Попечителев Е.П. Кореневский Н.А. Электрофизиологическая и фотометрическая медицинская техника: Теория и проектирование

Подождите немного. Документ загружается.

Глава 4

ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ

ИССЛЕДОВАНИЯХ

4.1. ОСОБЕННОСТИ ПРОВЕДЕНИЯ

ФОТОМЕТРИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

БИОЛОГИЧЕСКОГО ОБЪЕКТА

Фотометрические приборы и системы нашли применение для измере-

ния количественных характеристик и параметров физических процессов

в различных областях науки и.техники, методики проведения исследова-

ний с их помощью хорошо изучены и описаны в технической литературе

(см., например, [22,23] и др.). Однако выполнение фотометрических ис-

следований биологических объектов имеет ряд специфических особенно-

стей как при проведении измерений, так и при интерпретации результа-

тов, необходимость учета которых становится особенно важной при

определенйи оптических характеристик тканей живого организма в усло-

виях клинических и поликлинических лабораторий [6]. Остановимся на

анализе этих особенностей подробнее.

1. При проведении фотометрических исследований живых систем,

так

же

как

при использовании любых других методов, необходимо учи-

тывать необычайную сложность биологических объектов, для которых

характерна качественная морфологическая и функциональная неодно-

родность, разнообразие медико-биологических параметров и физиологи-

ческих процессов, неоднозначно определяющих его состояние, вероятно-

стный характер поведенческой реакции в ответ на одни и те же внешние

воздействия, то есть весь комплекс свойств, описывающих этот объект

как объект исследований. Все эти свойства проявляются и при фотомет-

рических исследованиях, причем форма проявления специфична для это-

го класса методов.

2. Фотометрические приборы и системы предназначены для опреде-

ления фотометрических параметров (ФМП) и медицинских показателей,

связанных с ФМП функциональными (часто нелинейными) зависимостя-

ми и в итоге характеризующих жизнедеятельность организма. Поэтому и

тгой группе методов при оценке диагностической ценности фотометри-

ческой информации приходится считаться с непрерывно изменяющимся

комплексом факторов, воздействующих на исследуемый объект. Среди

них факторов особое значение имеют индивидуальный разброс фото-

метрических параметров, внутригрупповая изменчивость, генетические

факторы, психофизиологические реакции и т. п.

Сложность выполнения фотометрических исследований связана

тем, что измерительная информация в общем случае заключена в различ-

ных потоках излучения — отраженном, рассеянном, поглощенном, лю-

минесцентном и т. п., одновременная фиксация которых невозможна.

Ыя

каждого потока могут различаться спектральные диапазоны, в кото-

рых должны проводиться измерения. Диапазон изменения интенсивно-

сти регистрируемых потоков, как и диапазон возможных значений фото-

метрических параметров, очень широк при относительно высоком уров-

не шумов как за счет работы других подсистем организма (внутренние

шумы), так

за счет наводимых из внешней среды (внешние шумы); час-

тотный спектр выходных сигналов обычно достаточно широк —

от

обла-

сти инфранизких частот до сотен герц и более.

4. Как уже было отмечено, фотометрические методы основаны на ис-

пользовании малоинтенсивного электромагнитного излучения оптиче-

ского диапазона

спектра.

Однако, несмотря на малые плотности энергии,

•лектромагнитное излучение, падающее на

объект,

оказывает

все

же вли-

иние на процессы, происходящие в нем (нагревание, фотохимические ре-

акции

др.). Подобное влияние связано с поглощением энергии, причем

1акое поглощение в большинстве случаев избирательно. Поэтому при

проведении исследований необходимо учитывать не только интенсив-

ность падающего потока излучения, но и его спектральный состав, так

как при разных спектрах излучения, даже при одинаковом лучистом по-

токе, эффект может быть разным. Особые методические приемы следует

использовать при исследованиях, которым сопутствуют фотохимические

н фотоэлектрические эффекты.

5. Эффект воздействия электромагнитного излучения на биологиче-

ский объект зависит от общего потока энергии излучения, падающего на

него со всех направлений. В связи с этим результат измерений зависит не

только от потока, направленного на вещество, но

от рассеянного потока

излучения, падающего на исследуемый объект от других источников и

отражающих поверхностей, что заставляет использовать различные сред-

ства защиты от посторонней засветки.

6. При исследовании полидисперсных сред необходимо учитывать

отличия в поглощающих свойствах разных дисперсных фаз, которые мо-

гут располагаться на пути распространения лучистого потока и изменять

спектральный состав излучения, падающего на разные слои среды. Неко-

торые среды обладают очень слабым поглощением электромагнитного

излучения в видимой области. Поэтому в биологической практике широ-

ко используются специальные методы окрашивания (в том числе и при-

жизненного), когда краситель избирательно изменяет спектры поглоще-

ния веществ, содержащихся в биотканях. Это позволяет

дальнейшем ис-

пользовать визуальные методы анализа и технические средства измере-

ний, работающие в видимом диапазоне. На результаты анализа

оказывают влияние технология окрашивания, а также тип и физические

характеристики красителя. Так как состав поглотителей (пигментов)

со-

отношение между ними изменяются в широких пределах даже для одного

типа биологического вещества, то необходимо тщательно анализировать

результаты и условия проведения измерений и предусматривать все воз-

можные источники погрешностей.

