Основы экотоксикологии. Методические указания к выполнению лабораторного практикума

Подождите немного. Документ загружается.

осадков сточных вод и отходов, содержащих смеси ве-

ществ), вызывающую гибель 50% и более тест-организмов

(ЛК

50-96

, ЛКР

50-96

);

• безвредную (не вызывающую эффекта острой токсич-

ности) концентрацию отдельных веществ (кратность раз-

бавления вод или водной вытяжки из почв, осадков сточ-

ных вод и отходов, содержащих смеси веществ), вызы-

вающую гибель не более 10% тест-организмов (БК

10-96,

БКР

10-96

Приготовление водной вытяжки из почв

Отобранные на токсикологический анализ почвы сна-

чала разрыхляют вручную металлическим шпателем и ос-

вобождают от материала, заведомо относящегося к ино-

родным (случайным) механическим включениям (возмож-

ные промышленные, строительные бытовые отходы и т.п.),

а также галечника, обломков камней, корневищ, веток. Ре-

шение об изъятии таких включений из подготавливаемой

пробы принимают на основе изучения полевого описания

конкретного места ее отбора; эти сведения должны являть-

ся обязательной частью сопроводительной документации к

пробам, направленным на токсикологический анализ.

Перед биотестированием пробы просеивают сквозь

сито с размером ячей 1 мм и доводят до воздушно-сухого

состояния. Для чего пробу подсушивают в вытяжном шка-

фу или в хорошо проветриваемом помещении, размещая ее

(в зависимости от массы и естественной влажности в стек-

лянных кристаллизаторах подходящей вместимости, на

стекле или на чистых листах из плотной бумаги.

Размещенные таким образом пробы почвы выдержи-

вают открытыми не менее 2-х ч при комнатной температу-

ре и влажности воздуха (ГОСТ 5180-84 "Грунты. Методы

лабораторного определения физических характеристик").

Подготовленную пробу распределяют на ровной поверхно-

сти слоем толщиной не более 1 см и отбирают ложкой или

шпателем из 5-ти точек методом конверта. Не допускается

предназначенные для исследования на токсичность пробы

почв подвергать тепловой обработке, поэтому гигроскопи-

ческая влажность почвы определяется в отдельном образ-

це.

Проба с массой приблизительно 400 г делится на две

равные части: для биотестирования и для определения гиг-

роскопической влажности после высушивания до постоян-

ной массы, что необходимо для пересчета воздушно-сухой

пробы на массу абсолютно-сухой по формуле:

∆М

возд.сух.

= ∆М

абс.сух.

/К

ср

, (1)

где ∆М

возд.сух

— масса абсолютно-сухого образца, г;

∆М

возд.сух

— масса воздушно-сухого образца почвы, г; К

ср

— коэффициент пересчета массы воздушно-сухой пробы

на массу абсолютно-сухой (среднее расчетное значение из

трех измерений).

Для определения массовой доли почвы в воздушно-

сухой пробе необходимо:

1. Взвесить три пустых высушенных бюкса с крыш-

ками и зафиксировать их массы (Мо

), затем взвесить эти

же бюксы с навесками воздушно-сухой пробы (около 1 г) и

зафиксировать их массы (М

возд.сухi

.).

2. Установить открытые бюксы с воздушно-сухими

пробами в сушильный шкаф. После выдержать в сушиль-

ном шкафу в течение 3 ч при температуре от 105 до 115 °С.

Закрыть бюксы притертыми крышками, перенести их в эк-

сикатор и выдержать там до полного остывания (около 40

мин). Взвесить бюксы с навесками абсолютно-сухой пробы

и зафиксировать их массы (M

а6c.cyx.i

). После взвешивания

пробы почвы следует повторно высушить в течение 2 ч,

затем охладить в эксикаторе и снова взвесить. После пер-

вого и второго высушивания допустимое расхождение в

массе не должно превышать 0,005 г. В противном случае

высушивание повторить. Точность взвешивания для всех

экспериментов должна составлять 0,001 г.

3. Рассчитать значения коэффициента пересчета К

для каждого эксперимента по формуле:

= (M

а6c.cyx.i

- М

оi

) / (M

возд.cyx.i

- М

оi

), (2)

где Кi — коэффициент пересчета в i-том измерении;

абс

cyxi

— масса бюксы с абсолютно сухим образцом в i-М

измерении, г; M

возд.cyx.i

— масса бюксы с воздушно-сухим

образцом в i -м измерении, г; M

— масса пустой бюксы в

i-м измерении, г.

