Сиволоб А.В., Рушковський С.Р., Кир’яченко С.С. та ін. Генетика. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 2. Експресія генів

APE

Велика

субодиниця

Сайти

зв'язування

РНК

Маленька

субодиниця

Ініціація

N-кінець

Амінокислоти

аа-тРНК

мРНК

Фактори

ермінації

Термінація

Елонгація

Зв'язування

аа-тРНК

Транспептидація Транслокація

Рис. 2.4. Схема процесу трансляції. У нижній частині

показано події одного елонгаційного циклу

Далі робота рибосоми під час елонгації трансляції полягає в послі-

довному (потриплетно) зчитуванні інформації з мРНК і відповідному

приєднанні амінокислот до поліпептидного ланцюга (рис. 2.4). Кожен

такий крок складається з трьох операцій, що циклічно повторюються

(елонгаційний цикл). Цикл розпочинається зі зв'язування аа-тРНК

з А-сайтом. Рибосома забезпечує високу специфічність щодо взаємо-

дій між кодоном і антикодоном – тільки споріднена до даного кодона

тРНК відбирається системою. Процес розміщення аа-тРНК в А-сайті

часто супроводжується дисоціацією з Е-сайта деаміноацильованої

тРНК, яка залишилася там із попереднього циклу.

Наслідком зв'язування є транспептидація – перенесення пептидилу

з пептидил-тРНК на амінокислоту у складі аа-тРНК. Каталітичний актив-

ний центр, що забезпечує транспептидацію, розташований на великій

субодиниці рибосоми й формується виключно рибосомною РНК. Унаслі-

док транспептидації в А-сайті опиняється пептидил-тРНК із подовженим

на одну амінокислоту пептидилом, у Р-сайті – деаміноацильована тРНК.

Генетика

Третя операція – транслокація – полягає в переміщенні рибосоми

на один кодон уздовж мРНК (молекули тРНК залишаються зв'язаними

зі своїми кодонами), після чого розпочинається наступний елонгацій-

ний цикл. Ефективніть і швидкість здійснення елонгаційного циклу

залежить від двох білкових факторів елонгації.

Коли після чергового елонгаційного циклу (який стане останнім)

в А-сайті опиняється один із трьох стоп-кодонів, він розпізнається

факторами термінації трансляції – жодна тРНК не містить відповід-

них антикодонів (рис. 2.4). Фактори термінації забезпечують звіль-

нення синтезованого амінокислотного ланцюга та підготовку рибосо-

ми до нового раунду трансляції: дисоціацію субодиниць рибосоми од-

на від одної та від мРНК.

ЕКСПРЕСІЯ ГЕНІВ У ПРОКАРІОТІВ

Розглянемо перший етап експресії гена – транскрипцію – і, водно-

час, загальну картину реалізації спадкової інформації. Хоча молеку-

лярні механізми синтезу РНК є значною мірою спільними для всіх

живих організмів, вони суттєво розрізняються для про- та еукаріотів.

Тому варто розглянути їх окремо, а почати слід із простішої прокаріо-

тичної системи експресії генів.

Транскрипція

Зростання ланцюга РНК при транскрипції відбувається в напрямі

від 5'- до 3'-кінця. Субстратами реакції є 3'-кінцева ОН-група рибози

зростаючого транскрипту (ланцюга РНК, що синтезується) і рибонук-

леозидтрифосфати (rNTP). Принципова схема реакції ідентична схемі

реакції синтезу ДНК (рис. 1.16) – приєднання чергового нуклеотиду

залежить від його комплементарних взаємодій з тим ланцюгом ДНК,

котрий використовується як матриця. Фермент, який каталізує цю ре-

акцію – ДНК-залежна РНК-полімераза.

До складу бактеріальної РНК-полімерази входять кілька білкових

субодиниць. Залежно від стадії транскрипції існує дві її форми:

1) кор-фермент у складі субодиниць, позначуваних як α

(дві ко-

пії), β, β' і ω;

2) голофермент – комплекс кор-ферменту із субодиницею σ.

