Реферат - Рестриктазы

Подождите немного. Документ загружается.

РЕСТРИКТАЗЫ

Рестриктазы - сайт-специфические дезоксирибонуклеазы, взаимодействующие со

строго определенными короткими нуклеотидными последовательностями

двухцепочечной ДНК и расщепляющими фосфодиэфирную связь в определенном месте

участка узнавания или рядом с ним.

В 1953 году было обнаружено, что ДНК определенного штамма E. coli, введенная в

клетки другого штамма не проявляет, как правило, генетической активности, так как

быстро расщепляется на мелкие фрагменты. В 1966 году было показано, что это явление

связано со специфической модификацией хозяйской ДНК - она содержит несколько

метилированных оснований, отсутствующих в немодифицированной ДНК, причем

метилирование происходит уже после завершения репликации. В бактериальную систему

рестрикции-модификации входят два специфичных для каждого штамма фермента - ДНК

модифицирующий (метилаза) и ДНК расщепляющий (эндонуклеаза рестрикции -

рестриктаза). Эти два фермента способны специфически связываться с одной и той же

последовательностью ДНК длиной 4-8 пар оснований, называемой сайтом узнавания и

характерной для каждого конкретного микроорганизма. При этом метилаза, модифицируя

определенный нуклеотид (аденин или цитозин) в пределах сайта узнавания, защищает

внутриклеточную ДНК от действия рестриктазы, что играет важную роль в защите

резидентной ДНК от загрязнения последовательностями чужеродного происхождения.

Рестриктаза, которая расщепляла неметилированную ДНК была выделена в 1968 г.

Мезельсоном и Юанем. Этот фермент был высокоспецифичен по отношению к

определенной последовательности ДНК, но расщеплял молекулы неспецифически, в

другом месте, на некотором удалении от участка узнавания. Вскоре, в 1970 г. Смит и

Вилькокс выделили из Haemophilus influenzae первую рестриктазу, которая расщепляла

строго определенную последовательность ДНК (Hind III).

В 1973 году Смит и Натанс предложили номенклатуру рестриктаз, включающую

следующие пункты:

1. Аббревиатура названия каждого фермента является производной от бинарного

названия микроорганизма, содержащего данную метилазно-рестриктазную систему.

Составляют по правилу: к первой прописной букве названия рода добавляют две первые

строчные буквы вида.

Streptomyces albus - Sal, Escherichia coli – Eco

2. В случае необходимости добавляют обозначение серотипа или штамма,

например, Есо B.

3. Различные системы рестрикции - модификации, кодируемые одной

бактериальной клеткой, обозначают римскими цифрами: Hind II, Hind I, Hind III

(Haemophilus influenzae).

4. Рестриктазы обозначают буквой R (R Hind III), метилазы - М (М Hind III).

Открытие новых рестриктаз заставило Робертса в 1978 году внести дополнения в

систему рациональных обозначений ферментов: если сокращенное название совпадает для

нескольких ферментов, то 2 первые буквы аббревиатуры остаются неизменными, а третья

берется из последующих букв видового названия:

Haemophilus parainfluenzae - Hpa I

Haemophilus parahaemolyticus \- Hph I.

Различают 3 основных класса рестриктаз: 1, 2 и 3.

Все рестриктазы узнают на двуспиральной ДНК строго определенные

последовательности, но рестриктазы 1-го класса осуществляют разрывы в произвольных

точках молекулы ДНК, а рестриктазы 2-го и 3-го классов узнают и расщепляют ДНК в

строго определенных точках внутри сайтов узнавания или на фиксированном от них

расстоянии.

Ферменты типов 1 и 3 имеют сложную субъединичную структуру и обладают

двумя типами активностей - модифицирующей (метилирующей) и АТФ-зависимой

эндонуклеазной.

Ферменты второго класса состоят из 2 отдельных белков: рестрицирующей

эндонуклеазы и модифицирующей метилазы, поэтому в генной инженерии используются

исключительно ферменты 2-го класса. Они нуждаются в ионах магния в качестве

кофакторов.

Основными характеристиками всех рестриктаз, являются: узнаваемая

последовательность нуклеотидов; место расщепления и зависимость активности от

наличия метилированых оснований в пределах узнаваемой последовательности. В

настоящее время охарактеризована субстратная специфичность около трех с половиной

тысяч рестриктаз. Среди них имеются лишь 238 ферментов, узнающих уникальные

нуклеотидные последовательности (прототипы). Остальные же эндонуклеазы, узнают

участки ДНК, идентичные уже известным прототипам и входят в группу изошизомеров.