4. Так как по результатам измерений получено три

значения коэффициента, производят расчет его среднего

значения (К

ср

) по формуле:

ср

= (К

+ К

) / 3. (3)

Далее среди трех величин K

рассчитывают размах (R)

полученных значений с учетом максимальной (Кмах) и

минимальной (Kmin) величин по формуле:

R = (Кмах – Kmin) / К

ср

* 100%. (4)

Если полученное значение R > 10 %, то эксперимент

повторяют, устранив причины удовлетворительных ре-

зультатов.

Водную вытяжку из почвы для биотестирования го-

товят в соотношении: 1 часть почвы (с учетом гигроскопи-

ческой влажности) и 4 части культивационной воды (до-

пускается использование дистиллированной воды). Вода не

должна содержать СО

, так как в его присутствии раство-

ряются карбонаты кальция и магния по причине образова-

ния растворимых бикарбонатов, которые увеличивают су-

хой остаток и общую щелочность водной вытяжки и тем

самым искажают результаты биотестирования.

Для приготовления водной вытяжки из почвы отве-

шивают 100—200 г пробы почвы в воздушно-сухом со-

стоянии, пересчитав ее массу на массу абсолютно-сухой.

Масса пробы на стадии перед приготовлением водной вы-

тяжки должна быть достаточной для получения необходи-

мого объема экстракта при проведении биотестирования во

всех предполагаемых разведений с учетом контрольных

испытаний. Навеску почвы помещают в колбу емкостью

1000 см

и приливают 4-кратное количество культиваци-

онной воды.

Далее на аппарате для встряхивания жидкости полу-

ченную смесь в течение 2-х ч встряхивают, после чего от-

стаивают в течение 30 мин. Надосадочная жидкость сифо-

нируется, а затем профильтровывается через бумажные

обеззоленные фильтры («белая лента») или через мембран-

ные фильтры с диаметром пор 3,5 мкм (фильтры предвари-

тельно промывают и кипятят в дистиллированной воде не

менее 10 мин). Бумажный фильтр помещают в воронку

Бюхнера диаметром 15—20 см.

Перед тем как вылить вытяжку на фильтр, содержи-

мое склянки или колбы встряхивают, чтобы взмутить при-

сутствующие взвешенные частицы почвы. На фильтр ста-

раются перенести всю взвесь. При выливании струю сус-

пензии направляют на боковую двойную стенку бумажного

фильтра, но не на дно фильтра, так как при выливании на

дно, бумага может легко порваться. Фильтрация осуществ-

ляется с помощью вакуумного водяного или электрическо-

го насоса. Для фильтрации применяется слабый вакуум (не

более 20 мм рт. ст.). Первые порций фильтрата часто бы-

вают мутными, и их нужно несколько раз перефильтровать

до прозрачного раствора. При повышенной мутности вод-

ной вытяжки из почв (гумусированные, дерново-

подзолистые, торфяные и др. почвы) допускается отстаи-

вание в холодильнике до 5 сут. Затем жидкость над осад-

ком сифонируется. Вытяжка из почв должна иметь; вели-

чину рН в диапазоне 7,0-8,2. При необходимости вытяжку

перед серийным разбавлением предварительно нейтрали-

зуют. После нейтрализации пробы аэрируют 10—20 мин

для стабилизации рН. Непосредственно перед началом

биотестирования пробы доводят до температуры 20 ± 2°С.

Биотестируемая проба водной вытяжки из почв должна

иметь концентрацию растворенного кислорода не ниже 6

мг/дм

, в противном случае пробу аэрируют.

Приготовление разведений водной вытяжки для био-

тестирования проводят как при приготовлении разбавле-

ний исследуемых вод для биотестирования.

Приготовление водной вытяжки из осадков сточных

вод, отходов

Водная вытяжка из осадков сточных вод и отходов

готовится из соотношения твердая фаза : жидкость, равно-

го 1 : 10. В качестве жидкости используется культивацион-

ная вода (допускается использование дистиллированной

воды).