7. При исследовании живых организмов in

vivo

дополнительные труд-

ности при получении объективных данных связаны с протеканием про-

цессов жизнедеятельности в самом организме. Биологические ткани по-

глощают и рассеивают лучистую энергию, однако принять рассеяние

диффузным можно с определенными допущениями. Для того чтобы рас-

смотреть динамику взаимодействия потока лучистой энергии с тканями

тела, следует учитывать размеры, плотность упаковки и форму. Напри-

мер, для эритроцитов (размеры эритроцитов много больше длины волны

излучения), на поверхности которых в основном происходит рассеяние

света, необходимо учитывать их движение, изменение коэффициента

преломления как внутри самой структуры форменных элементов крови,

так и коэффициент преломления различных структур ткани и целый ряд

других факторов. До настоящего времени не получены решения уравне-

ний, описывающих распространение как направленного, так

диффузно-

го излучения через структуры подобной сложности. Поэтому при рас-

смотрении распространения потока излучения через биологические объ-

екты принимают целый ряд допущений: структуру объекта считают од-

нородной с некоторыми усредненными оптическими характеристиками,

распределение эритроцитов в тканях равномерным, форма эритроцитов

принимается за круглую, поток — неполяризованным, монохроматич-

ным или имеющим достаточно узкий спектральный состав и т. д.

8. Фотометрические исследования биологических объектов целесо-

образно проводить в условиях их реального существования, без ограни-

чения подвижности. В то же время требования повышения помехозащи-

щенности исследований, стабилизации параметров внешних излучений,

ограничения посторонних засветок, методики установки измерительных

преобразователей и необходимость проводной связи с фотометрами не

позволяют обеспечить такие условия.

9. Важнейшее значение

для

фотометрических измерений приобретает

вопрос

единицах измерения. Как известно, система световых эффектив-

ных величин построена на основании кривой видности, отражающей

среднюю относительную спектральную чувствительность глаза челове-

ка. Эта кривая получена экспериментально при изучении зрительного

анализатора человека и принята за эталон Международной комиссией по

освещенности (МКО). Однако эффекты взаимодействия с излучением в

биологических средах, как правило, имеют спектральные характеристи-

ки, существенно отличающиеся от кривой видности. Поэтому использо-

вание световых единиц нельзя считать целесообразным. Введение же

особых единиц, учитывающих особенности поглощения

каждом

из

объ-

ектов, также не оправдано. Таким образом, наиболее удобным является

использование систем лучистых (энергетических) единиц измерения.

Перечисленные особенности заставляют решать многочисленные

проблемы организации фотометрических исследований как методиче-

ского (при разработке практических методов и приемов исследования),

так и технического характера (при разработке аппаратных средств).

Сформулируем лишь некоторые из этих проблем, касающихся техниче-

ской стороны проведения исследований:

— разработка стандартных технологических процедур подготовки

объектов к исследованию;

— разработка специального оборудования, структурных схем и кон-

струкций приборов, позволяющих выполнять измерения любых фото-

метрических параметров с высокой точностью в различных эксперимен-

тальных условиях;

— разработка миниатюрных измерительных преобразователей, ко-

торые можно устанавливать на любые участки кожных и слизистых по-

кровов, вводить внутрь организма;

— анализ влияния различных источников погрешностей на резуль-

тат измерений и разработка инженерных методов расчета характеристик

фотометрических приборов и систем.

4.2. ХАРАКТЕРИСТИКА ФОТОМЕТРИЧЕСКИХ

МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

В основу фотометрических методов исследования положены различ-

ные физические и физико-химические явления, возникающие при взаи-

модействии исследуемой среды с потоками электромагнитного излуче-

ния оптического диапазона. Рассмотрим эти явления подробнее.

Поток лучистой энергии представляет собой электромагнитные вол-

ны, которые можно характеризовать амплитудами и пространственной

ориентацией векторов напряженности электрического (Е) и магнитного

(Н) полей, частотой (v) изменения величин векторов Е и Н и соответству-

ющей ей длиной волны (Я), направлением распространения v, начальной

фазой колебаний

(фо).

Обычно поток излучений, падающий на объект,—

полихроматический, то есть содержит набор электромагнитных волн раз-

ной интенсивности, разных длин волн и начальных фаз. Такой поток

можно характеризовать как интегральными параметрами — лучистым

потоком (Фо), силой излучения (I), излучательной способностью (R) и

т. п., так

спектральными характеристиками, например спектральной ха-

рактеристикой излучения Фо(Х) (для излучающих объектов), отражаю-

щей интенсивность излучения для каждой длины волны

А,

спектральной

характеристикой поглощения

Тп(А,)

(для поглощающих излучение объек-

тов и т. д.). Часто используются монохроматические потоки излучения с

весьма узким диапазоном длин

волн. В

зависимости от ориентации векто-

ров Е и Н и направления распространения волн ^различают неполяризо-

ванный (произвольное направление векторов Е, Н

v) и поляризованный

(векторы Е,

и v взаимно перпендикулярны) потоки излучения. Находят

применение также когерентные излучения — монохроматический поток

лучистой энергии, излучаемый в одной фазе со всех точек поверхности

излучателя.

При взаимодействии излучения с веществом объекта исследования в

последнем возникают физические и физико-химические процессы, при-

водящие к изменению некоторых параметров падающего на объект пото-

ка лучистой энергии: уменьшается амплитуда волн, изменяются фаза и

пространственная ориентация векторов Е, Н или v, уменьшается частота

колебаний.

