рамках которых выход конъюгата ПЭГ-Г-КСФ значительно увеличивается, а содержание неспецифически связанных конъюгатов ПЭГ сокращается, что связано с механизмом взаимодействия ПЭГ с белками, который заключается в стерическом исключении молекулы ПЭГ из «белковой зоны» за счет связывания воды полимером.
Практическая значимость полученных результатов
1. Разработаны условия проведения конъюгации концентрированного рчГ-КСФ с ПЭГ, позволяющие проводить данную стадию в минимальном объеме, что делает процесс более технологичным;
2. Минимизирован расход дорогостоящего конъюгационного агента, ПЭГ, позволяя сделать стадию модификации белка более экономичной и таким образом снизить себестоимость препарата ПЭГ-Г-КСФ;
3. Исследовано влияние различных факторов на ход реакции ковалентного присоединения ПЭГ с рчГ-КСФ, сокращено содержание примесей, образующихся в ходе данной реакции, что упростило схему дальнейшей очистки препарата;
4. Разработана унифицированная схема очистки ПЭГ-Г-КСФ на основе существующей схемы для рчГ-КСФ, приемлемая для двух препаратов (рчГ-КСФ и ПЭГ-Г-КСФ);
5. Полученный конечный препарат ПЭГ-Г-КСФ прошел доклинические исследования in vitro, и было установлено, что уровень его биологической активности не уступает уровню активности препарата рчГ-КСФ, что позволяет ввести на российский фармацевтический рынок замену дорогостоящему импортному аналогу «Неуластим».