Твердые отходы и осадки сточных вод. Проба тща-

тельно перемешивается перекатыванием на гладкой, гиб-

кой и плотной подстилке, затем — совком. Для подготовки

пробы отходов требуется 2,5 кг пробы осадков сточных вод

— 1 кг. Общий объем отобранной пробы (5 кг отходов или

2 кг осадков) делится на представительные половины, одна

из частей возвращается в сосуд для хранения, оставшаяся

часть разрыхляется и тщательно просматривается. В случае

обнаружения частиц более 10 мм их осторожно измельча-

ют с помощью металлического шпателя до размера менее

10 мм. Не допустимо механически размалывать смесь. За-

тем проба высушивается до воздушно-сухого состояния.

При плохом высыхании отхода экспозицию высушивания

допускается увеличивать до 24 ч.

После этого проба сокращается в 3-4 раза методом

квадратирования. Тщательно перемешанную пробу разрав-

нивают на гладкой ровной поверхности на крафт-бумаге,

клеенке или полиэтиленовой пленке и с помощью линейки

или специальной решетки делят на равные квадраты. Затем

из квадратов в шахматном порядке отбирают порции,

обеспечивая захват всей толщины слоя, и, объединяя пор-

ции в пробу с минимальной абсолютно-сухой массой 200 г

представительной пробы, которая делится на две части и

предназначается для биотестирования и определение

влажности. Влажность осадков и отходов определяется по

п. «Приготовление водной вытяжки из почв». Измеренная

характеристика влажности используется для расчета массы

воздушно-сухой пробы, предназначенной для приготовле-

ния водной вытяжки. Обычно требуется 120-200 г воздуш-

но-сухой массы пробы. После выщелачивания 100 г абсо-

лютно-сухой массы пробы будет получено приблизительно

900 см

водной вытяжки, учитывая это, следует рассчитать

общее необходимое минимальное количество отбираемой

порции с учетом процедуры сокращения пробы. Масса

пробы на стадии перед приготовлением водной вытяжки

должна быть достаточной для получения необходимого

объема экстракта для проведения биотестирования во всех

предполагаемых разведениях. Проба осадков, отходов в

воздушно-сухом состоянии взвешивается так, чтобы абсо-

лютно-сухая масса была 100 ± 1 г. Записывается масса и

содержание влаги и помещается в сосуд для выщелачива-

ния

Шламы. Шламы с большим содержанием твердой фа-

зы, не разделяющиеся самостоятельно, обрабатываются

также как твердые отходы. Отдельно определяется содер-

жание влаги. Масса шлама, эквивалентная 100 ± 1 г абсо-

лютно-сухой массы используется для приготовления вод-

ной вытяжки.

Шламы с большим содержанием жидкости (влаж-

ность более 70 %) обрабатываются следующим образом.

Жидкость фильтруется через вакуумный фильтр (0,45 мкм)

и собирается 300 г влажно-твердого материала. Если тако-

го количества пробы недостаточно для получения 200 г аб-

солютно-сухого вещества, собирается столько, сколько не-

обходимо. Пробы высушиваются до воздушно-сухого со-

стояния по п. «Приготовление водной вытяжки из почв».

При плохом высушивании экспозицию допускается увели-

чить до 24 ч.

Проба делится на две части, в одной определяется со-

держание влаги, а другая часть, составляющая 100 ± 1 г аб-

солютно-сухой массы, переносится в сосуд для выщелачи-

вания. В тетради регистрируется масса остатка и содержа-

ние влаги в нем. Твердые шламы выщелачиваются культи-

вационной водой в пропорции 1:10.

Жидкие отходы. Отходы и осадки сточных вод, жид-

кие и содержащие менее 1 % взвешенного материала не

подвергаются выщелачиванию, а испытываются прямо на

экотоксичность методами биотестирования после фильтра-

ции через фильтр "белая лента".

Выполнение процедуры подготовки экстракта выще-

лачивания. В сосуд для выщелачивания, где находится

взвешенная воздушно-сухая масса отхода или осадка сточ-

ных вод с абсолютно-сухой массой 100 ± 1 г, добавляется

вода, используемая для культивирования (или дистиллиро-

ванная вода). Вода добавляется в сосуд для выщелачивания

в соотношении сухая масса: жидкость — 1 : 10. Обычно

это 1000 см

воды на 100 г абсолютно-сухой массы. Если

используется меньшее количество пробы, уменьшается ко-

личество жидкости. Нельзя использовать для выщелачива-

ния менее чем 20 г твердого вещества и 200 см

воды.

Объемы воды более 10 см

измеряются мерным ци-

линдром, объемы меньше 10 см

— мерной пипеткой.