Розділ 2. Експресія генів

Кор-фермент може працювати на різноманітних послідовностях,

оскільки має досить високу неспецифічну спорідненість до ДНК. По-

ява субодиниці σ у складі голоферменту зумовлює зниження загальної

неспецифічної спорідненості, однак при цьому виникає специфічна

спорідненість до

промоторів – особливих ділянок, із яких має розпо-

чинатися транскрипція. Субодиниця σ, таким чином, виконує роль

загального фактора ініціації транскрипції. Різні промотори розрізняють-

ся за спорідненістю до голоферменту (силою промотора). Відповідно,

упізнання слабких промоторів залежить від додаткових, специфічних

для даного гена чи групи генів, факторів ініціації.

Робочий цикл РНК-полімерази складається з таких стадій.

•

Ініціація транскрипції, яка також є багатостадійним процесом

(рис. 2.5):

1)зв'язування голоферменту з промотором;

2)локальне плавлення подвійної спіралі – розходження ланцюгів

ДНК (на ділянці у 12–14 пар основ), яке дозволяє використову-

вати один із них як матрицю;

3)включення перших двох нуклеотидів у молекулу РНК (синтез

першого фосфодіефірного зв'язку в активному центрі поліме-

рази) є найповільнішою стадією процесу, яка може відбувати-

ся тільки у присутності субодиниці σ;

4)зростання первинного короткого транскрипту – приєднання

8–9 нуклеотидів;

5)очищення промотора – дисоціація σ-фактора, яка маркує пе-

рехід до елонгації транскрипції.

омото

кор-фермен

ααββ'ω

НК

Плавлення ДНК,

утворення першого

зв'язк

Зростання

первинного

тр

анск

ипт

Очищення

промотора,

початок елонга

ії

РНК

Рис. 2.5. Ініціація транскрипції бактеріальною РНК-полімеразою

Генетика

• Елонгація транскрипції, у кожному елементарному акті якої

приєднується черговий нуклеотид до 3'-кінця РНК і кор-

фермент пересувається на один нуклеотид уздовж матриці.

При цьому разом із полімеразою переміщується також і розплав-

лена ділянка ДНК: одна пара основ руйнується попереду від

полімерази, одна – відновлюється позаду. Синтез РНК відбува-

ється із середньою швидкістю 40 нуклеотидів за секунду.

•

Термінація транскрипції – визволення транскрипту, після чого

кор-фермент знову взаємодіє з σ-субодиницею і здійснює новий

пошук промотора. Сигнал термінації являє собою послідовність,

транскрипція якої приводить до утворення у складі мРНК ком-

плементарної дволанцюгової шпильки, безпосередньо фланкова-

ної polyU послідовністю: цей елемент структури мРНК розпізна-

ється полімеразою, унаслідок чого система руйнується. Іноді про-

цес полегшується додатковими білковими факторами термінації.

РНК-полімераза характеризується асиметричною структурою: дві

великі субодиниці – β і β' – формують характерні "щелепи", із внут-

рішньою поверхнею яких взаємодіє ДНК, розташована "нижче"

(downstream) у напрямку руху полімерази. Глибоко між щелепами міс-

титься каталітичний активний центр (рис. 2.6). Ці риси структурної

організації є загальними для всіх інших РНК-полімераз: еукаріотич-

них і мономерних полімераз деяких бактеріофагів.

РНК

Матричний

анцюг ДН

NTP

Рис. 2.6. Схема організації РНК-полімеразного комплексу

(у розрізі) під час елонгації транскрипції

Асиметрична будова РНК-полімерази зумовлює два можливі спо-

соби, якими фермент може бути орієнтованим відносно ДНК: кожній

із цих орієнтацій буде відповідати два протилежні напрямки руху при

транскрипції. Відповідно, один із двох ланцюгів ДНК буде обиратися

Розділ 2. Експресія генів

як матричний – той, з якого зчитується інформація у напрямку 3'–5'

(рис. 2.6, 2.7). Послідовність ланцюга ДНК, який є комплементарним

матричному, збігається з послідовністю РНК, що синтезується. Тому

саме цей нематричний ланцюг називають кодуючим, або змістовним, –

його послідовність прийнято наводити як послідовність даного гена

(відповідно, матричний ланцюг називають антикодуючим). Нуклео-

тид кодуючого ланцюга, який відповідає стартовому нуклеотиду РНК

(частіше пуриновий), позначається як +1, наступні нуклеотиди

(чи пари основ) у напрямку руху полімерази нумерують з позначкою "+":

+2, +3 і т. д. У зворотному напрямку (ліворуч на рис. 2.7) нуклеотиди

нумерують із позначкою "–" (починаючи з –1).

