Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук.
— Москва, МТУ, ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова
РАН, 2016. - 130 с.
Специальность 03.01.06 - Биотехнология (в том числе
бионанотехнологии)
Целью данной работы является разработка и внедрение метода ПЦР для
анализа остаточного содержания ДНК штаммов-продуцентов в активных
фармацевтических субстанциях, а также внедрение и валидация
методики ИФА для анализа остаточных белков штамма-продуцента в
биофармацевтических субстанциях.
Научная новизна работы
Ра зработан высокочувствительный и специфичный метод ПЦР в реальном времени с использованием праймеров к фрагменту гена 16 S РНК штаммов-продуцентов генно-инженерного инсулина и гистона Н1.3 человеческого с применением интеркалирующего красителя SYBR GREEN I и технологии на основе флуоресцентно меченых меченых проб TaqMan. Рассматриваемый метод имеет несомненное преимущество в сравнении с ПЦР реальном времени при использовании праймеров к плазмидной ДНК -продуцента. Праймеры к плазмидной ДНК не позволяют оценить реальное содержание остаточной тотальной ДНК, поскольку количество геномной ДНК штамма в АФС минимум на порядок превышает количество плазмидной ДНК. Это достоверно подтверждено настоящими исследованиями.
Показана возможность успешного применения нестандартного набора для ИФА при определении проинсулина в АФС генно-инженерного инсулина человека. Вышеуказанный набор предназначен для определения проинсулина в плазме крови человека. Преимущество данного набора перед набором прямого назначения, то есть разработанным именно для определения проинсулина в АФС инсулина, достоверно подтверждено сравнением характеристик, полученных при валидационных испытаниях для обоих наборов.
Практическая значимость работы.
Разработанный высокочувствительный и специфичный метод ПЦР в реальном времени, а также метод ИФА, с применением набора для определения содержания проинсулина в плазме крови, внедрены в технологическое производство и используются для выявления остаточных ДНК и белков в АФС. Методы применяют при рутинном анализе в контроле качества при производстве активной фармацевтической субстанции инсулина и гистона Н1.3, а также при оценке рисков и при проведении валидационных испытаний на ОБП ИБХ РАН. На основе результатов данных исследований была разработана производственная документация, стандартные операционные процедуры для методик ПЦР, рвПЦР и ИФА.
Научная новизна работы
Ра зработан высокочувствительный и специфичный метод ПЦР в реальном времени с использованием праймеров к фрагменту гена 16 S РНК штаммов-продуцентов генно-инженерного инсулина и гистона Н1.3 человеческого с применением интеркалирующего красителя SYBR GREEN I и технологии на основе флуоресцентно меченых меченых проб TaqMan. Рассматриваемый метод имеет несомненное преимущество в сравнении с ПЦР реальном времени при использовании праймеров к плазмидной ДНК -продуцента. Праймеры к плазмидной ДНК не позволяют оценить реальное содержание остаточной тотальной ДНК, поскольку количество геномной ДНК штамма в АФС минимум на порядок превышает количество плазмидной ДНК. Это достоверно подтверждено настоящими исследованиями.
Показана возможность успешного применения нестандартного набора для ИФА при определении проинсулина в АФС генно-инженерного инсулина человека. Вышеуказанный набор предназначен для определения проинсулина в плазме крови человека. Преимущество данного набора перед набором прямого назначения, то есть разработанным именно для определения проинсулина в АФС инсулина, достоверно подтверждено сравнением характеристик, полученных при валидационных испытаниях для обоих наборов.
Практическая значимость работы.
Разработанный высокочувствительный и специфичный метод ПЦР в реальном времени, а также метод ИФА, с применением набора для определения содержания проинсулина в плазме крови, внедрены в технологическое производство и используются для выявления остаточных ДНК и белков в АФС. Методы применяют при рутинном анализе в контроле качества при производстве активной фармацевтической субстанции инсулина и гистона Н1.3, а также при оценке рисков и при проведении валидационных испытаний на ОБП ИБХ РАН. На основе результатов данных исследований была разработана производственная документация, стандартные операционные процедуры для методик ПЦР, рвПЦР и ИФА.