Смесь должна перемешиваться слабо на мешалке в

течение 7-8 часов таким образом, чтобы твердое вещество

находилось во взвешенном состоянии. Недопустимо из-

мельчение частиц отходов или осадков при перемешива-

нии. Используется большая лопасть механической мешал-

ки или магнитная мешалка, а скорость перемешивания

должна быть наименьшей, при которой материал поддер-

живается во взвешенном состоянии (не более 70 об/мин).

После окончания перемешивания раствор с осадком

оставляют на ночь (12-18 ч) для отстаивания. Затем жид-

кость над осадком сифонируется.

Если после отстаивания жидкость становится про-

зрачной, фильтрование не требуется; если же имеется ка-

кой-либо видимый взвешенный материал, то жидкость

должна быть профильтрована. В случае применения

фильтрования это отмечается в тетради. Фильтрация осу-

ществляется через фильтр "белая лента" или на воронке

Бюхнера. Для фильтрации применяется слабый вакуум (не

более 20 мм рт. ст.) с помощью водяного или электриче-

ского насоса такой же мощности. Вакуум должен быть вы-

ключен немедленно после прохождения всей жидкости че-

рез фильтр, во избежание дегазации фильтрата. В исклю-

чительных случаях, при повышенной мутности водной вы-

тяжки из отхода после фильтрации допускается ее отстаи-

вание в холодильнике до 5 суток. Затем жидкость над

осадком сифонируется.

Полученный экстракт выщелачивания исследуют на

токсичность. Процедуру биотестирования необходимо на-

чать не позднее, чем через 6 ч после приготовления вытяж-

ки из осадка, отхода. Если это невозможно, допускается

хранение экстракта в холодильнике не более 48 ч при тем-

пературе 4 °С.

Если осадки сточных вод или отходы были разделены

на жидкую и твердую фракции, результаты исследования

жидкой фракции и экстракта выщелачивания из твердой

фракции должны быть указаны в отчете отдельно. Если

одна из этих частей была признана экотоксичной, экоток-

сичным признается весь отход.

Установление острого токсического действия

Для определения острого токсического действия про-

водится биотестирование исходной исследуемой воды или

водной вытяжки из почв, осадков сточных вод, отходов и

нескольких их разбавлений, приготовленных по п. «Приго-

товление разбавлений исследуемых вод для биотестирова-

ния».

Определение токсичности каждой пробы без разбав-

ления и каждого разбавления проводится в трех парал-

лельных сериях. В качестве контроля используется три па-

раллельные серии с культивационной водой.

Биотестирование проводится в химических стаканах

объемом 150—200 см

, которые заполняются 100 см

ис-

следуемой воды, в них помещают по десять дафний в воз-

расте 6-24 ч Чувствительность дафний к токсикантам зави-

сит от возраста рачков, поэтому в протоколе отмечают воз-

раст используемой молоди.

Дафний отлавливают из культиваторов, которых вы-

ращивается синхронизированная культура. В отдельный

химический стакан отсаживают одновозрастных рачков

после фильтрации их через набор сит, а затем отлавливают

по одному пипеткой (с отпиленным и оплавленным кон-

цом) объемом 2 см

с резиновой грушей помещают рачков

по одному на сачок, через который вода сливается в от-

дельный химически стакан, после чего дафний сачком вно-

сят в стаканы с исследуемой водой.

Посадку рачков начинают с контрольной серии. В ис-

следуемые растворы дафний помещают, начиная с боль-

ших разбавлений (меньших концентраций загрязняющих

веществ) меньшим разбавлениям. После каждой посадки в

исследуемые растворы сачок тщательно промывается в со-

суде объемом 2 дм

с культивационной водой. Для работы

с серией контроль должен быть отдельный сачок.

Дня каждой серии исследуемой воды используется 3

химических стакана. Общее количество стаканов, исполь-

зуемых в опытах, равно утроенной сумме всех разбавлений

плюс 3 для исходной воды и 3 для контроля.

В экспериментах по определению острой токсично-

сти растворы не меняют.

Учет смертности дафний в опыте и контроле прово-

дят через каждый час до конца первого дня опыта, а затем

2 раза в сутки ежедневно до истечения 96 ч.

Неподвижные особи считаются погибшими, если не

начинают двигаться в течение 15 с после легкого покачи-

вания стакана.

Результаты наблюдений заносят в тетрадь.