Уникальные последовательности нуклеотидов, являющиеся субстратом для

рестриктаз, характеризуются большим разнообразием первичной структуры. Однако для

них характерны и некоторые общие черты. Более половины из известных рестриктаз

узнают четырех-, шести- и восьминуклеотидные последовательности, являющихся

палиндромами - обращенными повторами (сайты с идентичными последовательностями

нуклеотидов в направлении 5'->3' на комплементарных цепях ДНК) (рис.1а).

Сайты узнавания некоторых рестриктаз состоят из нечетного числа нуклеотидов (5 или 7

нуклеотидных пар). За исключением центрального нуклеотида, остальные основания в

таких участках также образуют палиндромные последовательности (рис.1б).

5'-AGCT-3' 5'-AATATT-3' 5'-CCTGCAGG-3'

3'-TCGA-5' 3'-TTATAA-5' 3'-GGACGTCC-5'

Sbf I Alu I Ssp I

а).

5'-GGWCC-3' 5'-ACCWGGT-3'

3'-CCWGG-5' 3'-TGGWCCA-5'

Bme18 I Mab I

б).

Рис.1. Палиндромные сайты с четным (а) и нечетным (б) числом нуклеотидов

(W=А или Т).

Нередко узнаваемая последовательность нуклеотидов является прерванной -

палиндромные участки разделены какими то нуклеотидными парами, число которых в

каждом конкретном случае является строго определенным (рис.2).

5'-ACNGT-3' 5'-GACNNNNGTC-3'

3'-TGNCA-5' 3'-CTGNNNNCAG-5'

Bst4C I BstPA I

5'-GGNNCC-3' 5'-GACNNNNNGTC-3'

3'-CCNNGG-5' 3'-CTGNNNNNCAG-5'

PspN4 I NruG I

5'-GACNNNGTC-3' 5'-GACNNNNNNGTC-3'

3'-CTGNNNCAG-3' 3'-CTGNNNNNNCAG-5'

Tth111 I DseD I

Рис.2. Прерванные сайты узнавания.

Разнообразие типов сайтов рестрикции, дополняют "вырожденные" палиндромы, в

определенных позициях которых присутствуют альтернативные основания (рис.3).

5'-CMGCKG-3' 5'-GRGCYC-3' 5'-CCSGG-3'

3'-GKCGMC-5' 3'-CYCGRG-5' 3'-GGSCC-5'

MspA I BstAC I AsuC2 I

Рис.3. Вырожденные палиндромы, где M=A или C; K=G или T; R=A или G; Y=T

или C; S=G или C.

Среди охарактеризованных специфических эндонуклеаз рестрикции имеется

группа ферментов узнающих и асимметричные последовательности нуклеотидов (рис.4).

5'-GGTCTC-3' 5'-GGATC-3' 5'-CCCGC-3'

3'-CCAGAG-5' 3'-CCTAG-5' 3'-GGGCG-5'

Bso31 I AclW I Fau I

Рис.4. Асимметричные сайты узнавания

Еще одним свойством рестриктаз, имеющим непосредственное отношение к

структуре узнаваемых участков и значимым при диагностическом использовании является

способность снижать субстратную специфичность, т.е. производить расщепление ДНК в

участках, отличающихся по структуре от канонического сайта рестрикции фермента.

Пониженная субстратная специфичность ("звездочная" активность) проявляется при

определенных условиях проведения реакции. В первую очередь - при использовании

избытков рестриктаз. Изменение рН и ионной силы инкубационной среды, замена ионов

магния на некоторые другие ионы двухвалентных металлов, добавление органических

растворителей (глицерин, диметилсульфоксид, этанол и др.) так же способны

стимулировать проявление "звездочной" активности рестриктаз.

Важной функциональной характеристикой рестриктаз является место расщепления

двухцепочечной ДНК в узнаваемом участке. Более половины специфических эндонуклеаз

расщепляют ДНК внутри участка узнавания. При этом могут образовываться концы

цепей трех структурных типов. Если разрыв происходит посередине сайта рестрикции, то

образуются фрагменты с полностью спаренными ("тупыми") концами. Когда

расщепление ДНК происходит в стороне от середины сайта, образуются выступающие

однонитевые концы, получившие название "липких", т.е. способных "слипаться" с

комплементарным концом, образующимся в противоположной цепи в результате ее

разрыва. При расщеплении одними рестриктазами образуются фрагменты с 5'-

выступающими липкими концами. Другие же рестриктазы дают фрагменты с 3'-

избыточностью (рис.5). Число нуклеотидов в однонитевом концевом участке может

варьировать от одного до пяти.

