Наука и образование для целей биобезопасности: Материалы пятой международной конференции. Пущино 2008 г

Подождите немного. Документ загружается.

Материалы пятой международной конференции

Наука и образование для целей биобезопасности

качества воздуха и снижением влияния негативных внутренних и внешних факторов,

влияющих на среду обитания объекта, обеспечения комфортных условий его

жизнедеятельности, снижения факторов риска появления и развития заболеваний,

сохранения здоровья.

Список литературы

1. Прангишвили И.В., Пащенко Ф.Ф., Бусыгин Б.П. Системные законы и

закономерности в электродинамике, природе и обществе. – М.:

Наука, – 2001. – 526 С.

2. Мещеряков А.Ю., Осипов С.Н. Новые технологии управления качеством

воздуха – 2008. – № 2. – С. 20-26.

3. О состоянии и об охране окружающей среды Российской Федерации в 2005

году. Государственный доклад. – М.: АНО «Центр международных проектов». – 2006. –

500 С.

4. О Целевой среднесрочной экологической программе города Москвы на 2006-

2008 годы // Постановление Правительства Москвы от 28 марта 2006

года № 219-ПП. –

М.: Вестник Мэра и Правительства Москвы. – 2006. – № 25.

Материалы пятой международной конференции

Наука и образование для целей биобезопасности

МЕДИЦИНСКОЕ ОБРАЗОВАНИЕ И

БИОБЕЗОПАСНОСТЬ: МОДА ИЛИ ТРЕБОВАНИЕ

ВРЕМЕНИ

Пальцев М.А., Поклонский Д.Л.,.Павлова Л.А

ГОУ ВПО ММА им. И.М. Сеченова

События последнего времени свидетельствуют о том, что проблема обеспечения

биологической безопасности Российской Федерации в современных условиях не

утрачивает своей актуальности. Проблема эта является многокомпонентной, включает

медицинскую, экономическую, социальную, военную и другие составляющие.

Кардинальное

изменение на рубеже третьего тысячелетия характера

теоретических и прикладных исследований в области биологии и биотехнологии,

появление новых возможностей для медицины и здравоохранения существенно повысило

интерес политического руководства к этой тематике, как в нашей стране, так и за

рубежом.

Важным аспектом обеспечения биологической безопасности представляется

подготовка квалифицированных специалистов в указанной области. Успешная

реализация профильных стандартов образования позволит адекватно реагировать на

биологические угрозы различного характера и способна повысить уровень биологической

безопасности государства в целом.

Таким образом, подготовка специалистов в области биобезопасности

представляет собой актуальную задачу.

Для ее решения представляется необходимым:

1. Обосновать потребность государства в профессионально подготовленных

кадрах в области биологической безопасности (исходя из

комплексного понятия

биобезопасности, включающего санитарно-эпидемиологическую, экологическую,

медицинскую составляющие, борьбу с биотерроризмом и т.д.).

2. Проанализировать современную систему подготовки специалистов в области

биобезопасности, включающую:

- вузовскую подготовку

- систему пуслевузовского образования;

- ведомственные системы переподготовки, аттестации и повышения

квалификации специалистов (реализуемые Минздравсоцразвития, МЧС, Минобороны).

3. Разработать концепцию и соответствующую ей педагогическую систему

по

подготовке специалистов в сфере биобезопасности для федеральных структур

исполнительной власти.

Применительно к задачам подготовки квалифицированных специалистов

приведенное выше понятие биобезопасности можно разделить на следующие

составляющие:

- безопасность лекарственных средств;

- безопасность пищевых продуктов;

- безопасность продукции, процессов ее производства, эксплуатации, хранения,

перевозки, реализации и утилизации;

- экологическая безопасность;

- эпидемическая безопасность;

военная безопасность и противодействие биологическому терроризму.

Материалы пятой международной конференции

Наука и образование для целей биобезопасности

С учетом перечисленных направлений обеспечения Подготовка специалистов в

области биобезопасности, на наш взгляд, наиболее целесообразна на основе отдельных

биологических, ветеринарных, медицинских, фармацевтических, сельскохозяйственных,

технических, химических специальностей (в соответствии с Перечнем паспортов

специальностей ВАК РФ).