Если гибель дафний в контроле превышает 10 %, ре-

зультаты не учитывают, и опыт должен быть повторен.

После того, как результаты эксперимента учтены, все

дафнии из стаканов выбрасывают и в каждом стакане про-

водят измерения рН, температуры, содержания растворено-

го кислорода с помощью оксиметра. Содержание раство-

ренного кислорода в конце эксперимента должно быть не

ниже 2 мг/дм

, рН - в диапазоне 7,0-8,2. Все отклонения от

установленых норм, а также данные по каждой серии раз-

бавлений, исходной воды и контролю также заносят в тет-

радь и протокол результатов эксперимента.

Острые токсикологические эксперименты

При определении острой токсичности питьевых,

сточных, поверхностных, грунтовых вод, а также водных

вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов и их раз-

бавлений устанавливают:

среднюю летальную кратность разбавления вод, вод-

ных вытяжек, вызывающую гибель 50 % тест-объектов за

96-часовую экспозицию (ЛКП

50-96

безвредную кратность разбавления вод, водных вытя-

жек, вызывающую гибель не более 10 % тест-объектов за

96-часовую экспозицию (БКР

10-96

Для определения острой токсичности исследуемых

вод, водной вытяжки рассчитывается процент погибших в

тестируемой воде дафний (А, %) по сравнению с контро-

лем:

А = (Х

– Х

) / Х

*100%, (5)

где Х

— количество выживших дафний в контроле;

—количество выживших дафний в тестируемой воде.

При А ≤ 10 % тестируемая вода или водная вытяжка не

оказывает острого токсического действия (безвредная

кратность разбавления). При А ≥ 50 % тестируемая вода,

водная вытяжка оказывает острое токсическое действие

(средняя летальная кратность разбавления).

Лабораторная работа № 3

Определение токсичности культур грибов

Цель работы - определения токсичности грибов

родов Fusarium, Stachybotrys, Dendrodochium, выделяемых

при микологическом исследовании из различных органи-

ческих субстратов (пищевые, кормовые продукты).

Метод основан на подавлении роста чувствитель-

ного тест-организма Candida pseudotropicalis, шт.44 пк,

токсическими метаболитами грибов указанных родов и

позволяет определить степень токсичности гриба в те-

чение суток.

Реактивы, посуда, приборы. Ацетон, хлороформ,

этилацетат, эфир диэтиловый, агар Чапека, сусло-агар

или агар Сабуро, вода дистиллированная стерильная,

чашки Петри, бактериологические пробирки, выпари-

тельные чашки 6 см, воронки химические 4,5 см, пипет-

ки на 1 и 10 мл, микропипетки на 0,1 мл, трубчатое

сверло 8 мм, термостат, холодильник, диски из фильт-

ровальной бумаги 8 мм, суточная культура Candida

pseudotropicalis, шт. 44 пк.

Подготовка тест-культуры. 1. Тест-культуру Can-

dida pseudotropicalis, шт. 44 пк, высевают штрихом на

скошенный сусло-агар или агар Сабуро. Посевы поме-

щают в термостат при 37°С на 1 сут. Выросшую куль-

туру хранят в холодильнике, пересевая не реже 1 раза

в 6 мес.

2. Для приготовления водной взвеси бактериологи-

ческой петлей переносят из пробирки часть биомассы су-

точной тест-культуры в пробирку с 3—5 мл стерильной

воды и тщательно смешивают.

3. Полученную взвесь тест-культуры вносят по 1—

2 мл в чашки с питательной средой, распределяя ее

круговыми движениями по всей поверхности агара, по-

сле чего избыток взвеси отсасывают и оставляют чашки

открытыми до испарения влаги.

Ход определения. I вариант. Определение токсич-

ности культур грибов методом бумажных дисков при-

меняют для исследования чистых культур, выращен-

ных в пробирках.

Культуру исследуемого гриба в бактериологиче-

ской пробирке на агаре Чапека или сусло-агаре заливают

8—10 мл одного из органических растворителей (ацетон,

диэтиловый эфир, этилацетат, смесь хлороформ — ацетон

4 : 1) и оставляют на 1 ч, периодически встряхивая.

Экстракт фильтруют через бумажный фильтр в выпа-

рительную чашку, и растворитель упаривают досуха в

токе воздуха или на водяной бане при температуре 40—

С. Затем в выпарительную чашку вносят 0,1—0,2 мл

ацетона и круговыми движениями обмывают ее по-

верхность.

