Сиволоб А.В., Рушковський С.Р., Кир’яченко С.С. та ін. Генетика. Підручник

Подождите немного. Документ загружается.

Розділ 9. Генетична інженерія та методи молекулярної генетики

281

АНАЛІЗ СТРУКТУРИ Й ЕКСПРЕСІЇ ГЕНІВ

І ГЕНОМІВ

Клонований або ампліфікований фрагмент ДНК можна дослідити

різними способами, але найбільш вичерпну інформацію дає встанов-

лення нуклеотидної послідовності (sequence) фрагмента – секвенування.

На рис. 9.6 показано схему найпопулярнішого сьогодні методу

Сангера (Frederick Sanger). До одноланцюгової ДНК-матриці додається

радіоактивно мічений праймер, повний набір дезоксинуклеозидтри-

фосфатів (dNTP), ДНК-полімераза й невелика кількість дидезоксинук-

леозидтрифосфату одного з чотирьох типів (наприклад, ddATP). Диде-

зоксинуклеотид відрізняється тим, що містить атом Н замість ОН-групи

не тільки при 2'-, а також і при 3'-атомі пентози (див. рис. 1.1).

Відповідно, включення такого нуклеотиду в ланцюг, що синтезується,

зупинить подальше зростання ланцюга внаслідок відсутності 3' ОН-групи

на його кінці. Оскільки ddATP присутній у невеликій кількості, така

подія буде відбуватися в різних точках ланцюга – в усіх, де стоїть

аденін напроти тиміну в складі матриці. Денатурація продуктів реак-

ції дасть набір мічених одноланцюгових фрагментів від праймера до

кінцевого аденіну, довжина цих фрагментів у нуклеотидах дасть по-

рядковий номер аденіну в складі ланцюга.

AGTC

CTAAACGTGA

праймер

НК-полімераза +

dATP, dTTP, dCTP, dGTP +

невелика кількість ddATP

енатурація,

гель-електрофорез

Рис. 9.6. Секвенування ДНК за Сангером: схема синтезу ДНК

у присутності дидезоксиАТР (ліворуч). Аналогічна процедура для інших

трьох дидезоксинуклеотидів дає набір одноланцюгових фрагментів,

що аналізуються за допомогою гель-електрофорезу в денатуруючих умовах

(праворуч) – розподіл смуг дозволяє прочитати послідовність (праворуч внизу)

Генетика

282

З метою визначення довжини фрагментів проводять гель-електро-

форез одноланцюгової ДНК у денатуруючих умовах, на сусідні лунки

геля наносять також продукти синтезу в присутності інших дидезок-

синуклеотидів. Як показано на рис. 9.6, після електрофорезу та візуалі-

зації смуг із такого геля можна прочитати нуклеотидну послідовність.

Інший сучасний підхід у секвенуванні (так зване піросеквенування),

який реалізується на автоматизованих секвенаторах, дозволяє вста-

новити послідовність значно швидше, дешевше й при цьому не по-

требує ані клонування ДНК, ані електрофорезу. Одноланцюгові фраг-

менти, отримані з невеликої кількості геномної ДНК, пришиваються

своїми 5'-кінцями до мікрокульок (один фрагмент на кульку)

і піддаються ампліфікації за допомогою ПЛР. Кожна кулька з приши-

тими до неї ампліфікованими ідентичними фрагментами розміщуєть-

ся в мікрореакторі, де здійснюється ДНК-полімеразна реакція. Нукле-

озидтрифосфати подаються в реакційну суміш імпульсно один за од-

ним. Якщо нуклеотид певного типу виявляється комплементарним

матриці та включається у зростаючий ланцюг, пірофосфат , що при

цьому звільняється, залучається до низки хімічних реакцій, де остан-

ня реакція супроводжується випромінюванням світла (хемілюмінес -

ценція). Світловий сигнал фіксується оптичною системою, і послідов-

ність таких сигналів читається як нуклеотидна послідовність. Реакція

здійснюється паралельно у 200 тис. мікрореакторів (для 200 тис. фраг-

ментів, які перекриваються), що дозволяє встановити послідовність

приблизно 200 млн пар основ за 4,5 години.