Необходимо создание комплексной программы профессиональной

переподготовки указанных специалистов, на основе которой возможна разработка

соответствующего образовательного стандарта.

Говоря

о проблеме образования в сфере биобезопасности, имеет смысл

обратиться к опыту зарубежных государств. Показательны в этом плане США, где

проблемам биологической безопасности и биологической защиты в последние годы

уделяется много внимания.

Другой причиной, обусловившей потребность в специалистах по

биобезопасности, является внедрение и использование генетически модифицированных

организмов.

Важным аспектом является подготовка

специалистов по биобезопасности

международного уровня, способных представлять и отстаивать интересы государства в

международных организациях. По проблемам биологической безопасности профильными

являются Организация промышленного развития ООН (UNIDO), Международный

секретариат Конвенции по биологическому разнообразию (CBD), Секретариат

Конвенции о запрещении биологического оружия.

В заключение считаем необходимым еще раз подчеркнуть, что способность

государства противодействовать угрозам биологического характера во

многом

определяется опытом и квалификацией соответствующих специалистов.

Материалы пятой международной конференции

Наука и образование для целей биобезопасности

РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕСС-МЕТОДА

ОДНОВРЕМЕННОГО ОБНАРУЖЕНИЯ SALMONELLA

SP., LISTERIA MONOCYTOGENES И E.COLI O157 В

ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ

Патрушев М. В., Воронкова Н. В., Верниковская Д. И., Возняк М. В.

ИЛ Тест-Пущино, Пущино, Россия.

В настоящее время остро стоит проблема разработки нового

быстрого и точного метода идентификации и подсчета количества

микроорганизмов в пищевой продукции. Нами предлагается экспресс-метод

обнаружения и подсчета количества бактерии рода Salmonella sp., Listeria

monocytogenes и Esherichia coli O157:H7 с

помощью метода ПЦР в реальном

времени. При разработке этого метода учитываются такие показатели как

эффективность реакции ПЦР, количество и ширина динамических

диапазонов, возможность мультиплексирования реакции ПЦР, также

используется первичное обогащение на неселективной среде. Предлагается

метод относительной количественной оценки содержания микроорганизмов

без построения калибровочной кривой.

Мощные темпы роста пищевой промышленности, централизация

сельскохозяйственного и животноводческого производств, микробная адаптация и другие

причины приводят к значительному увеличению количества пищевых отравлений,

вызываемых патогенными микроорганизмами. Среди этих микроорганизмов наибольшее

распространение и патогенное значение для человека имеют бактерии рода Salmonella

sp., Listeria monocytogenes и E.coli O157:H7 и др. На данный момент времени

лабораторный контроль пищевой продукции осуществляется главным образом методами

классической микробиологии и иммунологическими тест-системами. Главным

недостатком этих методов является длительность проведения анализа, что приводит к

необходимости разработки метода для быстрого и точного способа идентификации и

подсчета количества микроорганизмов в пищевых продуктах. Самым современным

является метод ПЦР-РВ (полимеразная цепная реакция в реальном времени),

позволяющий проводить как качественную, так и

количественную оценку с

возможностью определения нескольких целевых фрагментов ДНК одновременно в одном

образце.

Разработка экспресс-метода

Для создания системы обнаружения и количественной оценки патогенных

микроорганизмов в пищевой продукции методом ПЦР-РВ мы использовали технологию

гидролизуемых нуклеотидных зондов. Подбираемые олигонуклеотиды должны быть

специфичны относительно каждого из представленных микроорганизмов и при их

конструкции необходимо учитывать возможность мультиплексирования. Важнейшими

показателями сбалансированности системы ПЦР являются эффективность реакции,

количество и ширина динамических диапазонов.