На диск из фильтровальной бумаги наносят 20

мкл экстракта и оставляют до испарения растворителя.

Затем его накладывают на поверхность питательной

среды и помещают в термостат при 37 °С. Через 18—24 ч

проводят учет результатов и при наличии зон задерж-

ки роста тест-культуры измеряют их диаметр, включая

диаметр диска.

В одну чашку одновременно можно помещать 4—5

дисков с испытуемыми экстрактами культур, а для контро-

ля в центр чашки кладут диск, смоченный используемым

растворителем.

II вариант. Определение токсичности грибов с помо-

щью агаровых блоков используют для установления ток-

сичности колоний грибов, выросших в первичных посевах

кормов.

Агаровые блоки готовят с помощью трубчатого свер-

ла из газона 5-дневных колоний грибов в чашках Петри.

Блоки накладывают мицелием на высохшую поверхность

питательной среды с тест-культурой (см. п. 3.) и дальше

поступают, как и с дисками (см. I вариант).

Для стимуляции токсинообразования грибов рода

Fusarium чашки с выросшими культурами перед исследо-

ванием помещают на 2 дня в холодильник при 4—6°С. В

дальнейшем с ними поступают, как указано выше.

Оценка токсичности. Оценку токсичности грибов

проводят на основании величины зон подавления роста

тест-организма, вокруг дисков или блоков:

Степень токсичности Диаметр зон подавления роста

тест-культуры, мм

Токсичные 16 мм и более

Слаботоксичные 9—15 мм

Нетоксичные отсутствие зоны задержки

Обнаружение токсинообразующих грибов позволяет

установить причину токсичности корма и решить вопрос

об его использовании и обезвреживании в соответствии с

санитарно-микологической оценкой и улучшением качест-

ва кормов.

Лабораторная работа № 4

Определение токсичности почвы

Почва является не только аккумулятором полезных,

но токсичных элементов, которые подавляют процессы са-

моочищение почвы (биологические, физико-химические и

др.), а также потенциально могут влиять на различные зве-

нья трофической цепи.

Цель работы: Исследование почвы на токсичность

микробиологическим методом.

Реактивы, посуда, приборы: культуры микроорга-

низмов (E.Coli, Bas. Subtillis, дрожжи, грамположительные

бактерии). Среды МПА, Эшби. Чашки Петри, шпатели,

целлофан, пробирки, пипетки на 1 и 10 мл, микропипет-

ки на 0,1 мл, трубчатое сверло 8 мм, термостат, холо-

дильник, диски из фильтровальной бумаги 8 мм.

Подбор тест-культур и выбор и приготовление пита-

тельных сред студенты самостоятельно выполняют к на-

чалу лабораторного занятия.

Ход работы. Свежеприготовленную агаровую среду

разливают в стерильные чашки Петри и после застывания

среды покрывают стерильными пленками целлофана, ко-

торые тщательно расправляют на поверхности агара ме-

таллическим шпателем. Целлофан предварительно выре-

зают кружками с диметром, равным диаметру чашки Пет-

ри, смачивают водой и в таком состоянии стерилизуют в

автоклаве. На поверхность целлофана в центр чашки Петри

с агаром накладывают комочек испытуемой почвы диамет-

ром 3 см, также увлажненной водой. Можно расположить

не один, а 4 комочка на равном расстоянии друг от друга,

тогда диаметр будет несколько меньше, около 1 см. После

наложения комочков почвы на целлофан чашки выдержи-

вают в термостате в течение суток. Через сутки целлофан с

почвой снимают с агара, а среду засевают суточной куль-

турой.

При наличии в почве токсичных веществ на газоне

тест-культуры на поверхности агара образуются стериль-

ные зоны. Количественной оценкой фитотоксичности слу-

жит диаметр образующейся стерильной зоны.

Вариант образцов почвы Зона просветления, мм

1 почва + токсикант

Лабораторная работа № 5

Определение фитотоксичности методом проростков

Необходимость определения этого показателя осо-

бенно часто возникает при мониторинге химически загряз-

ненных почв или при оценке возможности использования в

качестве мелиорантов или удобрений различного рода от-

ходов: осадков сточных вод, различного рода компостов,

гидролизного лигнина и необходимости биоремедиации с

использованием бакпрепаратов или биологических удоб-

рений.