Но

воздействие оптического излучения на биологические сре-

ды может вызывать

другие—вторичные физические

эффекты:

механи-

ческий —световое

давление;

тепловой, выражающийся в изменении тем-

пературы среды в результате интегрального или селективного поглоще-

ния лучистой энергии; оптические — интерференция, изменения поляри-

зации, спектральных и пространственных характеристик излучения

(фотолюминесценцию, дифракцию, релеевское и комбинаторное рассея-

ние), дисперсия электромагнитных волн, нелинейные оптические явле-

- ния (внутренний и внешний фотоэффекты, фотодиффузионный эффект

Дембера); электрические, например, изменение диэлектрической прони-

цаемости или электрического сопротивления под действием потока излу-

чения и

др.

Многообразны вторичные химические, физико-химические и

биологические эффекты: изменения агрегатного состояния, фотохимиче-

ские реакции, фотоабсорбция, фотосинтез органических веществ в расти-

тельных и биологических клетках и т. п. Для разных компонентов слож-

ных полидисперсных и гетерогенных биосубстратов эти измёнения раз-

личны, что позволяет судить о наличии определенных составляющих и

их концентрации путем измерения параметров потоков излучения после

шимодействия с биосубстратом. Специальные методы освещения ис-

следуемых сред позволяют восстановить пространственное распределе-

ние

дисперсных фаз, оценить параметры твердых включений, микроорга-

низмов и других фрагментов.

В общем случае наблюдаются все виды взаимодействия потока излу-

чения с веществом, но на практике некоторые из преобразованных пото-

ков не учитывают ввиду их малости. Не все из перечисленных эффектов

нашли на сегодня применение в медико-биологической практике, хотя

существующие фотометрические приборы

системы весьма разнообраз-

ны по принципу действия. Их можно разбить на несколько групп с пози-

ций регистрируемых особенностей взаимодействия излучения с вещест-

вом. Далее основное внимание будет уделено тем фотометрическим ме-

тодам, которые нашли широкое применение

физиологических исследо-

ваниях.

4.2.1. Методы фотоабсорбциометрии

Наиболее обширную группу составляют методы исследования опти-

ческих свойств биологических сред по их способности интегрально или

избирательно поглощать излучение определенного спектрального соста-

ма — методы фотоабсорбциометрии.

Процесс прохождения потока излучения через слой вещества харак-

теризуется рядом коэффициентов (рис. 4.1): зеркального отражения

р.1=Ф

/Фо, поглощения а =Ф

/Ф

, рассеянного (диффузного) отражения

=Ф,/Фо, рассеянного (диффузного) пропускания х

Ф2/Ф0,

направлен-

ного пропускания

=Ф

/Ф

. Здесь

— падающий на границу слоя поток

излучения, а

Ф[, Ф2,

Фз, Ф4,

—, Ф

— различные потоки после взаимодей-

ствия со средой. Так как Ф

=Фi +Ф2+Фз

Ф4+-•• +Ф

, то р

+ а + р

+ т

-с

Далеко не все составляющие играют существенную роль. По-

этому различают поглощающие среды, для которых

Ф4=Ф2=0, и

прозрач-

ные среды, для которых ф,=ф

=0.

Так как поглощение и рассеяние в большинстве случаев происходит

селективно, то количественные характеристики определяются или при

монохроматическом излучении или при строго фиксированном спектра-

льном составе лучистого потока. Дифференциальная регистрация погло-

щения или рассеяния в нескольких узких спектральных диапазонах ха-

рактерна для спектрофотометрии и фотоколориметрии. Регистрация ин-

тегрального поглощения по всему спектру излучения осуществляется ме-

тодом абсорбционной фотометрии.

Методы фотоабсорбциометрии

основаны на известном законе Бу-

гера—Ламберта—Бера, описываю-

щем ослабление монохроматиче-

ского излучения длиной волны

к при прохождении слоя поглоща-

ющей среды толщиной 1:

Ф(Х) = ФоМе"****

, (4.1)

Рис. 4.1. Прохождение потока

излучения через вещество

где С — концентрация поглощаю-

щего вещества; е(к) — удельный

показатель поглощения или молекулярный коэффициент экстинкции (по-

гашения).

Если учесть отражение потока излучения на границах слоя, то выра-

жение (4,1) уточняется:

Ф'(Х) =

- р)

Ф(Я.) =

- р)

ФоМе^

, (4.2)

где р — коэффициент отражения.

Известны и другие формы записи этих выражений

Ф(к)

к(А.)1 или lg

Ф (к)

(4.3)

где к(А.)' = Се(к) — коэффициент экстинкции, к(Х) = к'(Х)/2,303.

Закон Бугера—Ламберта—Бера справедлив для нелюминесцирую-

щих веществ, для которых показатели поглощения и отражения остаются

постоянными при изменении освещенности. Биологические среды могут

содержать фотолюминесцирующие пигменты; для таких сред этот закон

нарушается.

Оптические свойства среды оцениваются с помощью двух коэффици-

ентов, определяемых с помощью одного из выражений (4.1), (4.3):

коэффициента пропускания — Ю

-0

^';

оптической плотности — D(A) = lg(l/x(X.)).

Важным свойством последнего параметра является его ад дитивность —

суммарная оптическая плотность

(A.)

смеси п, химически не реагирую-

щих между собой веществ, равна сумме оптических плотностей компо-

нентов Dj(^):

1=1

(4.4)

При облучении слоя вещества полихроматическим излучением в диа-

пазоне -

Я.2

интенсивность падающего лучистого потока определяется

как

= |ф

(№,

где ФсД) — спектральная характеристика излучения источника.

