Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора
биологических наук: 03.00.02 – Биофизика. — Центр молекулярного
имаджинга главного госпиталя штата Массачусетс (г.
Бостон),Медицинское отделение Массачусетского Университета (г.
Вустер). — Москва, 2009. — 66 с.
Целью работы явилось развитие методических
подходов к визуализации специфической ферментативной активности и
активации факторов транскрипции в живых системах. В качестве
основных направлений работы были выбраны прикладные исследования,
целью которых являлось изучение ответа живого организма на
стимуляцию воспалительного каскада, в частности, модельное
исследование визуализации оксидоредуктазной активности при развитии
нестабильной атеромы и рака, а также активации стромы и ангиогенеза
в раковых опухолях.
Научная новизна и практическая значимость. В 1992 году нами был впервые разработан и запатентован макромолекулярный синтетический парамагнитный нанозонд (Protected Graft Copolymer, PGC), с характерной длительной циркуляцией в кровотоке и относительно узким молекулярно-массовым распределением. Этот зонд был использован для визуализации обьема крови в моделях рака и тромбоза легочных артерий, а также для одновременного определения объема и скорости кровотока в головном мозге в норме и патологии при индуцированном ишемическом инсульте. Использование PGC в сочетании с МРТ показало, что этот нанозонд позволяет определить эффективность антиангиогенных терапевтических средств на ранних стадиях испытаний на экспериментальных животных. Высокоэффективное мечение PGC радиоизотопом 99mТс дало возможность провести предварительные клинические испытания (Фаза 1А) этого зонда в качестве макромолекулярного радиоизотопного маркера для вентрикулографии, а также позволило исследовать некоторые особенности метаболизма PGC в организме человека.
Важной особенностью подобных контрастирующих веществ (зондов) является сильное изменение свойств диагностических меток в ковалентно связанной форме. В то время как релаксивность парамагнитных хелатов Gd(III) (т.е. способность катионов гадолиния к сокращению времени релаксации координированных протонов воды), связанных с PGC, возрастает в несколько раз, интенсивность флуоресценции ковалентно связанных молекул инфракрасных флуорохромов резко уменьшается. Использование этого явления в исследованиях на животных впервые позволило использовать возрастание интенсивности флуоресценции в ткани в результате деградации PGC лизосомными катепсинами для полуколичественной оценки протеолитической активности в раковых опухолях. Дальнейшие исследования на моделях рака позволило идентифицировать фракции клеток опухолей с наиболее выраженной протеолитической активностью, присутствие которых связано с повышенной инвазивностью аденокарцином.
В начале 2000-х годов нам впервые удалось показать, что каталитическую активность пероксидаз в живой ткани можно обнаруживать с помощью МРТ, при условии, если в качестве восстанавливающего субстрата были использованы парамагнитные моно- и бис- фенэтиламидные или оксииндолэтиламидные производные хелатов парамагнитного Gd(III) в качестве пероксидазо- чувствительных контрастирующих зондов. Данные производные восстанавливают окисленные формы пероксидаз с высокой эффективностью, и в результате ферментативного окисления вступают в реакции гомоолигомеризации, а также ковалентной модификации белков, и, тем самым, повышают релаксивность хелатированного гадолиния. Релаксометрические измерения показали, что МРТ сигнал возрастает преимущественно за счет удлинения корреляционного времени реориентации спинов протонов воды (р), взаимодействующих с локальным электромагнитным полем парамагнитного катиона. Данные контрастирующие зонды были использованы для визуализации трех классов оксидоредуктаз: 1) миелопероксидаз (т.е. эндогенных высокомолекулярных белков первичных секреторных гранул гранулоцитов); 2) пероксидаз растений, используемых в качестве меток для ферментативного обнаружения антител, связанных с антигенами в системах in vitro, а также in vivo; 3) тирозиназ; 4) лакказ. Миелопероксидаза (МПО) секретируется преимущественно нейтрофилами, при трансмиграции через стенку сосудов в ответ на локальную активацию эндотелиальных клеток. Активация происходит в результате воздействия различных эндогенных и экзогенных факторов, с высокой вероятностью приводящим к развитию ишемической болезни. Обнаружение миелопероксидаз в живой ткани организма при помощи неинвазивной диагностики позволяет проводить прямое обнаружение очагов воспаления в стенке кровеносных сосудов, что важно для проведения оценки нестабильности атеросклеротической бляшки. Подобная оценка нестабильности при помощи МРТ была проведена нами в живых моделях спонтанного атеросклероза и экспериментального аневризма сонных артерий. Детекция миелопероксидазной активности, проведенной на основе анализа результатов томографической визуализации ферментативной активности, в отличие от определения концентрации МПО в плазме крови, позволит различать стабильные и нестабильные атеросклеротические бляшки и определять степень риска острых сердечно- сосудистых заболеваний. Подобная же практическая направленность наших исследований на живой модели, полученной искусственно с применением катетеризации и частичной окклюзии сонной артерии кролика, позволила произвести оценку специфичности визуализации воспаления в области расширения стенки экспериментальной аневризмы. Как и в случае атеросклеротического поражения стенок сердечно-сосудистой системы, развитие нестабильности аневризм артерий головного мозга зависит от интенсивности местных воспалительных процессов. Предсказание нестабильности аневризмы на основании МРТ визуализации с применением парамагнитных субстратов миелопероксидазы важно потому, что субарахноидальное кровоизлияние из разорвавшейся аневризмы приводит к геморрагическому инсульту с летальным исходом у 55-60% пациентов.
