Тимощенко Л.В., Чубик М.В. Основы микробиологии и биотехнологии: учебное пособие

Подождите немного. Документ загружается.

зований в форме шара или эллипса, располагающихся в основном у по-

люсов клетки. Обычно на полюсах бывает по одной грануле.

Нуклеоид

Нуклеоид – ядерный аппарат бактерий. Представлен молекулой

ДНК, соответствующей одной хромосоме. Она замкнута, располагается

в ядерной вакуоле, не имеет ограничивающей от цитоплазмы мембраны.

С ДНК связано небольшое количество РНК и РНК-полимеразы.

ДНК свернута вокруг центрального стержня, состоящего из РНК, и

представляет собой высокоупорядоченную компактную структуру.

Хромосомы большинства прокариот имеют молекулярную массу в пре-

делах 1–3´10

, константу седиментации 1300-2000 S. Молекула ДНК

включает 1,6´10

нуклеотидных пар. Различия в генетическом аппарате

прокариотических и эукариотических клеток обусловливают его назва-

ние: у первых – нуклеоид (образование, подобное ядру), в отличие от

ядра у вторых.

В нуклеоиде бактерий содержится основная наследственная ин-

формация, которая реализуется в синтезе специфических белковых мо-

лекул. С ДНК бактериальной клетки связаны системы репликации, ре-

парации, транскрипции и трансляции.

Нуклеоид в прокариотической клетке может быть выявлен в окра-

шенных препаратах с помощью светового или фазово-контрастного

микроскопа.

У многих бактерий в цитоплазме обнаружены внехромосомные ге-

нетические элементы – плазмиды. Они представляют собой замкнутые в

кольца двухцепочечные ДНК, состоящие из 1500–40000 пар нуклеоти-

дов и содержащие до 100 генов.

Капсула

Капсула – слизистый слой клеточной стенки бактерий, состоящий

из полисахаридов или полипептидов. Микрокапсулу (толщиной менее

0,2 мкм) способны формировать большинство бактерий.

Жгутики

Жгутики выполняют роль органа движения, позволяющего бакте-

риям передвигаться со скоростью 20–60 мкм/сек. Бактерии могут иметь

один или несколько жгутиков, располагающихся по всей поверхности

тела либо собранных в пучки у одного полюса, у разных полюсов. Тол-

щина жгутиков в среднем составляет 10–30 нм, а длина достигает 10–20

мкм.

Основу жгутика составляет длинная спиральная нить (фибрилла),

которая у поверхности клеточной стенки переходит в утолщенную изо-

гнутую структуру – крюк и прикрепляется к базальной грануле, вмон-

тированной в клеточную стенку и ЦПМ (рис. 1.8).

Рис. 1.8. Схематическая модель базального конца жгутика Е. coli, основанная

на электронных микрофотографиях выделенной органеллы

Базальные гранулы имеют диаметр около 40 нм и состоят из не-

скольких колец (одна пара – у грамположительных бактерий, четыре – у

грамотрицательных прокариот). Удаление пептидогликанового слоя

клеточной стенки ведет к потере способности бактерий к движению, хо-

тя жгутики при этом остаются неповрежденными.

Жгутики почти полностью состоят из белка флагеллина с некото-

рым содержанием углеводов и РНК.

Споры

Некоторые бактерии в конце периода активного роста способны

образовывать споры. Этому предшествует обеднение среды питатель-

ными веществами, изменение ее рН, накопление ядовитых продуктов

метаболизма. Как правило, одна бактериальная клетка образует одну

спору – локализация спор различна (центральная, терминальная, суб-

терминальная – рис. 1.9).

Pис. 1.9. Типичные формы спорообразующих клеток.

Если размеры спор не превышают поперечного размера палочко-

видной бактерии, то последняя называется бациллой. Когда диаметр

споры больше – бактерии имеют форму веретена и носят название кло-

стридий.

По химическому составу различие спор от вегетативных клеток со-

стоит лишь в количественном содержании химических соединений.

Споры содержат меньше воды и больше липидов.

В состоянии споры микроорганизмы метаболически неактивны,

выдерживают высокую температуру (140–150°С) и воздействие химиче-

ских дезинфицирующих веществ, длительно сохраняются в окружаю-

щей среде.

Попадая в питательную среду, споры прорастают в вегетативные

клетки. Процесс прорастания спор включает три стадии: активации, на-

чальной стадии и стадии роста. К активирующим агентам, нарушающим

состояние покоя, относят повышенную температуру, кислую реакцию

среды, механические повреждения и др. Спора начинает поглощать во-

ду и с помощью гидролитических ферментов разрушает многие собст-

венные структурные компоненты. После разрушения наружных слоев

наступает период формирования вегетативной клетки с активацией био-

синтеза, заканчивающейся делением клетки.