Интегральный коэффициент пропускания среды в этом случае можно

рассчитать с помощью выражения:

т =

|ф

(Ь)т(Ь)с& / |ф

(№

J/ U

где т(А.) — спектральный коэффициент пропускания.

Аналогично можно записать выражения для коэффициентов рассея-

ния Рр(А), отражения р

(Я.) и поглощения а(Х). Так как для разных ве-

ществ х(к), р(Х), а(к) различны, то, регистрируя эти спектральные рас-

пределения, можно оценивать наличие тех или иных веществ

среде.

Наиболее простым способом фотометрических исследований можно

считать однолучевой метод, при использовании которого оптические

свойства биологической среды оцениваются по интегральному коэффи-

циенту пропускания т=Ф/Фо=Ш, где U — амплитуда сигнала на выходе

фотоэлектрического преобразователя (ФЭП); к — коэффициент пропор-

циональности (см. рис. 4.2, а). Для повышения точности измерений необ-

ходимо стабилизировать интенсивность потока Фо, тогда сигнал U будет

пропорционален значению т.

Добиться высокой точности с помощью однолучевого метода не уда-

стся из-за влияния многих факторов случайной природы (внешняя засвет-

ка, способ подготовки объекта к исследованию, вариации свойств самого

биологического объекта и т. д.) на результат эксперимента. На практике

повышение точности можно получить за счет постоянного контроля ин-

тенсивности источника излучения и учета его изменений при определе-

нии т. Это достигается в двухлуЧевом методе фотоабсорбциометрии за

счет подключения выходов фотоэлектрических преобразователей (их не-

обходимо иметь уже

два-

один — для контроля

а другой — для измере-

н ия интенсивности потока Ф) (рис. 4.2, б) к схеме вычисления отношения

ФЭП1

Выход Выход

Выход

Рис. 4.2. Методы исследования оптических свойств вещества

двух сигналов (Д) — T*=k'Ui/U

, где U

и U

— выходные сигналы ФЭП,

и ФЭПг, к'— коэффициент пропорциональности.

В медико-биологической практике нашел применение и другой двух-

лучевой метод фотоабсорбциометрии, в котором также используются два

фотоэлектрических преобразователя, однако один из них является изме-

рительным для исследуемой среды, а другой — тоже измерительным, но

для среды сравнения, для которой оптические свойства хорошо известны

(рис. 4.2, в). Этот вариант компенсационной схемы измерений позволяет

исключить влияние многих факторов, влияющих на точность фотометри-

ческих исследований [6, 10]. Оптические свойства исследуемой среды

при этом оцениваются с помощью различных фотометрических парамет-

ров, например .

к=(Ф

-Фк)/Фэ или К=(Ф

- Ф

)/(Ф

+ Ф

где Ф

— эталонный поток, прошедший среду сравнения; Ф

— поток,

прошедший исследуемую среду.

Для определения концентрации С поглощающего вещества в среде

используется монохроматическое излучение. При этом удобно восполь-

зоваться оценкой оптической плотности среды, так как

D=lg( 1 /Т)=СЕ(А,)1,

• де

v.(X)—показатель поглощения — объективная характеристика погло-

I и геля

излучения, известная заранее.

Для удобства пересчета выходного фотометрического параметра в

шачение концентрации часто используется калибровочный график, а для

повышения точности определения концентрации фотометрические изме-

рения стараются выполнять в области максимального поглощения. Недо-

га

точная монохроматичность излучения и ряд других причин могут на-

рушить закон прямой пропорциональности между оптической плотно-

с гью

и концентрацией поглотителя. В таких случаях строят калибровоч-

ную кривую с помощью эталонных растворов заданной концентрации и с

се помощью определяют концентрацию поглотителя в исследуемой сре-

де.

При анализе многокомпонентных сред наиболее выгодным представ-

'чстся случай, когда полосы поглощения отдельных компонентов не пе-

рекрываются. Анализ каждого компонента выполняют в области харак-

I ерного поглощения. Труднее осуществить анализ сложного раствора

при перекрывающихся полосах поглощения. В этом случае приходится

намерения проводить на нескольких длинах волн

решать соответствую-

щую систему уравнений типа (4.4) [10]. Избежать подобной процедуры

можно, например, с помощью дополнительных химических реакций,

приводящих к образованию специфических хромофоров, для которых и

проводятся фотометрические исследования.

Для исследований пригодны не только среды, обладающие характер-

ным спектром поглощения, но и вещества, которые в результате реакций

с другими дают новые соединения со специфическими спектрами погло-

щения. Анализ спектра новых соединений позволяет установить количе-

i гпенные соотношения для исходных биосубстратов. Этот методический

прием лежит в основе разработанных методов окрашивания исходного

субстрата.

Изменения спектрального распределения потока излучения зритель-

но соответствует появлению цветовых отличий. Цветовые оттенки по-

нерхностей кожи, слоев биотканей, жидкостей, изменения окраски при

различных реакциях являются характерными признаками многих биофи-

шческих процессов, протекающих в организме.