T T G A C A T A T

A T

A/G

-10

-35

Кодуючий

(

змістовний

)

ланцюг

Антикодуючий

(

антизмістовний

)

ланцюг

12–14 па

основ

Рис. 2.7. Типовий промотор E. coli. Зелена стрілка

позначає старт транскрипції всередині розплавленої зони

Типовий бактеріальний промотор (рис 2.7) складається з двох еле-

ментів послідовності, розташованих на відстані приблизно –10 і –35 від

стартової точки. Консенсусна (узагальнена для різних промоторів) по-

слідовність елемента –35 має вигляд T

(числами по-

значено частоту зустрічальності даної основи у відсотках). Послідов-

ність елемента –10 (називається також боксом Прибноу):

. Варіабельність послідовностей визначає різну ефек-

тивність ініціації – силу промоторів. Саме елементи –35 та –10 безпо-

середньо впізнаються σ-фактором при ініціації транскрипції. Наведе-

ні послідовності розпізнаються варіантом σ-фактора із молекулярною

вагою 70 кДа (σ

), який є досить широко застосовуваним, однак він

Генетика

не єдиний. Кільком іншим варіантам σ, під контролем яких перебу-

вають певні групи промоторів, відповідають інші консенсусні послі-

довності –35 та –10. Взаємодія σ-фактора з промотором чітко орієнтує

РНК-полімеразу щодо ДНК, тобто визначає як стартову точку транс-

крипції, так і її напрямок (вибір одного з двох ланцюгів як матричного).

Суттєвою особливістю прокаріотичної системи транскрипції біл-

кових генів є те, що молекула мРНК зв'язується з рибосомами безпо-

середньо під час транскрипції –

прокаріотична транскрипція і біл-

ковий синтез є єдиним процесом

. При цьому мРНК, що синтезується

на так званих оперонах – кластерах кількох генів, про які детальніше

йтиметься нижче, містить кілька послідовних рамок зчитування та

кілька стартових кодонів. Ініціація трансляції відбувається окремо на

кожному з них усередині мРНК, і розпізнання цих стартових кодонів

не залежить від їхнього розташування щодо 5'-кінця матриці (так

звана внутрішня ініціація). Специфічне розміщення стартового кодо-

на в Р-сайті рибосоми при ініціації трансляції у прокаріотів забезпе-

чується комплементарним упізнанням між ділянкою рРНК 16S і кон-

сервативною послідовністю Шайна – Дальгарно, розміщеною в мРНК

за 5–9 нуклеотидів від стартового кодона в напрямку до 5'-кінця. Саме

наявність цієї послідовності й робить даний кодон AUG стартовим,

відрізняючи його від звичайного метіонінового кодона.

Якщо рибосоми з тих чи інших причин не зв'язуються з мРНК,

транскрипт швидко деградує під дією нуклеаз.

Регуляція транскрипції

Зрозуміло, що гени не транскрибуються постійно, а вмикаються /

вимикаються в певні моменти залежно від зовнішніх умов, стадій клі-

тинного циклу тощо. Головними елементами, взаємодія між якими зу-

мовлює активацію чи репресію транскрипції, є цис- і транс-елементи.

Цис-елементи – це регуляторні елементи послідовності ДНК, які фізи-

чно зв'язані з даним геном; у прокаріотів часто називаються опера-

торами і перебувають у безпосередній близькості до промоторів.

Транс-елементи – білкові фактори транскрипції, які вільно дифунду-

ють (транспортуються) у просторі клітини, шукаючи свій цис-елемент,

до якого вони мають специфічну спорідненість. Якщо зв'язування

транс-елемента з оператором приводить до активації транскрипції

(часто за рахунок прямих білок-білкових взаємодій транскрипційного

фактора з РНК-полімеразою, які підвищують її спорідненість до про-

Розділ 2. Експресія генів

мотора), кажуть, що фактор є активатором і здійснює позитивну

регуляцію. Якщо фактор блокує зв'язування РНК-полімерази (часто за

рахунок зниження доступності промотора), його називають репресором

і йдеться про негативну регуляцію.

