Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора
биологических наук: 03.01.07 – молекулярная генетика. —
Институт
Биологии гена РАН. — Москва, 2011. — 50 с. Научный консультант: академик РАН, доктор биологических наук, профессор Георгиев П.Г. Основной целью работы являлось описание и изучение новых свойств инсулятора Su(Hw) из ретротранспозона МДГ4 и эндогенного Su(Hw)-зависимого инсулятора в геноме Drosophila melanogaster, сравнение их структуры и функций. Кроме того, целью работы являлось изучение роли отдельных белков, входящих в Su(Hw)-зависимый инсуляторный комплекс, в его функционировании.
Научная новизна и практическая ценность работы:
В представленной работе впервые было показано, что два находящихся на расстоянии Su(Hw) инсулятора способны взаимодействовать друг с другом, причем результат такого взаимодействия зависит от взаимного расположения инсуляторов. Инсулятор Su(Hw), встроенный между двумя FRT сайтами, блокирует цис- и транс- взаимодействия между Flp-димерами, т.е. взаимодействие между не участвующими в регуляции транскрипции белковыми комплексами, как в соматических, так и в половых клетках. Полученные результаты заставляют пересмотреть широко распространенные структурные и транскрипционные модели, объясняющие механизм
действия инсуляторов, и позволяют рассматривать инсулятор не только как узкоспециализированный элемент, блокирующий взаимодействие между белковыми комплексами энхансера и промотора.
Кроме того, генетическими методами было показано, что инсулятор Su(Hw) обладает свойствами активатора транскрипции. Он может активировать ослабленный промотор гена yellow, находящийся на расстоянии 5 т.п.н. Для стимуляции транскрипции на больших дистанциях необходим белок Su(Hw). Основную роль в стимуляции транскрипции играет ДНК-связывающий домен этого белка и прилегающие к нему районы. Между генами yellow и achaete AS-С генного комплекса был обнаружен новый функциональный Su(Hw)-зависимый инсулятор.
В данной работе была подробно изучена структура одного из основных компонентов инсуляторного комплекса - белка Mod(mdg4). Впервые было показано наличие в составе белка второго домена, отвечающего за его димеризацию.
Было доказано, что димеризация белка Mod(mdg4) не является достаточным условием для его функционирования в составе инсуляторного комплекса. Установлено, что делеция глутамин-богатого домена приводит к отсутствию белка в ядре, но это не сказывается на инсуляции.
Было установлено, что делеция любого из сайтов, необходимых для правильной локализации белка Mod(mdg4)-67.2 в ядре, приводит к тому, что видимые в ядре «инсуляторные тельца» перемещаются из ядра клетки в цитоплазму. При этом белок, остающийся в ядре,
полностью функционален и способен к инсуляции. Ранее было показано, что белок Mod(mdg4)-67.2 подвергается особой модификации - сумолированию. Были получены данные, свидетельствующие, что именно сумолирование белка Mod(mdg4)-67.2 отвечает за образование «инсуляторных телец». При этом нарушение сайтов сумолирования никак не влияет на инсуляцию.
Полученные данные опровергают общепринятую модель, гласящую, что видимые в ядре «инсуляторные тельца», включающие белки инсуляторного комплекса Su(Hw), Mod(mdg4)-67.2 и CP190 являются активно функционирующими инсуляторами. На основании результатов работы была предложена новая модель формирования и функционирования «инсуляторных телец».
Таким образом, представленная работа имеет большое фундаментальное значение для развития современной молекулярной генетики.
При работе с культурами клеток эукариот, для анализа взаимодействий между находящимися на большом расстоянии белковыми комплексами широко используется метод 3С (Chromosome Conformation Capture). К сожалению, этот метод не работает в таком сложном организме как Drosophila. Полученные при изучении ориентационно - зависимого взаимодействия инсуляторов результаты показывают, что метод, основанный на анализе Flp-зависимой рекомбинации, может служить хорошим инструментом для анализа in vivo взаимодействий удаленных белковых комплексов, образующихся на инсуляторах, энхансерах или промоторах.
Кроме того, в настоящее время в связи с быстрым развитием биотехнологической промышленности, изучение структуры и механизмов функционирования инсуляторов приобретает ярко выраженное практическое значение. Барьерные свойства этих регуляторных элементов все чаще используются при создании различных геноинженерных конструкций, применяемых для продуцирования животных и растительных белков или же используемых в генотерапии ряда заболеваний. Однако для долговременного и безопасного функционирования трансгена в эукариотическом геноме необходимо учитывать все свойства регуляторных элементов, включенных в его состав. Поэтому, зависимость свойств регуляторных элементов, в том числе инсуляторов, от геномного окружения и их способность взаимодействовать между собой на больших дистанциях, безусловно, должны приниматься во внимание при планировании и оценке результатов экспериментов по эктопической интеграции генетического материала в геномы различных организмов.