Зрозуміло, що далеко не завжди є потреба у визначенні послідов-

ності ДНК, із якою має справу дослідник. Потужним засобом аналізу

складних сумішей ДНК щодо наявності там специфічних елементів

послідовності є

блот-гібридизація на нітроцелюлозних фільтрах за

Саузерном

(Edward Southern). Назва процедури, яку схематично зо-

бражено на рис. 9.7, походить від слова blotting (промакування): фраг-

менти ДНК розділюються за допомогою гель-електрофорезу (залиша-

ючись невидимими в гелі), після чого на гель накладають нітроцелю-

лозний фільтр, а під та над цим "сендвічем" розміщують фільтрувальний

папір і занурюють нижній шар паперу в лужний розчин. Під дією ка-

пілярних сил розчин піднімається до верхнього шару паперу, "захоп-

люючи" при цьому ДНК і переносячи її з гелю на нітроцелюлозу. Од-

ночасно при цьому ДНК денатурується лугом. У результаті одноланцю-

гова ДНК опиняється на фільтрі – середовищі, придатному для подаль-

шої гібридизації, а сам фільтр є точною реплікою вихідного гелю. Далі

проводять обробку фільтра зондом – одноланцюговим фрагментом

Розділ 9. Генетична інженерія та методи молекулярної генетики

283

ДНК певної послідовності, який містить радіоактивну мітку. Зонд гіб-

ридизується з комплементарною ДНК у певних досі невидимих сму-

гах, що можна зафіксувати за допомогою авторадіографії.

Фільтрувальний

папір

Лужни

розчин

Гель після

електрофорезу

Нітроцелюлозний

фільтр

Авторадіограма

Блотинг

ро

ка зондом

Рис. 9.7. Блот-гібридизація

У такий спосіб можна встановити, наприклад, присутність спе-

цифічних послідовностей ДНК у препаратах; наявність у геномі до-

даткових копій послідовності, що є гомологічними до вже відомої;

присутність у невивченому геномі генів, гомологічних відомим генам

тощо. Прикладом одного з численних застосувань Саузерн-блотингу

є метод

фингерпринтингу ДНК (DNA fingerprinting). Метод базується

на факті наявності в еукаріотичних геномах мінісателітних повторів –

невеликих елементів послідовності, які тандемно повторюються

в різних місцях геному кілька разів. Розподіл локусів за кількістю

повторів є індивідуальним – так само, як відбитки пальців. З метою

ідентифікації особини (чи особи – у криміналістиці, судових справах

тощо) геномну ДНК обробляють рестриктазою, котра не має своїх

сайтів усередині повтору. Фрагменти розділюються шляхом елект -

рофорезу, здійснюється блотинг і гібридизація з радіоактивно міче-

ним елементом послідовності мінісателіта. У результаті на авторадіо-

грамі представлено специфічний для особини набір фрагментів різ-

ної довжини, тобто різної кількості повторів мінісателіта – своєрід-

ний молекулярний відбиток (DNA fingerprint).

Генетика

284

Нозерн-блотинг відрізняється від описаної процедури блотингу за

Саузерном (назва nothern є просто жартівливою аналогією з букваль-

ним значенням прізвища Саузерна) лише тим, що на гель для елект-

рофорезу наноситься сумарний препарат виділеної мРНК. Гібридиза-

ція з міченим фрагментом ДНК (наприклад, кДНК із бібліотеки клонів)

дозволяє встановити наявність певної мРНК, тобто активність гена,

у клітинах певного типу після дії активуючих / репресуючих факторів

тощо, а також оцінити рівень цієї активності (концентрацію мРНК) за

інтенсивністю забарвлення смуги на авторадіограмі.

Проаналізувати повну програму активності генів організму чи

клітин певного типу за певних фізіологічних умов або у процесі

розвитку, а також виконувати інші завдання, пов'язані з вивчен-

ням функціонування цілого геному, дозволяють методи, що базу-

ються на використанні

ДНК-мікроареїв (DNA-microarrays) або ДНК-

чіпів (DNA-microchips).

Фрагмент ДНК довжиною до 1 тис. пар основ, для якого відомо

його розташування в геномі, ампліфікується, і одноланцюгові продук-

ти ампліфікації пришиваються до невеликої зони на поверхні пред-

метного скла мікроскопа. Скло розміром 2 × 2 см – ДНК-мікроарей –

покрито сіткою із приблизно 6 тис. таких мікроплям, кожна з яких

містить ДНК певної геномної ділянки.