Ці загальні принципи регуляції, які, ускладнюючись , зберігаються

також в еукаріотів, реалізуються на стадії ініціації. Крім того, для ре-

гуляції використовуються інші моменти процесу транскрипції. Зокрема,

для регуляції певних генів застосовується механізм антитермінації,

коли активатори транскрипції запобігають упізнанню РНК-полі-

меразою сигналів термінації, що містяться всередині кодуючої части-

ни гена. Якщо фактори відсутні, ген неактивний: наявність терміну-

ючого сигналу зумовлює термінацію транскрипції та визволення не-

функціонального РНК-продукту.

Суттєвою особливістю прокаріотичного геному є те, що хоча при-

близно 3/4 транскрипційних одиниць (скажімо, E. coli) містять один

ген, решта реалізує характерний для бактерій оперонний принцип

організації генетичного матеріалу .

Оперон являє собою кластер так

званих структурних генів, на яких синтезується одна молекула

мРНК, що має кілька (одна на кожен структурний ген) послідовних

відкритих рамок зчитування для трансляції відповідних білків.

У межах оперона згруповані структурні гени, які відповідають за син-

тез білків, залучених до одного ланцюжка біохімічних перетворень

(ферменти синтезу або деградації певної сполуки). Крім структурних

генів оперон має регуляторні ділянки, за рахунок яких здійснюється

регуляція транскрипції оперона як цілого. У геномі E. coli міститься

~650 таких одиниць транскрипції.

Наступні два приклади ілюструють найтиповіші механізми регу-

ляції транскрипції у прокаріотичних системах.

Лактозний оперон (lac-оперон) E. coli став свого часу, завдяки до-

слідженням Жакоба і Моно (François Jacob, Jacques Monod), першою

детально вивченою системою регуляції транскрипції. До складу опе-

рона (рис. 2.8) входять три структурні гени, що кодують ферменти,

залучені до утилізації (катаболізму) лактози. Транскрипція всіх трьох

генів здійснюється з одного промотора (синтезується єдина поліцист-

ронна молекула мРНК, яка має три послідовні відкриті рамки зчиту-

вання). Промотор оточують дві однакові операторні ділянки (lac-опе-

ратори), що мають спорідненість до lac-репресора, і сайт зв'язування

CAP (Catabolite A

ctivator Protein).

Генетика

Оператор

Структу рн і гени

Промотор

САР-сайт

сАМР

САР

Зниження

рівня

глюк ози ,

зростання

рівня сАМР

Рибосоми

RNAP

Рис. 2.8. Позитивна регуляція lac-оперона

катаболітним активаторним білком САР

Промотор lac-оперона слабкий – у нього досить низька власна

спорідненість до РНК-полімерази. Навіть якщо в середовищі є лакто-

за, але присутня також глюкоза (кращий харчовий субстрат для бак-

терій), транскрипція lac-оперона майже не здійснюється. Зниження

рівня глюкози приводить до підвищення внутрішньоклітинної концен-

трації сАМР (циклічного аденозинмонофосфату), зв'язування якого

з САР індукує конформаційну перебудову білка та появу його специфіч-

ної спорідненості до відповідного сайта на ДНК (див. структуру ком-

плексу на рис. 1.7, в). Взаємодія САР із РНК-полімеразою підсилює

її спорідненість до промотора – САР рекрутує полімеразу, яка далі

розпочинає синтез мРНК (рис. 2.8).

Описаний сценарій позитивної регуляції реалізується лише за

умови, що lac-оператори не взаємодіють із lac-репресором. У разі від-

сутності лактози (коли відповідні ферменти її утилізації напевно не

потрібні) гомодимери репресора (незалежно від можливої присутності

САР) зв'язуються з обома операторами й при цьому взаємодіють між

собою: утворюється тетрамерний комплекс, який утримує петлю ДНК

(рис. 2.9). Усередині петлі міститься промотор, і це абсолютно запобі-

гає зв'язуванню з ним РНК-полімерази. Коли з'являється лактоза,

її невелика кількість перетворюється на алолактозу, яка спрацьовує

як індуктор lac-оперона: зв'язування алолактози з репресором індукує

Розділ 2. Експресія генів

структурні зміни білка та втрату його спорідненості до оператора.