Показатель эффективности реакции определяет степень увеличения числа

продукта реакции на каждом следующем цикле и высчитывается по формуле Е=10[-

1/slope]-1*100%, где slope-разница значений Ct (порогового цикла) между двумя

соседними точками при порядковых разведениях матрицы. Эффективность

ПЦР в

Материалы пятой международной конференции

Наука и образование для целей биобезопасности

моноплексном варианте реакции мы рассчитывали по результатам количественной

оценки разведений ДНК музейных культур микроорганизмов Esherichia coli №1330

157:H7; Salmonella arizonae CEM 5606; Listeria monocytogenes ДИКЛС 9.127. Условия

амплификации для всех микроорганизмов были одинаковыми. В случае Listeria

monocytogenes и E.coli эффективность была равна 96%, а в случае Salmonella arizonae -

57%, что можно объяснить конструкцией праймеров, изначально спроектированных для

применения в триплексной реакции, что

в свою очередь приводит к уменьшению

количества оптимальных вариантов (Рис 1).

0,01 0,1 1

= -0,99595

Log концентрации ДНК

Listeria monocytogenes

slope

0,01 0,1 1

Log концентрации ДНК

= -0,99852

Escherichia coli

slope

0,01 0,1 1

Log концентрации ДНК

= -0,99858

Salmonella arizonae

slope

Рис.1 Определение эффективности ПЦР в моноплексной реакции. Значение slope

для L.monocytogenes – 3,4; для E.coli – 3,4; для S.arizonae – 5,1. За 1 принято 20 нг ДНК,

выделенной из суточной культуры соответствующего микроорганизма.

Для определения динамических диапазонов реакций в моноплексном варианте,

были сделаны разведения музейных культур микроорганизмов, начиная с концентрации

КОЕ/мл, оцененной по коэффициенту поглощения с использованием McFarland

Standard. Оптимальными считаются реакции, в которых по наибольшему ряду

концентраций определяется лишь один динамический диапазон. По нашим данным

можно заключить, что с изменением концентрации ДНК динамический диапазон реакции

не меняется и лежит в пределах концентраций от 10

до 10

КОЕ/мл (Рис.2).

Таким образом, эксперименты с определением эффективности ПЦР и

динамического диапазона реакции в моноплексном режиме показали, что праймеры и

зонды, приведенные в Таблице 1, могут быть использованы для обнаружения Salmonella,

Listeria monocytogenes, Escherichia coli.

Таблица 1. Олигонуклеотиды, использованные в работе

Специ

ические Н

клеотидная последовательность 5’-3’

Salmonella sp.

F: CTCACCAGGAGATTACAACATGG

R: AGCTCAGACCAAAAGTGACCATC

Probe: R6G CACCGACGGCGAGACCGACTTT BHQ

Listeria monocytogenes

F: CATGGCACCACCAGCATCT

R: ATCCGCGTGTTTCTTTTTCGA

Probe: ROX CGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCA BHQ

Материалы пятой международной конференции

Наука и образование для целей биобезопасности

sherichia coli O157:H7 F: GACTGCAAAGACGTATGTAGATTCG

R: ATCTATCCCTCTGACATCAACTGC

Probe: FAM

КОЕ/мл

Salmonella arizonae

= -0,99823

= -0,99816

Escherichia coli

КОЕ/мл

15,0

17,5

20,0

22,5

25,0

27,5

30,0

32,5

35,0

37,5

40,0

Listeria monocytogenes

= -0,99825

КОЕ/мл

Рис.2 Динамический диапазон концентраций ДНК.

Минусом метода ПЦР, с точки зрения обнаружения патогенных

микроорганизмов, является его высокая чувствительность, в результате которой

обнаруживается ДНК уже разрушенных микроорганизмов. Чтобы избежать

ложноположительных результатов мы обратились к методам классической

микробиологии, в которой при анализе пищевой продукции всегда используется

первичное обогащение. Нами были проведены исследования

по подбору наиболее

оптимальной среды для обогащения. Оказалось, что после 24 часового обогащения на

ЗПВ (забуференныя пептонная вода) все три вида микроорганизмов проявляли рост

аналогичный или более интенсивный, чем на селективных средах, а также никаких

эффектов ингибирования ПЦР компонентами среды не происходило. Полученные данные

позволяют утверждать, что среда ЗПВ наиболее пригодна

для первичного обогащения

исследуемых микроорганизмов при применении метода ПЦР-РВ.