Сумарна мРНК

кДН

НК-мікроарей

Зворотна транскриптаза +

флуоресцентний аналог

NTP

Рис. 9.8. Аналіз сумарної мРНК за допомогою ДНК-мікроарея

Розділ 9. Генетична інженерія та методи молекулярної генетики

285

Одну з типових схем використання мікроарея зображено на

рис. 9.8. Сумарна мРНК, отримана з клітин певного типу, викорис-

товується як матриця в реакції зворотної транскрипції. Поряд зі

звичайними, до реакційної суміші додається флуоресцентний ана-

лог одного з NTP. У результаті маємо препарат флуоресцентно міче-

ної кДНК. Після гібридизації з цією кДНК мікроарей аналізують за

допомогою флуоресцентного мікроскопа: наявність флуоресцентної

плями свідчить про активність певного гена, інтенсивність флуоре-

сценції – про рівень цієї активності.

Експерименти такого типу дозволяють з'ясувати зміни загальної

програми експресії генів при змінах зовнішніх умов, активність різ-

них генів у різних тканинах багатоклітинного організму, зміни актив-

ності груп генів у процесі диференціювання клітин.

ЕКСПРЕСІЯ РЕКОМБІНАНТНИХ БІЛКІВ

Методи генної інженерії дозволяють не тільки здійснювати різно-

манітні операції з нуклеїновими кислотами, а й отримувати практич-

но будь-які білки у великих кількостях. Ген, що кодує даний білок,

можна клонувати, вбудувати (наприклад, у бактеріальну плазміду)

і змусити бактеріальну культуру продукувати цей білок. Виділення та

очищення білка з культури біохімічними методами не є принциповою

проблемою, зважаючи на його велику кількість.

Одну з найпростіших схем експресії білка в E. сoli зображено на

рис. 9.9. Зрозуміло, що еукаріотичний ген не має сенсу вводити

у прокаріотичну клітину – прокаріоти не мають системи сплайсингу.

Тому беруть лише кодуючу частину гена, яку можна отримати з бібліо-

теки клонів кДНК. Використовуючи придатну рестриктазу та лігазу,

потрібну кДНК вбудовують у плазмідний вектор для експресії поряд із

промотором – наприклад, лактозного оперона (див. розділ 2). Здійсню-

ють трансформацію рекомбінантної плазміди в бактеріальні клітини,

до бактеріальної культури додають синтетичний індуктор lac-оперона

IPTG. Промотор активується, після чого здійснюється транскрипція

гена та трансляція білка.

Більш ефективна двоступенева система експресії використовує

промотор РНК-полімерази бактеріофага Т7. У бактеріальному геномі

ані таких полімераз, ані відповідних промоторів немає. У клітину

Генетика

286

вводяться два плазмідні вектори: один містить lac-промотор і ген

РНК-полімерази Т7, інший – сильний промотор полімерази Т7 разом із

геном білка, що має бути експресований. IPTG індукує експресію полі-

мерази, яка зв'язується тільки з промотором у складі другої плазміди

(інших промоторів немає) і забезпечує синтез великої кількості білка.

Бібліотека клонів кДН

lac

промотор

Плазмідний

вектор

ілок

мРНК

Трансформація

+ IPTG

Рис. 9.9. Експресія білка в бактеріальній клітині.

lac-Промотор – промотор лактозного оперона,

IPTG – синтетичний індуктор lac-оперона

Велика кількість білків, у тому числі ферменти, що використову-

ються у рекомбінантних технологіях, виробляються сьогодні шляхом

експресії в бактеріальних клітинах. Поряд із прокаріотичними розроб-

ляються та використовуються також системи експресії рекомбінантних

білків в еукаріотичних клітинах. Особливо важливими еукаріотичні сис-

теми експресії є для еукаріотичних білків, що не можуть бути синте-

зовані бактеріальною клітиною в активній формі. Зокрема, це стосу-

ється білків, що піддаються суттєвим посттрансляційним модифіка-

ціям – наприклад, глікопротеїдів. Найпростішим для використання

еукаріотичним "біореактором" є дріжджі, маніпулювати якими так

само легко й так само дешево, як і бактеріями. Як дріжджові експре-

суючі вектори використовують плазміди або штучні хромосоми YAC.

Розділ 9. Генетична інженерія та методи молекулярної генетики

Клонований ген

Гомологічні

ілянки

Плазміда

ромосомна

НК

Реком

інація

Рис. 9.10. Інтеграція гена у хромосомну ДНК

Крім того, часто буває доцільним вбудовування гена-мішені, що

кодує бажаний білок, у хромосому клітини-хазяїна: клітина позбавля-

ється при цьому зайвих витрат на реплікацію плазміди та синтез зай-

вих білків, гени яких несе плазміда. Здійснити інтеграцію можна за

рахунок гомологічної рекомбінації між геномною ДНК і ділянками, що

фланкують ген-мішень у плазміді (рис. 9.10).