5'-TTT^AAA-3' 5'-G^AATTC-3' 5'-GACGT^C-3'

3'-AAA^TTT-5' 3'-CTTAA^G-5' 3'-C^TGCAG-5'

Тупые концы 5'-липкие концы 3'-липкие концы

Рис.5. Способы расщепления ДНК.

Вариации расщепления участков узнавания внесли некоторые поправки и в

понятие изошизомерии. Были выявлены рестриктазы, узнающие идентичные сайты, но

различающиеся по месту их расщепления. Например, рестриктазы Sma I и Xma I узнают

одинаковые последовательности нуклеотидов (CCCGGG), но первая из них при разрыве

ДНК образует фрагменты с тупыми концами, а вторая расщепляет узнаваемый участок с

образованием 5'-выступающих тетрануклеотидных концов (рис.6). Такие изошизомеры

было предложено называть неошизомерами. Также существуют рестриктазы, которые

расщепляют ДНК за пределами узнаваемых участков. Почти все они узнают

несимметричные последовательности нуклеотидов. Расстояние точки разрыва от

узнаваемого участка, а также ее ориентация являются строго определенными для каждой

рестриктазы (Рис.7).

5'-CCC^GGG-3' 5'-C^CCGGG-3'

3'-GGG^CCC-5' 3'-GGGCC^C-5'

SmaI XmaI

Рис.6. Неошизомеры SmaI и XmaI.

5'-GGTCTCN^N-3' 5'-CCCGCNNNN^N-3'

3'-CCAGAGNNNNN^N-5' 3'-GGGCGNNNNNN^N-5'

Bso31 I Fau I

Рис.7 Расщепление ДНК в несимметричных сайтах

В качестве мишеней выступают палиндромы из 4-6 пар оснований - сайты

рестрикции. Точки узнавания рестриктазами симметричны относительно поворота на

180оС. Симметрия подразумевает, что те из них, которые должны быть метилированы,

встречаются на обеих цепях ДНК. В результате сайт-мишень может быть полностью

метилирован (обе цепи модифицированы), полуметилирован (только одна цепь) или не

метилирован.

Неметилированный сайт-мишень представляет собой субстрат либо для

рестрикции, либо для модификации in vitro. В клетке немодифицированная ДНК с

большей вероятностью рестрицируется. Реакция разрезания осуществляется в две

ступени. Сначала разрезается одна цепь ДНК, а затем рядом разрезается другая. В

областях, прилегающих с каждой стороны к сайту разрезания, может иметь место

экзонуклеотическая деградация. Происходит эффективный гидролиз АТФ, роль которого

еще не выяснена.

Белок никогда не отделяется от молекулы ДНК, с которой он первоначально

связался. Если фермент инкубировать со смесью модифицированной и

немодифицированной ДНК, он предпочтительно разрезает немодифицированную ДНК.

Следовательно, узнавая сайт связывания, белок не отделяется от неметилированной ДНК

для того, чтобы найти сайт разрезания. Существуют две альтернативные модели,

объясняющие взаимосвязь между сайтами узнавания и разрезания: в соответствии с одной

из них движется фермент, согласно другой модели, перемещается ДНК. Если движется

фермент, то его перемещение вдоль ДНК будет продолжаться до тех пор, пока он не

сделает выбор сайта разрезания. Если же движется ДНК, то фермент остается

прикрепленным в сайте узнавания, а ДНК протаскивается через второй сайт связывания

на ферменте, и это продолжается до тех пор, пока фермент не достигает области

разрезания (пока не охарактеризованной). Получены электронно-микроскопические

данные, свидетельствующие, что фермент вызывает образование петли в ДНК и остается,

по-видимому, связанным с сайтом узнавания после разрезания; эти данные подтверждают

вторую модель.

Литература:

1. Томилова Ю.Э.*, Дегтярев С.Х. Эндонуклеазы рестрикции и их применение. - НПО

"СибЭнзим", 2006.

2. Н.А. Кузьмина.Основы биотехнологии / Учебное пособие для студентов

биологического факультета. – Омск, 1995.

3. Я.Кольман, К.-Г.Рем. Наглядная биохимия. – М. Мир, 2000.

2. Томилова Ю.Э., Чернухин В.А., Дегтярев С.Х. Зависимость активности сайт-

специфической эндонуклеазы GlaI от количества и положения метилированных цитозинов

в узнаваемой последовательности 5’-GCGC-3., - Вестник биотехнологии и физико-

химической биологии имени Ю.А.Овчинникова, т.2, №1 (2006) с. 30-39