1.1.4. Морфология микробов–эукариотов:

дрожжевых и плесневых грибов

Грибы (тип Mycota, Mycetes, Fungi) представлены одноклеточными

или многоклеточными эукариотами, которые по наличию хитина в обо-

лочке, стероидов в цитоплазматической мембране и гликогена в цито-

плазме напоминают клетки животного происхождения, а по наличию

клеточной стенки, состоящей из полисахаридов, близких к целлюлозе;

по способности к неограниченному росту, размножению спорами и не-

подвижностью в вегетативном состоянии – растения.

Рис. 1.10. Структура мицелия плесеней.

У грибов существует 2 типа роста: гифальный рост (гифомицеты) и

дрожжевой рост (бластомицеты). Обычно вегетативное тело гифомице-

тов состоит из нитей толщиной около 5 мкм, сильно разветвленных и

называемых гифами. Гифы либо не имеют поперечных перегородок (у

низших грибов), либо разделены перегородками на клетки (у высших

грибов). Совокупность гифов образует мицелий – грибницу (рис.1.10).

Мицелий может быть субстратный, образующийся в результате

врастания гифов в питательную среду и воздушный, растущий на по-

верхности среды. Мицелий представляет ветвящиеся трубки, ветвление

осуществляется боковыми выростами гиф. Переплетающиеся гифы с

толстыми оболочками образуют склероции – округлые или неправиль-

ной формы образования размером от долей мм до нескольких см, пред-

назначенные для выживания в неблагоприятных условиях (рис. 1.11).

Рис. 1.11. Гифы Aspergillus и Penicillium двух промышленно важных плесеней

Кроме гифальных форм грибов, существуют и бластомицеты

(дрожжевые и дрожжеподобные грибы). Они представляют собой сфе-

рические или грушевидные формы размером 3–15 мкм. Эти клетки со-

держат включения гликогена и липиды, они способны к почкованию,

делению, в результате которого клетки не распадаются, а образуют

псевдомицелий.

Для многих видов грибов может быть характерен диморфизм, т. е.

гифальная форма роста может переходить в дрожжеподобную.

Ни один из вышеописанных морфологических элементов не явля-

ется характерным для того или иного гриба. Комплексом разнообразных

клеточных элементов определяется большой полиморфизм грибов в

культурах на различных питательных средах. Тканевые формы грибов

обычно представлены довольно однообразными спорами или мицелием,

совсем не похожими на культуральные элементы грибов.

В биотехнологии грибы используются как продуценты органиче-

ских кислот (лимонной – Aspergillus niger), ферментов (амилаз –

Aspergillus oryzae; пектиназ – Aspergillus awanori; каталазы – Penicillium

vitale и др.), липидов, антибиотиков (пенициллина – Penicillium notatum;

гризеофульвина – Penicillium griseofulvum), а также используются в пи-

щевой промышленности (например, для созревания сыров рокфор и ка-

мамбер, получения вина, спирта, при хлебопечении и т. д.).

1.1.5. Методы микроскопического исследования микроорганизмов

Мельчайшие размеры микроорганизмов обусловливают использо-

вание для изучения морфологии бактерий точных оптических приборов

– микроскопов. Наиболее часто применяются светлопольная микроско-

пия, микроскопия в темном поле, фазово-контрастная и люминесцент-

ная микроскопия. Для специальных микробиологических исследований

используется электронная микроскопия.

Светлопольная микроскопия

Светлопольная микроскопия осуществляется с помощью обычного

светового микроскопа, основной частью которого является объектив. На

оправе объективов обозначается увеличение: 8, 10, 20, 40, 90.

При исследовании микробов применяется иммерсионная система

(объектив). Иммерсионный объектив погружают в каплю кедрового

масла, нанесенного на препарат. Кедровое масло имеет такой же коэф-

фициент преломления, как и стекло, и этим достигается наименьшее

рассеивание световых лучей (рис. 1.12).

Рис. 1.12. Ход лучей в иммерсионном объективе

Изображение, получаемое в объективе, увеличивает окуляр, со-

стоящий из двух линз. В отечественных микроскопах применяются оку-

ляры с увеличением 7, 10, 15 (рис. 1.13). Общее увеличение микроскопа

определяется произведением увеличения объектива на увеличение оку-

ляра. В микробиологии обычно используются увеличения в 900–1000

раз. Качество микроскопа зависит не от степени увеличения, а от его

разрешающей способности.

Рис. 1.13. Схема сложного светового микроскопа для наблюдения в светлом

поле, отрегулированного для освещения по Келеру

Под этим надо понимать наименьшее расстояние между двумя точ-

ками препарата, при котором они еще четко различимы под микроско-

пом. Разрешающая способность обычных световых микроскопов с им-

мерсионной системой равна 0,2 мкм.

Темнопольная микроскопия

Микроскопия в темном поле зрения основана на следующем прин-

ципе (рис. 1.14). Лучи освещают объект не снизу, а сбоку и не попадают

в глаза наблюдателя: поле зрения остается темным, а объект на его фоне

оказывается светящимся. Это достигается с помощью специального

конденсора (параболоид) или обычного конденсора, прикрытого в цен-

тре кружком черной бумаги.