Обнаружение ферментативной активности иммуноконъюгатов в живых системах при помощи МРТ было впервые предложено и исследовано нами в 2001 году с применением модельных систем с целью визуализации клеток, экспрессирующих маркеры клеточной поверхности, типичные для онкологической трансформации. Активность данных рецепторов (например, EGFR, т.е. рецептора эпидермального фактора роста) можно ингибировать антителами, которые препятствуют димеризации рецепторов и, как следствие, ингибируют рецептор-опосредованную передачу сигнала. Мы показали, что блокирующие химерные антитела, используемые в клинических испытаниях в качестве антипролиферативного средства при раке головы и шеи, можно ковалентно связывать с пероксидазами для визуализации рецепторположительных опухолей. Эксперименты, проведенные с помощью МРТ в живых моделях плоскоклеточной карциномы и глиомы человека у атимусных мышей и крыс, соответственно, показали, что после двухстадийного последовательного внутривенного введения конъюгатов антител и субстрата происходит не только общее возрастание МРТ сигнала (по сравнению с контрольным введением субстрата без конъюгатов), но и замедление скорости выведения парамагнитного МРТ контраста, связанное с образованием олигомеров и хелат-белковых конъюгатов.
Научная новизна и практическая значимость. В 1992 году нами был впервые разработан и запатентован макромолекулярный синтетический парамагнитный нанозонд (Protected Graft Copolymer, PGC), с характерной длительной циркуляцией в кровотоке и относительно узким молекулярно-массовым распределением. Этот зонд был использован для визуализации обьема крови в моделях рака и тромбоза легочных артерий, а также для одновременного определения объема и скорости кровотока в головном мозге в норме и патологии при индуцированном ишемическом инсульте. Использование PGC в сочетании с МРТ показало, что этот нанозонд позволяет определить эффективность антиангиогенных терапевтических средств на ранних стадиях испытаний на экспериментальных животных. Высокоэффективное мечение PGC радиоизотопом 99mТс дало возможность провести предварительные клинические испытания (Фаза 1А) этого зонда в качестве макромолекулярного радиоизотопного маркера для вентрикулографии, а также позволило исследовать некоторые особенности метаболизма PGC в организме человека.
Важной особенностью подобных контрастирующих веществ (зондов) является сильное изменение свойств диагностических меток в ковалентно связанной форме. В то время как релаксивность парамагнитных хелатов Gd(III) (т.е. способность катионов гадолиния к сокращению времени релаксации координированных протонов воды), связанных с PGC, возрастает в несколько раз, интенсивность флуоресценции ковалентно связанных молекул инфракрасных флуорохромов резко уменьшается. Использование этого явления в исследованиях на животных впервые позволило использовать возрастание интенсивности флуоресценции в ткани в результате деградации PGC лизосомными катепсинами для полуколичественной оценки протеолитической активности в раковых опухолях. Дальнейшие исследования на моделях рака позволило идентифицировать фракции клеток опухолей с наиболее выраженной протеолитической активностью, присутствие которых связано с повышенной инвазивностью аденокарцином.