Визуальные оценки окраски субъективны, не дают количественных

показателей, поэтому на практике используют инструментальные мето-

U.I

измерения цвета, основанные на законах колориметрии. В методе фо-

юколориметрии используются несколько оптических фильтров (чаще

неего

два или три) с заданными спектральными характеристиками пропу-

скания,

особенности спектров пропускания исследуемых сред оценива-

ются с помощью параметров — коэффициентов, характеризующих отно-

сительную долю энергии того или иного спектрального диапазона в резу-

льтирующем излучении. Например, для двухфильтровой (двухцветной)

фотоколориметрии оптические свойства среды оцениваются по любому

из следующих соотношений:

m=U,/(U,+U

); n=U

/(U,+U

); h=U,/U

; K=(U

- U,)/(U,+U

), (4.5)

где Ц; i=l,2 — амплитуды электрических сигналов на выходе ФЭП при

установке на пути излучения одного из двух оптических фильтров со

спектральной характеристикой пропускания Тф(Х), при этом амплитуда

i-ro сигнала связана со спектральными характеристиками пропускания

фильтра и исследуемой среды т(к) следующим образом:

;

= к }ф

(к)х

ф1

(X)x(X)dX.

Аналогичные соотношения легко получить и для трехфильтровой

(трехцветной) фотоколориметрии. Как следует

из

выражения (4.6), значе-

ния амплитуд сигналов, а следовательно, и оценочных коэффициентов

(выражения (4.5)) зависят от спектрального оостава потока источника из-

лучения Фо(Х), поэтому для получения однозначности и

сопоставимое! и

результатов измерений его необходимо оговаривать.

Фотоабсорбционный анализ проводится как в видимой области спек-

тра, так и в других областях. Известны подобные исследования в области

инфракрасного и ультрафиолетового излучений, а также исследования в

широком диапазоне, охватывающем весь оптический диапазЬн электро-

магнитного излучения; для всех диапазонов возможны и спектрозональ-

ные («колориметрические») измерения.

Все сказанное распространяется и на методы фотоабсорбциометрии,

в основе которых используются потоки излучения, отражаемые исследу-

емой средой — методы денситометрии.

Кроме рассмотренных широкое распространение в медико-биологи->

ческой практике получили и другие методы фотоабсорбциометрии, свя-

занные с дополнительными процедурами воздействия на исследуемые;

среды. Например, для атомно-абсорбционной спектрофотометрии необ-

ходим предварительный перевод исследуемой среды в атомарное состоя-

ние. Это исследование проводится уже не на самом организме, а в анали-

тических лабораториях на биопробе—веществе биосубстрата, взятого из

внутренней среды организма.

Для аналитических исследований известно большое разнообразие

спектрофотометрических методов, так как на биопробу можно воздейст-

вовать разными способами и более детально изучать ее свойства. Оценка»

состава и концентрации компонентов в биологических средах с их помо-

щью производится на основании анализа оптических спектров излуче-

ния, поглощения и рассеяния потоков лучистой энергии.

Спектральный анализ делится на

три вида:

атомно-эмиссионная спек-

грофотометрия, которая регистрирует спектр, характеризующий светя-

щиеся пары вещества (сюда относится и метод пламенной фотометрии),

абсорбционная спектрофотометр™, изучающая спектр поглощения излу-

чения, спектральный анализ по спектрам комбинационного рассеяния

(»ффект комбинационного рассеяния Рамана—Ландсберга—Мандель-

штама) и т. п. В практике клинических исследований спектральный ана-

лиз нашел отражение в методах витальной спектрофотометрии, исполь-

мвание которого стало возможным в результате применения волоконной

оптики, полупроводниковых светоизлучающих и фоточувствительных

члементов, «Прижизненной» микроскопии. С этими методами можно по-

знакомиться

специальной литературе

по

аналитическим исследованиям

|24, 25].

4.2.2. Нефелометрический

и турбидиметрический методы

•«'• При выборе спектральных областей

для

фотоабсорбционного анализа

необходимо считаться с возможностью ослабления излучения за счет све-

юрассеяния. Фотоабсорбционные методы могут считаться вполне кор-

ректными только для биологических сред и спектральных областей, для

которых не происходит заметного светорассеяния. В то же время биоло-

гическим средам присущи свойства

не

только поглощать, но и рассеивать

падающее на них излучение, причем рассеяние увеличивается с увеличе-

нием размеров частиц в среде и уменьшением длины волны излучения.

Многие биологические среды (например, биологические жидкости), со-

держащие клеточные включения и большое количество макромолекул,

относятся к классу так называемых мутных сред и отличаются низкой и

сильно варьируемой прозрачностью.

Для частиц, диаметр которых соизмерим с длиной волны излучения,

ноток рассеяния Ф

, согласно уравнению Релея, увеличивается обратно

пропорционально четвертой степени длины волны

= Фо

п, -п

,, ,„.

(1+cos Р)

п, X г

4 _ 2

(4-7)

где

П|

— коэффициенты преломления частиц и среды;

— концент-

рация рассеивающих частиц;

— объем частицы;

— расстояние до на-

олюдателя; р — угол между падающим и рассеянным потоками.

Количественный анализ, основанный на регистрации параметров рас-

сеяния, осуществляется методами нефелометрии и турбидиметрии. Пер-

вый из них основан на измерении интенсивности лучистого потока, рас-

сеянного частицами среды, а второй — регистрирует поток, прошедший

среду,

которой содержатся поглощающие

рассеивающие частицы.

При нефелометрических измерениях величины П|, n

, г и р остаются

постоянными, поэтому выражение (4.7) можно записать в виде

=Ф

кСУ

/ X

где к — коэффициент пропорциональности.

Тогда для коэффициента рассеяния р

получаем

=Фр/Ф

=кСУ

откуда легко рассчитать значение С.

Данный метод позволяет определять небольшие концентрации взве-

шенных в исследуемой среде частиц, трудно поддающихся учету други-

ми методами. Однако нефелометрическому методу присущи недостатки.