ГЕНЕТИЧНА ІНЖЕНЕРІЯ

МІКРОБІОЛОГІЧНИХ СИСТЕМ

Генетично модифіковані мікрооорганізми використовуються зде-

більшого

як біореактори, що продукують білки для потреб медицини.

В основному це невеликі білки, що не піддаються посттрансляційним

модифікаціям. Одним із перших промислових застосувань генетичної

інженерії було отримання шляхом експресії у клітинах E. coli (за

принциповою схемою рис. 9.9) гормону росту людини – соматотропіну.

В організмі він секретується передньою часткою гіпофіза, а його де-

фіцит є причиною захворювання – гіпофізарної карликовості.

Генетика

288

Отримання соматостатину являє собою цікавий приклад цілесп-

рямованого конструювання білків за допомогою методів генної ін-

женерії. Це короткий пептид (містить 14 амінокислотних залишків),

який синтезується у шлунково-кишковому тракті й гальмує вивіль-

нення з гіпофізу гормону росту. Отримати соматостатин у клітинах

бактерій у значних кількостях є складним завданням, оскільки він

швидко руйнується протеолітичними ферментами. Щоб "обійти"

внутрішньоклітинні бактеріальні протеази, було сконструйовано

химерний білок-попередник. У його складі як N-кінцеву ділянку бу-

ло використано білок бактерії, до якого приєднали сам соматоста-

тин: звичайно, усе це було зроблено на рівні ДНК, зв'язувальним

елементом у цій конструкції було використано триплет АТG, що ко-

дує метіонін. Після виділення з клітин бактерій химерний білок об-

робляли бромціаном, унаслідок чого відбувалось його розщеплення

за залишком метіоніну, і таким чином вилучався фізіологічно акти-

вний поліпептид. За аналогічною схемою було розроблено процес

отримання інсуліну.

Шляхом експресії в E. coli отримують також інтерферони всіх

трьох груп: α-, β- та γ-інтерферони – антивірусні білки, які синтезу-

ються імунокомпетентними клітинами. Проте недоліком використан-

ня бактеріальних клітин для отримання β- і γ-інтерферонів (природні

інтерферони цих двох груп – глікопротеїди) є відсутність у бактерій

систем, що забезпечують посттрансляційні модифікації білків. Роль

глікозилювання β- і γ-інтерферонів не до кінця зрозуміла і, хоча неглі-

козильовані форми цих білків практично повністю зберігають проти-

вірусну активність, це спонукає до розробки й використання систем

експресії рекомбінантних інтерферонів в еукаріотичних клітинах.

Важливе місце в генетичній інженерії мікроорганізмів посідає ви-

робництво

рекомбінантних вакцин. Вони мають цілий ряд переваг

перед традиційними вакцинами: характеризуються відсутністю (або

значним зниженням вмісту) баластних компонентів, майже повною

нешкідливістю та низькою вартістю. Можна назвати три основні під-

ходи, які використовують для отримання таких вакцин:

• Модифікація мікроорганізму шляхом делеції генів, що відпо-

відають за вірулентність. При цьому зберігається здатність ви-

кликати імунну відповідь, і мікроорганізм можна використову-

вати як живу вакцину.

• Перенесення антигенних детермінант патогенного мікроорганіз-

му на непатогенний, який можна використовувати як вакцину.

Розділ 9. Генетична інженерія та методи молекулярної генетики

289

• Клонування та експресія генів білків, котрі містять анигенні

детермінанти. Білки використовують як вакцину, що провокує

імунну відповідь.

Велике значення має використання мікроорганізмів

для промисло-

вого виробництва органічних сполук.

У такому виробництві, крім кла-

сичних технологій, усе ширше використовують технологію рекомбі-

нантних ДНК, яка дозволяє спрямовано змінювати метаболізм мікро-

організмів, уводячи нові гени або модифікуючи такі, що вже існують.

Прикладами є використання рекомбінантних мікроорганізмів для

промислового синтезу L-аскорбінової кислоти (вітаміну С), барвника

індиго, антибіотиків, цінних біополімерів тощо.