В начале 2000-х годов нам впервые удалось показать, что каталитическую активность пероксидаз в живой ткани можно обнаруживать с помощью МРТ, при условии, если в качестве восстанавливающего субстрата были использованы парамагнитные моно- и бис- фенэтиламидные или оксииндолэтиламидные производные хелатов парамагнитного Gd(III) в качестве пероксидазо- чувствительных контрастирующих зондов. Данные производные восстанавливают окисленные формы пероксидаз с высокой эффективностью, и в результате ферментативного окисления вступают в реакции гомоолигомеризации, а также ковалентной модификации белков, и, тем самым, повышают релаксивность хелатированного гадолиния. Релаксометрические измерения показали, что МРТ сигнал возрастает преимущественно за счет удлинения корреляционного времени реориентации спинов протонов воды (р), взаимодействующих с локальным электромагнитным полем парамагнитного катиона. Данные контрастирующие зонды были использованы для визуализации трех классов оксидоредуктаз: 1) миелопероксидаз (т.е. эндогенных высокомолекулярных белков первичных секреторных гранул гранулоцитов); 2) пероксидаз растений, используемых в качестве меток для ферментативного обнаружения антител, связанных с антигенами в системах in vitro, а также in vivo; 3) тирозиназ; 4) лакказ. Миелопероксидаза (МПО) секретируется преимущественно нейтрофилами, при трансмиграции через стенку сосудов в ответ на локальную активацию эндотелиальных клеток. Активация происходит в результате воздействия различных эндогенных и экзогенных факторов, с высокой вероятностью приводящим к развитию ишемической болезни. Обнаружение миелопероксидаз в живой ткани организма при помощи неинвазивной диагностики позволяет проводить прямое обнаружение очагов воспаления в стенке кровеносных сосудов, что важно для проведения оценки нестабильности атеросклеротической бляшки. Подобная оценка нестабильности при помощи МРТ была проведена нами в живых моделях спонтанного атеросклероза и экспериментального аневризма сонных артерий. Детекция миелопероксидазной активности, проведенной на основе анализа результатов томографической визуализации ферментативной активности, в отличие от определения концентрации МПО в плазме крови, позволит различать стабильные и нестабильные атеросклеротические бляшки и определять степень риска острых сердечно- сосудистых заболеваний. Подобная же практическая направленность наших исследований на живой модели, полученной искусственно с применением катетеризации и частичной окклюзии сонной артерии кролика, позволила произвести оценку специфичности визуализации воспаления в области расширения стенки экспериментальной аневризмы. Как и в случае атеросклеротического поражения стенок сердечно-сосудистой системы, развитие нестабильности аневризм артерий головного мозга зависит от интенсивности местных воспалительных процессов. Предсказание нестабильности аневризмы на основании МРТ визуализации с применением парамагнитных субстратов миелопероксидазы важно потому, что субарахноидальное кровоизлияние из разорвавшейся аневризмы приводит к геморрагическому инсульту с летальным исходом у 55-60% пациентов.
Обнаружение ферментативной активности иммуноконъюгатов в живых системах при помощи МРТ было впервые предложено и исследовано нами в 2001 году с применением модельных систем с целью визуализации клеток, экспрессирующих маркеры клеточной поверхности, типичные для онкологической трансформации. Активность данных рецепторов (например, EGFR, т.е. рецептора эпидермального фактора роста) можно ингибировать антителами, которые препятствуют димеризации рецепторов и, как следствие, ингибируют рецептор-опосредованную передачу сигнала. Мы показали, что блокирующие химерные антитела, используемые в клинических испытаниях в качестве антипролиферативного средства при раке головы и шеи, можно ковалентно связывать с пероксидазами для визуализации рецепторположительных опухолей. Эксперименты, проведенные с помощью МРТ в живых моделях плоскоклеточной карциномы и глиомы человека у атимусных мышей и крыс, соответственно, показали, что после двухстадийного последовательного внутривенного введения конъюгатов антител и субстрата происходит не только общее возрастание МРТ сигнала (по сравнению с контрольным введением субстрата без конъюгатов), но и замедление скорости выведения парамагнитного МРТ контраста, связанное с образованием олигомеров и хелат-белковых конъюгатов.