Для выяснения относительной фитотоксичности ис-

пользуют метод рулонной культуры, выращивая проростки

тест-растений на рулоне фильтровальной бумаги из семян,

замоченных в растворе с различными концентрациями тя-

желых металлов.

Принцип метода. Метод основан на реакции тест-

культур при внесении в почву удобрений, меллиорантов,

загрязняющих веществ и т.п. Этот метод позволяет выяв-

лять токсичное (ингибирующее действие тех или иных ве-

ществ), и стимулирующее влияние, активизирующее раз-

витие теств-культур. Семена тест-культур высеваются в

вегетационные сосуды или лабораторные стаканы, запол-

ненные почвой с добавками изучаемых веществ, или за-

грязненной или незагрязненной почвой. В ходе опыта фик-

сируют всхожесть, энергию прорастания, длины надземной

и корневой систем, массу сухого вещества надземной и

подземной части.

Выбор тест-культур. Желательно иметь быстро про-

растающие культуры, которые обычно выращиваются в

хозяйствах изучаемого региона. Так, для изучения дерново-

подзолистой почвы используют овес как представитель

злаковых несимбиотрофных растений и горох – представи-

тель бобовых, способных к азотфиксации. Для степных

почв могут быть пшеница, люцерна, бобы, фасоль. Важно,

чтобы были использованы одновременно азатфиксирую-

щие и не фиксирующие азот растения. В качестве культуры

можно использовать скороспелые сорта редиса.

Условия опыта. Опыт проводится на световых стел-

лажах или в вегетационных домиках при поддержании по-

стоянной влажности почвы. Принята влажность, равная

70% от полной влагоемкости (ПВ). С этой целью для изу-

чаемых почв или смесей предварительно определяют пол-

ную влагоемкость стандартным методом, используя одина-

ковую подготовку проб (измельчение, растирание, пере-

мешивание и пр.). Затем в начале опыта почву увлажняют

расчетным объемом воды так, чтобы влажность была 70%

ПВ. В ходе опыта влажность поддерживают постоянной,

для чего сосуды взвешивают после первого улажнения не-

медленно, а затем периодически повторяют взвешивание и

потерю массы за счет эвапотранспирации компенсируют

добавлением в сосуды недостающей воды.

Ход анализа. Возможны три варианта опытов.

В первом варианте к почве добавляют исследуемое

на фитотоксичность вещество. Это могут быть буровой

раствор, мелиорант (фосфогипс и пр.), лигнинный компост,

осадки сточных вод. Добавленные дозы должны превы-

шать в максимальных вариантах намечаемые для внесения

в реальных условиях.

Второй вариант: просто сравниваются две почвы

или более, попарно – незагрязненная и загрязненная.

Третий вариант: загрязненная почва добавляется к

незагрязненной в возрастающих количествах (вплоть до

100%).

Все опыты ставят не менее чем в трехкратной по-

вторности. Смеси (если они используются) тщательно пе-

ремешиваются.

В стеклянные стаканы помещают по 100 г субстрата

(смеси или почвы), субстрат увлажняют до 70% от ПВ (и

такую влажность поддерживают в течение всего опыта) и в

каждый сосуд высевают по 13 семян тест-культуры. На 4-е

сутки стаканы помещают на световой стеллаж с освещени-

ем в течение 14 ч в сутки (с 6 до 20 ч). В этих условиях

тест-культуры выращиваются в течение двух недель.

В процессе опыта ведут наблюдения по следующим

показателям: записывают время появления всходов и их

число на каждые сутки: оценивают общую всхожесть (к

концу опыта); измеряют регулярно длину надземной массы

(высоту растений); по окончании опыта растения осторож-

но отделяют от земли, просушивают, стряхивают остатки

почвы и измеряют окончательную длину надземной части

растений, длину корней; затем высушивают растения на

воздухе и отдельно взвешивают надземные части и корни

(все результаты рассчитывают на сосуд, можно указывать

«всего», можно сделать пересчет на одно растение). Сопос-

тавление этих данных позволяет выявить факт фитоток-

сичности или стимулирующего действия. Следует также

обратить внимание на окраску растений (раннее ожелте-

ние), характер корней, например более короткие, но гус-

тые.

Фитотоксический эффект может быть рассчитан по

разным показателям. Если, например, опирается на массу

растений, то фитотоксический эффект ФЭ (%) рассчиты-

вают по формуле:

ФЭ= (М

- М

) / М

* 100,

где М

– масса контрольного растения (или всех растений

на сосуд);

– масса растения (растений, выращенных на пред-

положительно фитотоксичной среде).