Биологии гена РАН. — Москва, 2011. — 50 с. Научный консультант: академик РАН, доктор биологических наук, профессор Георгиев П.Г. Основной целью работы являлось описание и изучение новых свойств инсулятора Su(Hw) из ретротранспозона МДГ4 и эндогенного Su(Hw)-зависимого инсулятора в геноме Drosophila melanogaster, сравнение их структуры и функций. Кроме того, целью работы являлось изучение роли отдельных белков, входящих в Su(Hw)-зависимый инсуляторный комплекс, в его функционировании.
Научная новизна и практическая ценность работы:
В представленной работе впервые было показано, что два находящихся на расстоянии Su(Hw) инсулятора способны взаимодействовать друг с другом, причем результат такого взаимодействия зависит от взаимного расположения инсуляторов. Инсулятор Su(Hw), встроенный между двумя FRT сайтами, блокирует цис- и транс- взаимодействия между Flp-димерами, т.е. взаимодействие между не участвующими в регуляции транскрипции белковыми комплексами, как в соматических, так и в половых клетках. Полученные результаты заставляют пересмотреть широко распространенные структурные и транскрипционные модели, объясняющие механизм
действия инсуляторов, и позволяют рассматривать инсулятор не только как узкоспециализированный элемент, блокирующий взаимодействие между белковыми комплексами энхансера и промотора.
Кроме того, генетическими методами было показано, что инсулятор Su(Hw) обладает свойствами активатора транскрипции. Он может активировать ослабленный промотор гена yellow, находящийся на расстоянии 5 т.п.н. Для стимуляции транскрипции на больших дистанциях необходим белок Su(Hw). Основную роль в стимуляции транскрипции играет ДНК-связывающий домен этого белка и прилегающие к нему районы. Между генами yellow и achaete AS-С генного комплекса был обнаружен новый функциональный Su(Hw)-зависимый инсулятор.
В данной работе была подробно изучена структура одного из основных компонентов инсуляторного комплекса - белка Mod(mdg4). Впервые было показано наличие в составе белка второго домена, отвечающего за его димеризацию.
Было доказано, что димеризация белка Mod(mdg4) не является достаточным условием для его функционирования в составе инсуляторного комплекса. Установлено, что делеция глутамин-богатого домена приводит к отсутствию белка в ядре, но это не сказывается на инсуляции.
Было установлено, что делеция любого из сайтов, необходимых для правильной локализации белка Mod(mdg4)-67.2 в ядре, приводит к тому, что видимые в ядре «инсуляторные тельца» перемещаются из ядра клетки в цитоплазму. При этом белок, остающийся в ядре,
полностью функционален и способен к инсуляции. Ранее было показано, что белок Mod(mdg4)-67.2 подвергается особой модификации - сумолированию. Были получены данные, свидетельствующие, что именно сумолирование белка Mod(mdg4)-67.2 отвечает за образование «инсуляторных телец». При этом нарушение сайтов сумолирования никак не влияет на инсуляцию.
Полученные данные опровергают общепринятую модель, гласящую, что видимые в ядре «инсуляторные тельца», включающие белки инсуляторного комплекса Su(Hw), Mod(mdg4)-67.2 и CP190 являются активно функционирующими инсуляторами. На основании результатов работы была предложена новая модель формирования и функционирования «инсуляторных телец».
Таким образом, представленная работа имеет большое фундаментальное значение для развития современной молекулярной генетики.
При работе с культурами клеток эукариот, для анализа взаимодействий между находящимися на большом расстоянии белковыми комплексами широко используется метод 3С (Chromosome Conformation Capture). К сожалению, этот метод не работает в таком сложном организме как Drosophila. Полученные при изучении ориентационно - зависимого взаимодействия инсуляторов результаты показывают, что метод, основанный на анализе Flp-зависимой рекомбинации, может служить хорошим инструментом для анализа in vivo взаимодействий удаленных белковых комплексов, образующихся на инсуляторах, энхансерах или промоторах.
Кроме того, в настоящее время в связи с быстрым развитием биотехнологической промышленности, изучение структуры и механизмов функционирования инсуляторов приобретает ярко выраженное практическое значение. Барьерные свойства этих регуляторных элементов все чаще используются при создании различных геноинженерных конструкций, применяемых для продуцирования животных и растительных белков или же используемых в генотерапии ряда заболеваний. Однако для долговременного и безопасного функционирования трансгена в эукариотическом геноме необходимо учитывать все свойства регуляторных элементов, включенных в его состав. Поэтому, зависимость свойств регуляторных элементов, в том числе инсуляторов, от геномного окружения и их способность взаимодействовать между собой на больших дистанциях, безусловно, должны приниматься во внимание при планировании и оценке результатов экспериментов по эктопической интеграции генетического материала в геномы различных организмов.