Это прежде всего влияние на интенсивность рассеянного потока разме-

ров, формы и пространственного угла положения (по отношению к на-

правлению падения излучения) частиц.

При турбидиметрических измерениях интенсивность прошедшего

потока Ф

может

быть

определена с помощью выражения Ф

= Фс£~

\ где

ее

— показатель ослабления (мутности), учитывающий как поглощение,

так

рассеяние. Показатель ослабления к пропорционален концентрации

взвешенных частиц, поэтому для определенных диапазонов концентра-

ций оказывается справедливым выражение

(Ф

/Ф

) =

«1

= kCl = lg(l/T

где т

=Ф

/Ф

— коэффициент мутности среды; к — удельный (моляр-

ный) показатель ослабления излучения.

Практическое применение этих двух методов требует тщательной ме-

тодической проработки вопросов подготовки исследуемых сред и обес-

печения их устойчивости, способов подведения и отведения потоков лу-

чистой энергии

и т.

п. На оптические свойства сред влияют соотношения

между концентрациями дисперсных фаз, порядок

скорость их смешива-

ния, стабильность дисперсных фаз, температура, наличие посторонних

примесей и т. д.

4.2.3. Люминесцентная фотометрия

Все большее признание в клинико-лабораторной практике занимает

люминесцентная фотометрия, основанная на способности молекул ряда

исществ, при определенных условиях, испускать электромагнитное излу-

чение оптического диапазона спектра. Методы люминесцентной фото-

метрии отличает высокая чувствительность и специфичность, что позво-

ляет регистрировать очень малые количества определенного вещества

среди большого их разнообразия. Методики выполнения исследований

относительно просты, позволяют быстро получить конечный результат, и

ночтому люминесцентная фотометрия может использоваться в качестве

•>кс пресс-метода.

В практике медико-биологических исследований нашли применение

два явления, сопровождающиеся люминесценцией:

— хемолюминесценция — свечение вещества под влиянием энергии

химических процессов;

— фотолюминесценция — свечение под действием поглощенной

жергии коротковолнового диапазона спектра (ближней ультрафиолето-

иой или сине-фиолетовой областей).

Физический смысл явления люминесценции состоит в излучении из-

лишка энергии возбужденными молекулами вещества в виде преобразо-

ианной лучистой энергии. Люминесценция характеризуется спектром из-

лучения и интенсивностью, которые Зависят от энергии и длины волны

по

буждающего излучения, концентрации люминесцирующего вещества

—

флуорофора, температуры, наличия примесей

других факторов.

Энергия свечения при хемолюминесценции черпается из запабов хи-

мической энергии реагирующих веществ. При фотолюминесценции ис-

пользуется энергия внешнего источника лучистой энергии. Преимущест-

ном последнего варианта является независимость спектра люминесцен-

ции от длины волны Поглощенного излучения, что очень важно

удобно

для аналитических целей (рис. 4.3, а). Зависимость спектра люминесцен-

б)

400

500 600 Х,мм 100 300 500 Х,мм

Рис. 4.3. Спектральные характеристики поглощения П и люминесценции JI (а) и

мшисимость выхода люминесценции от длины волны возбуждающего излучения (б)

ции от длины волны возбуждающего излучения появляется при наличии

в исследуемой среде двух и более флуорофоров (рис. 4.3, б).

Количественно процесс люминесценции описывается энергетиче-

ским Е и квантовым р выходами. Для количественного анализа результа-

тов исследований используется значение энергетического выхода люми-

несценции Е, определяемого через отношение энергии люминесценции к

энергии возбуждения, поглощенной в веществе

/Ф

= Е = (Ф

/Ф

)(

- т

), (4.8)

где Ф

— интенсивность люминесценции; Ф„ — интенсивность погло-

щенного излучения; Ф

— интенсивность возбуждающего излучения;

— коэффициент пропускания при люминесценции, а связь между р и Е

устанавливается выражением

E=pVv,„

где

V,,

— частота излучения люминесценции;

v„

— частота поглощенного

излучения.

В области малых концентраций, представляющей непосредственный

интерес для медико-биологических исследований, (|-х

)«1. Тогда из

(4.8) следует, что Ф

Фо,

поэтому при малых поглощениях спектр воз-

буждения по

форме

должен совпадать со спектром поглощения люминес-

цирующего вещества. Кроме того, для величины энергетического выхода

становится справедливым выражение

Е = т

С1 = Ф

(1—т

)/Ф

, (49)

где ш

— удельный показатель люминесценции;

— концентрация фл у-

орофора; 1 — толщина слоя исследуемой среды.

Выражение (4.9) позволяет проводить количественный анализ малых

объемов флуорофора по данным регистрации энергетического выхода

люминесценции. Некоторые соединения, образующиеся в результате хо-

рошо изученных химических реакций, являются

то же время эффектив-

ными флуорофорами, использование которых позволяет во много раз по-

высить чувствительность определения ряда веществ. При концентрациях

выше Ю

-4

-ь 10~

г/мл выход люминесценции начинает уменьшаться и за-

тем падает до

нуля.

Этот эффект называют концентрационным гашением.

Особо следует выделить методы оценки концентрации светящегося

вещества путем титрования веществом-гасителем люминесценции, а так-

же при реакциях нейтрализации с флуоресцирующими веществами, вы-

ступающими в качестве индикаторов. Получил также распространение

качественный люминесцентный анализ, при котором изучаются специ-

фичность форм кривых и расположение максимумов в спектре люминес-

ценции.