Лабораторная работа № 6

Определение антимикробного действия

лекарственного средства

Лекарственные препараты в большинстве являются

ксенобиотиками, которые влияют на физиологичную мик-

рофлору человека, животных, вызывая дисбактериозы. По-

этому при использовании различных лекарственных

средств необходимо выявлять воздействие на представите-

лей естественной микрофлоры организма.

Ход работы. Во избежание неправильной оценки ре-

зультатов анализа необходимо определить однократно для

каждого наименования лекарственного средства, обладает

ли оно антимикробным действием. Для этого в две пробир-

ки с 10 мл тиогликолевой среды и в две — с 10 мл среды

Сабуро добавляют соответствующее количество исследуе-

мого лекарственного средства и вносят в каждую пробирку

по 0,1 мл микробной взвеси соответствующего тест-

штамма, содержащей 1000 клеток в 1 мл. Посевы в тиогли-

колевой среде инкубируют при температуре от 30 до 35 °С

в течение 48 ч, а на среде Сабуро — при температуре от

20 до 25 °С в течение 72 ч.

Контролем служат пробирки с питательными среда-

ми, в которые вместо данного лекарственного средства

вносят аналогичное количество дистиллированной воды

или соответствующего растворителя.

Для проверки антибактериального действия лекарст-

венных средств используют тест-микроорганизмы: Staphy-

lococcus aureus АТСС 6538 Р, Bacillus subtilis ATCC 6633,

Escherichia coli К.17, а противогрибкового действия — Can-

dida albicans ATCC 885-653.

При отсутствии антимикробного действия лекарст-

венного средства в контрольных и опытных пробирках

(колбах) должен наблюдаться рост перечисленных тест-

микроорганизмов.

При наличии антимикробного действия лекарствен-

ных средств используют соответствующие инактиваторы,

указанные в частных фармакопейных статьях: (например,

пара-аминобензойная кислота для сульфаниламидов, пени-

циллиназа — для пенициллинов и цефалоспоринов и т.д.).

При отсутствии инактиватора препарат разводят, изменяя

соотношение объемов посевного материала и питательной

среды. Первоначально, не изменяя количества посевного

материала, увеличивают объем питательной среды до 250

мл. Если при этом сохраняется антимикробное действие

лекарственного средства, уменьшают объем посевного ма-

териала до 1 мл.

В случае неэффективности разведения лекарственно-

го средства используют метод мембранной фильтрации.

Посев лекарственных средств. Для контроля сте-

рильности лекарственных средств применяют тиогликоле-

вую среду и жидкую среду Сабуро. При этом используют

метод прямого посева на питательные среды или метод

мембранной фильтрации.

Метод прямого посева. Испытуемый препарат, если

необходимо, растворяют в соответствующем растворителе

и высевают в количествах, указанных в таблице 1.

Таблица 1

Количество испытуемого препарата для посева в зависи-

мости от объема содержимого единиц (ампул, флаконов и др.),

составляющих серию

Объем содержимого

одной единицы, мл

Объем лекарственного

средства для посева,

мл

Объем питательной

среды

менее 1

1—4

5—19

20—100

Более 100*

весь объем

2—4

в 10 раз больше объ-

ема образца для по-

сева

*Если объем содержимого единицы превышает 100 мл, предпочтительнее ис-

пользовать метод мембранной фильтрации

При испытании лекарственных средств посевы в ти-

огликолевой среде инкубируют при температуре от 30 до

35 °С, а в среде Сабуро — от 20 до 25 °С. Продолжитель-

ность инкубации посевов в обеих питательных средах со-

ставляет 14 сут.

В случае помутнения питательной среды после внесе-

ния в нее испытуемого препарата следует в интервале от 3

до 7 сут после посева сделать пересев на свежие аналогич-

ные среды и инкубировать их при соответствующей темпе-

ратуре 14 сут от начала испытания.

При испытании мазей и растворов лекарственных

средств в маслах отбирают асептически по 0,1 г (мл) от ка-

ждой единицы и вносят в стерильную колбу вместимостью

250 мл, содержащую стеклянные бусы, 100 мл/мол фос-

фатного буферного раствора (рН 6,8—7,0) и эмульгатор.

Перед проведением испытания содержимое колбы подог-