Одним из главных достоинств метода ПЦР-РВ является возможность

исследования нескольких целевых фрагментов ДНК в одной пробирке. Мультиплексный

вариант ПЦР требует оптимизации реакции, которая, как правило, сводится к расчету

взаимодействия праймеров. Как уже было сказано ранее, мы сконструировали праймеры

таким образом

, чтобы взаимодействия между ними (в мультиплексном варианте) были

минимальны. При оптимизации параметров триплексной реакции варьировались

температура отжига/элонгации и концентрация ионов магния в системе. В сравнении с

моноплексной системой амплификации, эффективность в триплексной системе для L.

monocytogenes и E.coli незначительно снижена и равна 77%. С другой стороны,

оптимизация параметров реакции позволила увеличить

эффективноть ПЦР для

S.arizonae, и более того, сравнять ее с эффективностью для других микроорганизмов.

На рис.3 представлены данные определения эффективности в триплексном

варианте ПЦР, где амплифицировали целевые фрагменты ДНК всех исследуемых в

работе микроорганизмов.

Материалы пятой международной конференции

Наука и образование для целей биобезопасности

1E-3 0,01 0,1 0,5 1

log ДНК, нг

L.monocytogenes (R2=0,9951)

S.arizonae (R2=0,9958)

E.coli (R2=0,9928)

Рис.3 Определение эффективности ПЦР в триплексной системе амплификации.

Значение slope для L.monocytogenes – 4,0; для E.coli – 4,0; для S.arizonae – 4,0.

Главной задачей следующего этапа исследований было разработать точный метод

расчета прироста микроорганизмов с использованием данных, полученных метом ПЦР в

реальном времени. Оперируя показателями относительного уровня прироста и

эффективности реакции, можно проводить относительную количественную оценку

содержания микроорганизмов без построения

калибровочной кривой. Мы разработали

метод расчета прироста КОЕ после обогащения, который выражается формулой: R= (Ct

)/slope, где: R- log прироста КОЕ/мл, Ct

– пороговый цикл амплификации целевого

фрагмента ДНК, выделенной из среды инкубации до обогащения; Сt

– пороговый цикл

амплификации целевого фрагмента ДНК, выделенной из среды инкубации после

обогащения.

Нами было обнаружено, что прирост КОЕ при суточном обогащении

L.monocytogenes и S.arizonae практически одинаковый, и в количественном выражении

равен 1500 и 1200 кратному увеличению числа КОЕ, соответственно. Что же касается E.

coli, то здесь мы наблюдали намного более значительную динамику прироста,

которая в

количественном выражении равна увеличению числа КОЕ более чем 500000 раз.

Получаемые при этом нами количественные показатели прироста полностью

соответствуют данным, полученным методами классической микробиологии.

Выводы

Применение методов ПЦР в практическом, рутинном определении патогенных

микроорганизмов началось относительно недавно. Однако описываемые методы

обнаружения микроорганизмов проводятся без их количественной оценки, а также без

внимания на тот факт, что ДНК разрушенных микроорганизмов может служить причиной

ложноположительного результата. И хотя количественная оценка не является строго

необходимой при выявлении таких микроорганизмов как Salmonella, Listeria

monocytogenes, Escherichia coli, однако именно она позволяет избежать

ложноположительных результатов.

Данный метод был разработан для применения в лабораториях, контролирующих

безопасность пищевых продуктов, что не исключает

возможность его использования и в

научных целях для расчета прироста КОЕ в жидких средах других микроорганизмов

Материалы пятой международной конференции

Наука и образование для целей биобезопасности

СРАВНЕНИЕ ИНФЕКЦИОННОСТИ АЭРОЗОЛЯ

РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ А

(H5N1) ДЛЯ МЫШЕЙ И ЦЫПЛЯТ

Пьянков О.В

, Сафатов A.С.

, Киселев С.А.

, Пьянкова О.Г.

, Сергеев Ар.А.

Демина О.К.

, Сергеев Ал.А.

, Сергеев А.Н.

, Дроздов И.Г.

, Аграновский И.Е.

ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор", Кольцово, Новосибирская область, Россия;

Университет Гриффитса, 4111, Брисбан, Квинслэнд, Австралия

В настоящее время в разных мира выявлены много различных

штаммов вируса гриппа птиц А субтипа Н5N1. Известно, что эти штаммы

различаются по своей инфекционности для птиц и мышей при неаэрозольном

способе их инфицирования. Данных по инфекционности различных штаммов

вируса гриппа птиц А субтипа Н5N1 при

аэрозольном пути инфицирования в

литературе нет. Настоящая работа посвящена сравнению инфекционности

аэрозоля некоторых штаммов вируса гриппа птиц, выделенных на

территории стран СНГ в 2005 – 2006 гг. Показано, что исследованные

штаммы различаются по своей вирулентности для цыплят и мышей – от

невирулентных при аэрозольном способе инфицирования до

высоковирулентных штаммов.

Вспышка эпидемии птичьего гриппа А

субтипа H5N1 нанесла огромный

экономический ущерб в странах Азии и Европы. Было уничтожено свыше 150 миллионов

инфицированных птиц. По данным ВОЗ на начало 2008 г. этот подтип вируса гриппа стал

причиной гибели более 240 человек. Однако, несмотря на то, что вирусы гриппа

относятся к респираторным вирусам, в литературе данные об аэрозольном пути передачи

инфекции, вызываемой

гриппом А субтипа H5N1, отсутствуют. Более того, в литераторе

есть сведения, что для данного субтипа вируса гриппа аэрозольный путь передачи

инфекции не является основным. Собственные данные показывают, что аэрозолем вируса

гриппа А/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 (Н5N1) можно инфицировать цыплят, при этом

доза, вызывающая 50% гибель птиц не велика [1].

В настоящее время в разных мира выявлены

много различных штаммов вируса

гриппа птиц А субтипа Н5N1. Известно, что эти штаммы различаются по своей

инфекционности для птиц и мышей [2-4] при неаэрозольном способе их инфицирования.

Данных по инфекционности различных штаммов вируса гриппа птиц А субтипа Н5N1

при аэрозольном пути инфицирования в литературе нет. Сравнению инфекционности

аэрозоля некоторых штаммов, выделенных на

территории стран СНГ в 2005 – 2006 гг.,

посвящена настоящая работа.

Материалы и методы

Вирус. Эксперименты проводились со штаммами вируса гриппа птиц А субтипа

Н5N1, взятыми из коллекции ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор», которые упомянуты в Табл. 1 и 2.

Каждый из этих штаммов нарабатывался либо на культуре клеток MDCK (в этом случае

его концентрация выражалась в

количестве 50% тканевых цитопатических доз в мл

(ТЦПД

/мл) вируссодержащей суспензии, либо по методу инфекционных центров

(ACFU

/мл), либо на развивающихся куриных эмбрионах (в этом случае его

концентрация выражалась в количестве 50% эмбион-инфицирующих доз в мл (ЭИД

/мл)

вируссодержащей суспензии. Детали упомянутых выше методик описаны в [5].

Материалы пятой международной конференции

Наука и образование для целей биобезопасности

Птицы. В экспериментах использовались куры весом от 200 до 1000 г,

свободные от патогенной микрофлоры (возбудители болезни Ньюкасла, инфекционного

бронхита, болезни Гамборо и др.) за счет проведенной их вакцинации и постоянного

микробиологического контроля в ГППЗ «Новосибирский». После инфицирования птицы

помещались в инфекционный виварий в индивидуальные клетки, где за ними

осуществлялся уход и

наблюдение.

Мыши. В эксперимент брались беспородные белые мыши весом 14,7 ± 0,79 г. Их

минутный дыхательный объем, рассчитанный согласно данным работы [6] составлял 15,7

мл/мин.

Аэрозольные эксперименты. Все аэрозольные эксперименты проводились в

динамической аэрозольной камере, общая схема которой представлена на рис 1.

Рис. 1. Динамическая аэрозольная камера для экспонирования птиц. Пояснения в

тексте.