Препараты для темнопольной микроскопии готовят по типу «вися-

чей» и «раздавленной» капли. При приготовлении препарата «раздав-

ленная» капля исследуемый материал (бактериальную культуру в фи-

зиологическом растворе) наносят на предметное стекло, которое покры-

вают покровным стеклом. Капля материала заполняет все пространство

между покровным и предметным стеклом, образуя ровный слой. Для

приготовления «висячей» капли необходимо использовать специальные

предметные стекла с углублением в центре и покровные стекла. На се-

редину покровного стекла наносят исследуемый материал. Края углуб-

ления на предметном стекле смазывают вазелином, и им накрывают по-

кровное стекло так, чтобы капля находилась против центра углубления.

Затем переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Темнополь-

ная микроскопия используется для изучения живых неокрашенных

микроорганизмов.

Рис. 1.14. Схема микроскопа для наблюдения в темном поле.

Фазово-контрастная микроскопия

При прохождении пучка света через неокрашенный объект изменя-

ется лишь фаза колебания световой волны, что не воспринимается чело-

веческим глазом. Чтобы изображение стало контрастным, необходимо

превратить фазовые изменения световой волны в видимые амплитуд-

ные. Это достигается с помощью фазово-контрастного конденсора и фа-

зового объектива (рис. 1.15).

Фазово-контрастный конденсор представляет собой обычный объ-

ектив с револьвером и набором кольцевых диафрагм для каждого объ-

ектива. Фазовый объектив снабжен фазовой пластинкой, которую полу-

чают нанесением солей редкоземельных элементов на объектив. Изо-

бражение кольцевой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пластин-

ки соответствующего объектива.

Фазово-контрастная микроскопия значительно повышает контраст-

ность объекта и используется для изучения нативных препаратов.

Рис. 1.15. Схема фазово-контрастного микроскопа.

Люминесцентная микроскопия

Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых

веществ под влиянием падающего на них света испускать лучи с другой

(обычно большей) длиной волны (флюоресцировать). Такие вещества

называют флюорохромами (акридиновый желтый, родамин и др.). Объ-

ект, обработанный флюорохромом, при освещении ультрафиолетовыми

лучами приобретает яркий цвет в темном поле зрения.

Основной частью люминесцентного микроскопа является освети-

тель, имеющий лампу ультрафиолетового цвета и систему фильтров к

нему (рис. 1.16). Очень важно использование нефлуоресцентного им-

мерсионного масла.

Люминесцентная микроскопия в практической микробиологии ис-

пользуется для индикации и идентификации возбудителей инфекцион-

ных заболеваний.

Рис. 1.16. Схематическое изображение флуоресцентного микроскопа:

1 – дуговая лампа; 2 – кварцевый коллектор; 3 – кювета, заполненная раствором

сернокислой меди; 4 – передняя часть коллектора; 5 – ультрафиолетовый фильтр; 6

– призма; 7 – пластинка из уранового стекла; 8 – окулярный фильтр, поглощающий

ультрафиолетовые лучи.

Электронная микроскопия

Возможности оптических микроскопов ограничены слишком

большой длиной волны видимого света (6000 А). Объекты, размеры ко-

торых меньше этой величины, находятся за пределами разрешающей

способности светового микроскопа. В электронном микроскопе вместо

световых волн используются электронные лучи, обладающие чрезвы-

чайно малой длиной волны и высокой разрешающей способностью (рис.

1.17).

В качестве источника электронных лучей применяют электронную

пушку, основой которой служит вольфрамовая нить, нагретая электри-

ческим током. Между вольфрамовой нитью и анодом на пути электро-

нов находится электрическое поле высокого напряжения. Электронный

поток вызывает свечение фосфоресцирующего экрана. Проходя через

объект, части которого имеют различную толщину, электроны будут со-

ответственно задерживаться, что проявится на экране участками затем-

нения. Объект приобретает контрастность.

Препараты для электронной микроскопии готовят на тончайших

коллоидных пленках, исследуют объекты после их высушивания («на-

тивные препараты»), напыления при помощи тяжелых металлов, ульт-

ратонких срезов метода реплик и др.

С помощью электронной микроскопии можно обнаружить самые

мелкие структуры, получить увеличение до 200 000 и увидеть объекты

размером 0,002 мкм.

Рис. 1.17. Схема трансмиссионного электронного микроскопа.

1.2. ФИЗИОЛОГИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

1.2.1. Питание бактерий

Бактерии, как и все другие организмы, для существования и вос-

производства себе подобных нуждаются в постоянном обмене веществ с

окружающей средой. Превращения веществ в клетке (метаболизм)

представлены противоположными, но и взаимосвязанными процессами,

направленными, во-первых, на распад сложных питательных веществ на

более простые, это звено метаболизма называется катаболизмом, а, во-