Мікроорганізми можуть приносити користь не тільки завдяки

якомусь певному продукту, який ними синтезується, а й своєю дією

на довкілля. Зокрема, бактерії можна використовувати для

деградації

ксенобіотиків

(неприродних синтетичних хімічних речовин – гербі-

цидів, пестицидів, холодоагентів, хімічних відходів). Головну групу

ґрунтових мікроорганізмів, що руйнують ксенобіотики, становлять

бактерії роду Pseudomonas. Різні штами Pseudomonas здатні розще-

плювати понад 100 органічних сполук, але кожен окремий штам

використовує як джерело вуглецю тільки певну групу споріднених

сполук і не використовує інших. Шляхом перенесення плазмід, які

кодують ферменти різних катаболічних шляхів, в один реципієнт-

ний штам було створено "супербацилу", що має надзвичайні ката-

болічні властивості – вона здатна руйнувати більшість вуглеводнів

нафти. Тепер генетично модифіковані штами природних ґрунтових

мікроорганізмів використовуються для комплексної біологічного

очищення стічних вод.

ГЕНЕТИЧНА ІНЖЕНЕРІЯ РОСЛИН

Одна з переваг рослинних клітин – їхня тотипотентність: з однієї

клітини можна регенерувати цілу рослину. Отже, із клітин, сконстру-

йованих генно-інженерними методами, можна отримати рослини, усі

клітини яких несуть чужорідний ген чи гени. Часто такі

трансгенні

рослини

, створені de novo, розмножують вегетативно. Генетична мо-

дифікація рослин може здійснюватись за допомогою спеціальних век-

торів або шляхом прямого перенесення генів.

Генетика

290

Поширеним методом уведення генів у рослинні геноми є викори-

стання ґрунтової бактерії Agrobacterium tumefaciens. Агробактерії

мають здатність інтегрувати свій генетичний матеріал у клітини

дводольних рослин. Вони містять великі (близько 200 тис. пар основ)

Ті-плазміди (tumor inducing), які несуть так звану Т -ДНК – ділянку,

здатну інтегруватися в ядерний геном рослинної клітини. До складу

Т-ДНК входять гени фітогормонів, продукти експресії яких індуку-

ють у трансформованих рослин утворення пухлин – корончастих га-

лів. Гени, що відповідають за перенесення та інтеграцію Т-ДНК у ге-

ном рослин (vir-гени), знаходяться в іншій ділянці Ті-плазміди.

Трансгенні рослини отримують, використовуючи модифіковану Т-

ДНК, в якій онкогени замінені на будь-який ген, котрий бажано ін-

тегрувати в рослинний геном. Таку неонкогенну плазміду конструю-

ють генно-інженерними методами, клонують в E. coli, а потім вектор

уводять в A. tumefaciens: vir-гени забез пе чу ют ь перенесення та інте-

грацію бажаної ділянки. За допомогою агробактерій трансформова-

но велику кількість видів дводольних рослин, однак модифікація од-

нодольних рослин (головні зернові культури – рис, пшениця та куку-

рудза) таким шляхом ускладнена.

Безвекторні системи дають можливість прямого перенесення чу-

жорідної ДНК у будь-які рослинні клітини або протопласти (клітини,

в яких відсутня клітинна стінка). При безвекторному перенесенні ви-

користовують методи електропорації, мікроін'єкції та біолістичний

метод.

Мікроін'єкцію проводять під мікроскопом за допомогою скля -

ної голки, уводячи через неї ДНК у ядро клітини. Бомбардування клітин

(

біолістика) – інший дуже ефективний метод уведення ДНК у рос-

линну клітину. При цьому золоті або вольфрамові сферичні кульки ді-

аметром 0,4–1,2 мкм покривають шаром ДНК, яку осаджують CaCl

спермідином або поліетиленгліколем, і "вистрілюють" кульками в су-

спензію клітин зі спеціальної "рушниці". Кульки пробивають клітинну

стінку, за рахунок чого ДНК потрапляє всередину клітини та з пев-

ною імовірністю інтегрується в рослинну ДНК за допомогою не зовсім

зрозумілого механізму. Пряме введення ДНК у протопласти рослин

можна здійснити й за допомогою

ліпосом – сферичних частинок,

мембрани яких містять фосфоліпіди. Частинки обволікають трансфор-

муючу ДНК і тим самим захищають її від нуклеаз. За допомогою ліпо-

сом у протопласти рослин вдається ввести ДНК Ті-плазмід, а також

цілі хромосоми.