4.2.4. Рефрактометрия

Основу рефрактометрического анализа составляет определение пока-

чателя преломления исследуемой среды. Если сфокусированный поток

шергии — луч — переходит границу двух сред, то вследствие эффекта

преломления изменяется его направление. Отношение синуса угла паде-

ния (а) к синусу угла (Р) его преломления характеризует показатель (ко-

»ффициент) преломления: п = sina/sinp. Угол падения, при котором

«ипа=1 (луч скользит по поверхности раздела), называется углом полного

инутреннего отражения — а'.

Для рефрактометрического анализа обычно объект исследования пе-

(кчюдится в жидкую фазу (чаще всего это растворы), а для количествен-

ного анализа используются различные физические явления.

1. Зависимость угла а' от показателя преломления среды.

Как следует изопределеиия

п,

при sinp=l a'=arcsin(l/n). Следователь-

но. зная а', легко определить величину показателя преломления п. Для

п -1,3

ч-

1,9 точность его измерения достигает величины Ю

-4

2. Преломление луча в призме (спектрометрическая рефрактомет-

рия).

Призма выполняется из контролируемой среды, а для определения

коэффициента преломления используется зависимость показателя от

длины волны излучения.

3. Интерференция лучей.

Используются две среды с разными коэффициентами преломления;

одна из них является эталонной. Если два луча от одного источника про-

пустить через различные преломляющие среды одинаковой толщины с

показателями преломления ni и

то после прохождения сред для разных

лучей будет наблюдаться некоторая разность потенциалов. При одновре-

менном наблюдении лучей можно получить интерференционную карти-

ну. причем 2А.=(П| - п

)1, где

— длина интерферирующей волны. При

помещении на пути следования одного из лучей слоя исследуемой среды

происходит сдвиг интерференционных полос, который пропорционален

разности величин показателей преломления. Зтот метод позволяет фик-

i ировать очень небольшие (не более чем на 0,01) изменения или отличия

и показателях преломления.

4. Зависимость отношения интенсивности отраженного и преломлен-

ного потоков на границе раздела сред от показателя преломления.

а) б)

Компонент В

Рис. 4.4. Пример калибровочной кривой для рефрактометрического определения

уровня сахара (а) и диаграмма для рефрактометрического анализа тройной

системы (б)

Отношение потоков Ф

от

(отраженного) и Ф„ (преломленного) на гра-

нице раздела сред ш = Ф

т/Ф

= f(n), где п — показатель преломления

контролируемой среды. При достаточной стабильности падающего пото-

ка можно регистрировать только отраженный поток, который будет нести

информацию о физико-химических свойствах исследуемой среды.

5. Фокусирующее действие контролируемой среды.

Если луч проходит из среды более преломляющей в среду менее пре-

ломляющую, то угол падения оказывается меньше угла преломления.

Этот эффект используется в методе фокусирующей рефрактометрии, где

в качестве фокусирующих устройств используются стеклянные камеры,

наполненные контролируемой средой.

Показатель преломления зависит от многих факторов — длины вол-

ны,

температуры, давления. Поэтому, чтобы исследовать зависимость по-

казателя преломления от состава вещества, используется величина моле-

кулярной рефракции

R = М(п

- 1)/[о(п

+ 2)] ,

где М — молекулярная масса вещества; и — его плотность.

Этот параметр зависит только от природы вещества. Важным свойст-

вом молекулярной рефракции является ее аддитивность — общая реф-

ракция смеси веществ равна сумме рефракций компонентов. При непо-

средственных измерениях показателя преломления двойных систем (сре-

ды, содержащие только две компоненты, например раствор исследуемо-

го вещества содержит растворитель и растворенное вещество)

используются калибровочные графики (рис. 4.4, а), а при большем коли-

честве компонентов (многокомпонентных систем) — диаграммы

(рис. 4.4, б).

4.2.5. Методы изучения

оптически активных веществ

Оптически активными веществами считаются те, которые при опре-

деленных условиях и в отсутствие внешних воздействий способны изме-

нять плоскость поляризации излучения. Известен ряд физических явле-

ний, которые могут вызывать такие изменения:

— изменение плоскости поляризации при взаимодействии поляризо-

ванного монохроматического излучения со средой;

— изменение плоскости поляризации для разных длин волны излу-

чения;

— изменение плоскости поляризации в присутствии внешнего маг-

нитного поля (метод магнитного вращения);

— изменение коэффициентов поглощения в исследуемой среде, по-

мещенной в продольное магнитное поле, для лево- и правоциркулирую-

щего излучения (эффект оптического кругового дихроизма);

— изменение скорости распространения излучения, поляризованно-

го по кругу вправо и влево (эффект кругового двулучепреломления)

и т.д.

Не все из этих эффектов нашли применение

клинической практике.

11аибольшее распространение (в аналитических лабораторных исследо-

паниях) получил поляриметрический метод, основанный на анализе оп-

нческой активности вещества исследуемой среды

по

изменениям враще-

ния плоскости поляризации внешнего излучения. Угол поворота плоско-

сти b является основным информативным показателем b =

©С1,

где © —

удельная вращательная способность вещества, зависящая от длины вол-

ны, на которой производится измерение; С — концентрация активной

иещества, типа растворителя, длины волны, температуры, то при измере-

ниях тщательно оговариваются условия эксперимента. Для двухлучевой

схемы измерений коэффициент оптической активности можно рассчи-

шть с помощью следующего выражения:

-Ф

)/(Ф

где

Ф|

Фг—интенсивности соответствующих

потоков

излучения.