Унаслідок руйнування петлі РНК-полімераза зв'язується з промотором

і оперон починає працювати.

Репресор

Рис. 2.9. Негативна регуляція lac-оперона lac-репресором

Атенюація. Система атенюації (attenuation – послаблення), яка

використовується зокрема для регуляції активності триптофанового

оперона (trp-оперона) E. coli, пов'язана із використанням сигналів термі-

нації та тієї обставини, що прокаріотична транскрипція тісно узгодже-

на з трансляцією. Триптофановий оперон містить п'ять структурних

генів, які відповідають за синтез амінокислоти Trp, перед ними роз-

ташовані промотор, оператор і лідерна послідовність, з якої розпочи-

нається транскрипція (рис. 2.10, а).

1234

Промотор

Оператор

Лідер

Структурні гени

Стартовий кодон

Висока

концентрація Trp

Низька

концентрація Trp

Низька

концентрація Trp

РНК

Висока

концентрація Trp

аб

Рис. 2.10. (а): Схема trp-оперона, на якому синтезуються

два РНК-продукти залежно від внутрішньоклітинної концентрації Trp.

(б): Лідерна РНК і два варіанти спарювання основ у її складі

залежно від розташування рибосоми

Генетика

Лідерна частина РНК містить стартовий кодон, що розпізнається

рибосомою, і чотири елементи послідовності: ділянка 1 містить два

послідовні триптофанові кодони, ділянки 2–3 та 3–4 є попарно взаємо-

комплементарними, за ділянкою 4 розташована оліго-U послідовність.

Шпилька 3–4, фланкована оліго-U, є, таким чином, сигналом термі-

нації транскрипції. Коли концентрація Trp низька (є потреба у Trp

і тому оперон має бути активним), рибосома зупиняється на трипто-

фанових кодонах ділянки 1 (оскільки відсутня і Trp-тРНК). У цьому

випадку утворюється шпилька 2–3 (ділянка 3 не залучається до утво-

рення термінуючої шпильки) і РНК-полімераза продовжує синтез пов-

ноцінної мРНК. Рибосоми зв'язуються зі стартовими кодонами, що

відповідають структурним генам, і синтезуються відповідні білки.

За високого рівня Trp рибосома швидко проходить через ділянку 1 на

ділянку 2 і зупиняється на стоп-кодоні. У результаті утворюється шпиль-

ка 3–4, тобто формується сигнал термінації, і РНК-полімераза зупиняє

транскрипцію після синтезу короткої нефункціональної лідерної РНК.

trp-Оперон перебуває також під контролем trp-репресора. Регулято-

ром спорідненості репресора до оператора є сам Trp: у комплексі з ним

репресор набуває конформаційної форми, яка має високу спорідне-

ність. Якщо концентрації Trp знижується – репресор дисоціює й ефек-

тивність ініціації транскрипції підвищується приблизно в 70 разів.

Атенюація є додатковим, менш ефективним механізмом регуляції:

у разі відсутності Trp ефективність транскрипції підвищується при-

близно в 10 разів за рахунок атенюації (за наявності Trp близько 10 %

РНК-полімераз долають сигнал термінації й продовжують працювати,

за відсутності Trp – практично всі). Таким чином, сумісна дія атенюа-

ції та негативного контролю за рахунок репресора дозволяє змінюва-

ти активність оперона майже в 700 разів залежно від внутрішньоклі-

тинної концентрації Trp.

ЕКСПРЕСІЯ ГЕНІВ В ЕУКАРІОТІВ

На відміну від прокаріотів, еукаріотична мРНК синтезується під

час транскрипції у клітинному ядрі, звідки транспортується до цито-

плазми. Отже,

білковий синтез, який відбувається в цитоплазмі, та

транскрипція є окремими, розділеними у просторі й часі, етапами

експресії гена

. Інша принципова відмінність полягає в мозаїчності