Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора
биологических наук: 03.03.04 - клеточная биология, цитология,
гистология. — Российский онкологический научный центр имени Н.Н.
Блохина РАМН, Отдел математических методов в биологии НИИ
физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В.
Ломоносова. — Москва, 2011. — 51 с.
Научный консультант: член-корр. РАН, доктор медицинских наук,
профессор Ю.М. Васильев.
Цели настоящей работы.
Исследовать перестройки актинового цитоскелета, лежащие в основе движения нормальных клеток, проанализировать вклад разных составляющих - полимеризации актиновой сети и актомиозиновой сократимости — для обеспечения эффективного клеточного движения, выяснить роль образования адгезионных структур в реорганизации актинового цитоскелета.
Исследовать изменения морфологии клеток и цитоскелета, возникающие при опухолевой трансформации и приводящие к изменению характера клеточного движения и приобретению клетками инвазивного фенотипа.
Научная новизна и практическая ценность.
Исследованию подвижности клеток и механизмам, определяющим эту подвижность, уделяется огромный интерес в мире. Благодаря бурному техническому развитию микроскопии в последнее время появилось много новых методов и подходов, позволяющих изучать движение индивидуальных клеток. В настоящей работе было использовано уникальное сочетание современных методов – видеомикроскопию, метод компьютерно-усиленного фазового контраста, TIRF (тотальную интерференционно-отражательную микроскопию), конфокальную микроскопию. Для осуществления коррелятивной электронной и видеомикроскопии был разработан метод, позволяющий, сочетать видеосъемки живых клеток с последующим изучением на электронномикроскопическом уровне клеточных структур с известной жизненной историей. Впервые в сочетании с корреляционной электронной микроскопией был применен метод электронной томографии, позволяющей с высоким разрешением исследовать 3х-мерное строение адгезионных структур построить модели реорганизации цитоскелета на разных стадиях формирования ФА. Полученные модели прояснили механизмы формирования адгезионных структур и перестройки цитоскелета при движении клеток. Проведенные исследования продемонстрировали важнейшую роль формирования новых адгезионных структур в процессе реорганизации актинового цитоскелета во время клеточного движения.
Исследование динамики трансфицированных в клетку белков – компонентов фокальных адгезий позволило внести существенный вклад в современное представление о строении и динамике адгезионных структур. Впервые в мире была выделена стадия инициальных фокальных адгезий, как начальная стадия формирования адгезионных структур. Ранее эта стадия не была описана исследователями из-за методических трудностей, и только использование такого широкого набора белков-маркеров и последующее исследование структуры с помощью коррелятивной электронной микроскопии позволило выделить этот этап формирования ФА. Впервые была показана роль белка VASP, как организатора сборки фокальных адгезий. Трансфекция клеток белками, меченными флуорохромами, позволила наблюдать перестройки актинового цитоскелета при движении клеток, дало возможность выяснить механизмы, регулирующие динамику цитоскелета. Были исследованы две зоны, образующиеся на активном ведущем краю - ламеллиподия и ламелла. Впервые в мире было показано, что основным процессом, определяющим быстрый ретроградный ток в ламеллиподии, является полимеризация актина, тогда как медленный ретроградный ток в ламеллиподии обеспечивается акто-миозиновым сокращением. Впервые в мире было показано, что формирование адгезионных структур de novo происходит в зоне ламеллиподии и при дальнейших перестройках именно позиция этих структур определяет положение границы между ламеллиподией и ламеллой. Эти исследования вносят весомый вклад в понимание процессов перестройки цитоскелета, лежащие в основе клеточного движения.
Исследовать перестройки актинового цитоскелета, лежащие в основе движения нормальных клеток, проанализировать вклад разных составляющих - полимеризации актиновой сети и актомиозиновой сократимости — для обеспечения эффективного клеточного движения, выяснить роль образования адгезионных структур в реорганизации актинового цитоскелета.
Исследовать изменения морфологии клеток и цитоскелета, возникающие при опухолевой трансформации и приводящие к изменению характера клеточного движения и приобретению клетками инвазивного фенотипа.
Научная новизна и практическая ценность.
Исследованию подвижности клеток и механизмам, определяющим эту подвижность, уделяется огромный интерес в мире. Благодаря бурному техническому развитию микроскопии в последнее время появилось много новых методов и подходов, позволяющих изучать движение индивидуальных клеток. В настоящей работе было использовано уникальное сочетание современных методов – видеомикроскопию, метод компьютерно-усиленного фазового контраста, TIRF (тотальную интерференционно-отражательную микроскопию), конфокальную микроскопию. Для осуществления коррелятивной электронной и видеомикроскопии был разработан метод, позволяющий, сочетать видеосъемки живых клеток с последующим изучением на электронномикроскопическом уровне клеточных структур с известной жизненной историей. Впервые в сочетании с корреляционной электронной микроскопией был применен метод электронной томографии, позволяющей с высоким разрешением исследовать 3х-мерное строение адгезионных структур построить модели реорганизации цитоскелета на разных стадиях формирования ФА. Полученные модели прояснили механизмы формирования адгезионных структур и перестройки цитоскелета при движении клеток. Проведенные исследования продемонстрировали важнейшую роль формирования новых адгезионных структур в процессе реорганизации актинового цитоскелета во время клеточного движения.
Исследование динамики трансфицированных в клетку белков – компонентов фокальных адгезий позволило внести существенный вклад в современное представление о строении и динамике адгезионных структур. Впервые в мире была выделена стадия инициальных фокальных адгезий, как начальная стадия формирования адгезионных структур. Ранее эта стадия не была описана исследователями из-за методических трудностей, и только использование такого широкого набора белков-маркеров и последующее исследование структуры с помощью коррелятивной электронной микроскопии позволило выделить этот этап формирования ФА. Впервые была показана роль белка VASP, как организатора сборки фокальных адгезий. Трансфекция клеток белками, меченными флуорохромами, позволила наблюдать перестройки актинового цитоскелета при движении клеток, дало возможность выяснить механизмы, регулирующие динамику цитоскелета. Были исследованы две зоны, образующиеся на активном ведущем краю - ламеллиподия и ламелла. Впервые в мире было показано, что основным процессом, определяющим быстрый ретроградный ток в ламеллиподии, является полимеризация актина, тогда как медленный ретроградный ток в ламеллиподии обеспечивается акто-миозиновым сокращением. Впервые в мире было показано, что формирование адгезионных структур de novo происходит в зоне ламеллиподии и при дальнейших перестройках именно позиция этих структур определяет положение границы между ламеллиподией и ламеллой. Эти исследования вносят весомый вклад в понимание процессов перестройки цитоскелета, лежащие в основе клеточного движения.