Чувствительность метода достигает значений 0,001. В клинико-фи-

шологических исследованиях этот метод, как и другие методы выявле-

ния оптически активных компонент

веществ, еще не

получил распростра-

нения ввиду отсутствия необходимого технического оснащения.

Арсенал фотометрических методов исследования оптически актив-

ных веществ постоянно расширяется, совершенствуются известные ме-

шды, создаются новые, в том числе использующие более сложные опти-

ческие эффекты, например регистрацию оптических спектров действия,

связанных с регистрацией изменений физико-химических параметров

среды — электропроводности, потенциала, парциального давления кис-

лорода и т. п. под влиянием излучения; оптическую голографию, элект-

ро- и магнитооптические эффекты и др. Более детальный анализ физиче-

ских основ перечисленных и других методов фотометрических исследо-

ваний можно найти в известной литературе [10, 24, 26] и др.

4.3. ФОТОМЕТРИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

В КЛИНИКО-ДИАГНОСТИЧЕСКИХ

ИССЛЕДОВАНИЯХ

Широкое распространение фотометрических методов в клинической

и биологической практике объясняется тем, что они позволяют создавать

как сложные системы для тончайшего анализа различных сред, так и про-

стые, компактные

дешевые приборы, которые измеряют целый ряд важ-

нейших медико-биологических показателей, характеризующих свойства,

состав или концентрацию отдельных компонентов сложных биосубстра-

тов и жидкостей [6, 26] и др.

Особенно многочисленна группа фотометрических приборов и сис-

тем, используемая в аналитических лабораториях, где с их помощью уда-

ется провести анализ различных биосубстратов и определять концентра-

цию практически всех биологических веществ. Например, при анализе

сыворотки крови методами фотоабсорбциометрии определяется содер-

жание глюкозы, общего белка, холестерину, билирубина, щелочной фос-.

фатазы, аламинаминтрансферазы и других веществ. Нефелометрические

приборы находят применение для определения мутности воды при вы-

браковке лекарств и напитков, в пылемерах и счетчиках взвешенных час-

тиц. Абсорбционная спектрофотометрия, относясь к так называемый

«щадящим» аналитическим методам, позволяет изучать элементарные

низко- и высокомолекулярные компоненты биожидкостей, выявлять

спе~>

цифические энергетические меж- и внутримолекулярные взаимодейст*

вия. Методами количественного люминесцентного анализа успешна

определяются концентрация катехоламинов, стероидов, эстрогенов, се-

ротонина и фенилаланина в плазме крови и моче, витаминов В

(

, В

, маг?

ния и других элементов в различных биожидкостях. Использование спе-

циальных флуорохромов и люминесцирующих сывороток обеспечивает

высокую чувствительность и специфичность люминесцентной фото мет*

рии при цитологических и иммунологических исследованиях, в частно-

сти для диагностики злокачественных новообразований, туберкулеза и,

других заболеваний, идентификации микроорганизмов, контроле вакциН

сывороток, загрязненности воды органикой, определении содержания

иоде клеток фито- и зоопланктона и

др.

Так как большое число органиче-

ских соединений принадлежит к оптически активным веществам (напри-

чер. стероиды, нуклеиновые кислоты, белки, полипептиды, углеводы,

пи

менты и др.), то предпосылки широкого использования имеют поля-

рометрические методы.

Более сложные методические проблемы приходится решать при вы-

полнении клинико-физиологических исследований, когда изучение жи-

вого организма должно производиться в нормальных физиологических

условиях для его функционирования или в условиях, максимально при-

ближенных

к ним.

Кроме того, определение ряда параметров жизнедеяте-

и.ности организма возможно только такими методами, которые не нару-

шают целостности кожного или слизистого покрова.

Фотометрические методы для подобных условий исследования име-

ни существенные преимущества по сравнению с другими физическими и

Ьичико-химическими методами. Измерение параметров кровообращения

неличина и частота объемного пульса, давление крови и др.) и характе-

ристик микроциркуляции крови, определение концентрации связанного

углекислого газа в крови и степени насыщения крови кислородом, оценка

ч-удистых реакций и обменных процессов, другие исследования могут

"1.1 гь

выполнены путем регистрации интенсивности потоков электромаг-

нитного излучения оптического диапазона спектра после их взаимодей-

ствия с тканями живого организма.

Однако, прежде чем рассматривать конкретные фотометрические ме-

К1ды,

нашедшие применение в клинической практике, остановимся на ха-

рактеристике тех объектов, с которыми приходится иметь дело при их

выполнении.

4.3.1. Биологические объекты

фотометрических исследований

Основные объекты фотометрических исследований в клинической

практике связаны с изучением оптических свойств кожных и доступных

слизистых покровов. Кожа и слизистые оболочки не только осуществля-

Mtr барьерную функцию, отделяя организм от внешней среды, но и вы-

полняют ряд других функций. Среди них — терморегуляционная, секре-

юрная, экскреторная, дыхательная. В этих оболочках протекают биохи-

мические процессы, обеспечивающие обмен веществ, они являются орга-

нами чувств, обеспечивая болевую, тактильную, температурную чувств-

ительность. Эти структуры не только реагируют на различные внешние

фикторы, но и весьма чутко отзываются на изменения во всех органах и

i истемах целостного организма, находясь в постоянной и динамической

i вязи

и с

окружающей внешней средой, и с внутренними структурами ор-