При аэрозольном инфицировании кур или мышей эксперимент проводился

следующим образом. Аэрозоль вируса создавался с помощью небулайзера [7], рис. 1.

После смешения с потоком чистого воздуха, аэрозоль подавался в камеру с

подсаженными птицами (4 – 6 голов) или мышами (до 10 голов), где они

экспонировались необходимое время

при одновременном отборе проб в пробоотборные

устройства для контроля получаемой ими дозы вируса. В работе использовались два типа

пробоотборных устройств: импинджеры, описанные в работе [8], и персональные

пробоотборники, описанные в работах [9,10]. В качестве сорбирующей жидкости также

использована среда, с которой осуществлялись работы в вышеописанных публикациях.

Протекание инфекционного процесса у не погибших

мышей фиксировалось на

последний день наблюдения (12 сутки), как и подтверждение их специфической гибели,

путем постановки реакции гемагглютинации раститрованных на РКЭ гомогенатов легких

индивидуальных животных и птиц.

Материалы пятой международной конференции

Наука и образование для целей биобезопасности

100

Результаты и обсуждение

На первом этапе работ была оценена летальная аэрогенная доза для птиц

вышеперечисленных штаммов вируса гриппа А субтипа H5N1. Данные экспериментов

для наиболее вирулентных по отношению к курам штаммов этих вирусов суммированы в

Таблице 1. Обнаружено, что исследованные штаммы вируса гриппа птиц А субтипа

H5N1 значительно различаются по инфекционности при аэрозольном

инфицировании

птиц. В частности, наиболее вирулентным оказался штамм A/Chicken/Dagestan/2006,

далее следуют A/Duck/Kurgan/08/2005, A/Chicken/Omsk/2006 и А/Chicken/Suzdalka/Nov-

11/2005.

Таблица 1. Экспериментальные данные по определению вирулентности для

цыплят различных штаммов вируса гриппа птиц А субтипа Н5N1.

Количество кур

Штамм

вируса

№

про

бы

Аэрогенная

доза группы

кур, Dа

(УЕ/голову)

Погибл

Инфици

-ровано

Отношение числа

погибших к

количеству в

группе, %

50%

аэрогенная

летальная доза

(АЛД

), D

×/:

1 3,97

-01

0 4 0

2 3,00

+00

0 4 0

3 2,04

+01

3 5 60

4 2,02

+02

6 6 100

А/Chicken/

Suzdalka/

Nov-

11/2005

5 2,95

+03

6 6 100

18,2 ×/: 2,52

1 6,57

-01

0 4 0

2 4,99

+00

1 4 25

3 1,22

+02

4 4 100

A/Chicken/

Omsk/06

4 7,21

+02

4 4 100

12,8 ×/: 3,10

1 6,57

-02

0 4 0

2 6,57

-01

1 4 25

3 2,63

+00

2 4 50

A/Chicken/

Dagestan/06

4 2,76

+01

4 4 100

2,11 ×/: 3,42

1 3,28

-01

0 4 0

2 3,28

+00

1 4 25

3 4,17

+01

4 4 100

A/Duck/Kur

gan

/08/2005

4 4,47

+02

4 4 100

6,4 ×/: 2,85

Таблица 2. Данные по определению инфицирующих и летальных доз для мышей

различных штаммов вируса гриппа птиц А субтипа Н5N1.

Биологическая активность исходной

вируссодержащей суспензии

Штамм вируса гриппа

птиц

субтипа H5N1

lgЭИД

/м

M ± S

lgТЦПД

мл

M ± S

lg(ACFU)/

мл

АИД

мыши

(lg

ЭИД

/мл)

M ± S

АЛД

мыши

(lg

ЭИД

/мл)

M ± S

A/Turkey/Suzdalka/

Nov-1/2005

8,1±0,21 5,7±0,4 7,47 1,9±0,63 Авирулентн

ый.

A/Chicken/Suzdalka/No

v-11/2005

8,2±0,29 6,7±0,4 8,26 4,31±0,61 4,91±0,49

A/Chicken/Kurgan/

05/2005

8,5±0,0 7,7±0,6 8,98 2,25±0,13 2,17±0,0